2023年7月27日发(作者：)

８号和２０号染色体拷贝数改变辅助食管癌外周血循环肿瘤细胞鉴定任传利１，何平１，张金强１，乔媛媛２，王伟２，周兰萍１，文峰２，赵平３，赵晓航１．２（１．中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京１０００２１；２．海军总医院。北京１０００３７；３．中国医学科学院肿瘤医院．北京ｉｏ００２１）摘要：［目的］建立基于细胞学鉴定食管鳞癌（ＥＳＣＣ）外周血循环肿瘤细胞（ＣＴＣＳ）的技术。［方法］通过偶联ＣＤ４５抗体的免疫磁珠去除白细胞，富集食管癌外周血稀有细胞的“负性富集”策略，结合抗ＣＫ８／１８／１９免疫荧光染色（ＩＦ＂）和８／２０号染色体荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）鉴定Ｃ‘ＦＣｓ，，ｆ结果’食管癌外周血ＣＫ８／１８／１９＋／ＣＤ４５一的ＣＴＣｓ检ｊ１５牢为４３．８％（７／１６），其中８０％伴有８１２０号染色体非整倍体的改变（ＡＣ）二食管癌细胞ＷＨＣ０ｌ、ＥＣＯｌ５６和ＫＹＳＥｌ５０的８号ＡＣ分别为７７＿３％、７８．６％和７５％：ＫＹＳＥｌ５０的２０号ＡＣ为７７．９％，外周血一螳胞浆胞膜不完整、具有异型性的细胞核伴有８／２０号ＡＣ改变。ｆ结论！食管癌８／２０号ＡＣ可以作为判断食管癌外周血ＣＴＣｓ恶性表型的标准，结合ＣＫ８／１８１１９＋／ＣＤ４５标准，不但可以鉴定具有完整细胞结构的ＣＴＣＳ．还可以鉴定胞浆、胞膜小完整或裸核样的ＣＴＣｓ的恶性表型。关键词：食管鳞癌：循环肿瘤细胞：荧光原位杂交中图分类号：Ｒ７３－３；Ｒ７３５．１文献标识码：Ａ文章编号：１００４—０２４２（２００８１０６—０５１３．０５ＡｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ａｎｄ２０ＣｏｐｙＮｕｍｂｅｒＣｈａｎｇｅｓｔｏＡｓｓｉｓｔＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌｓｉｎＰｅｒｉｐｈ．ｅｒａｌＢｌｏｏｄｏｆＥｓｏｐｈａｇｅａｌＣａｒｃｉｎｏｍａＲＥＮＣｈｕａｎ—ｌｉ，ＨＥＲｎ昏ＺＨＡＮＧｊｔｎ—ｑｉａｎｇ，ｅｔａ１．（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔ００’ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅＨｏｓｐｉ融ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｗｄＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃ０１Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２１，Ｃｈｉｒｍ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｐｕｒｐｏｓｅ］Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｃｙｔｏｌｏｇｙ．ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ（ＣＴＣｓ）ｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｈｘ，ｄｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｎａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｆＥＳＣＣ）．ＩＭｅｔｈｏｄｓ］Ｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣＤ４５ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｐｌｅｔｅｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓａｎｄｅｎｒｉｃｈｒａｒｅｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌ（Ｍ）ｄｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．ｗｈｉｃｈｗａｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣＴＣｓ．ＡｎｄｔｈｅｎｔｈｅＣＴＣｓｗｅｒｅｊｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇ（ＩｎｏｆＣＫ８／１８／１９ａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｆＦＩＳＨ）ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ａｎｄ２０．ＩＲｅｓｕｌｔｓＣＴＣｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ（１ＣＫ８／１８／１９＋／ＣＤ４５。ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｊｎ４３．８％（７／１６）ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓ，８０％ｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｆｏｕｎ（１ａｎｅｕｐｌｏｉｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｆＡＣｌｏｎｃｈｒｏ．ｍｏｓｏｍｅ８ａｎｄ２０．ＳｏｍｅｈｕｍａｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｅｅｌｌＪｉｎｅｓ．ｓｕｃｈａｓＷＨＣＯ１．ＥＣ０１５６ａｎｄＫＹＳＥｌ５０，ｗｅｒｅａｌｓｏｆｏｕｎｄｗｉｔｈａｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆＡＣｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８。７７．３％．７８．６％ａｎｄ７５．０％．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．７７．９％‘）ｆＡＣｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２０ｉｎＫＹＳＥｌ５０ｃｅｌｌｓ．Ｓｏｍｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｃｅｌｌｓｗｉｔｈａｆｒａｇｍｅｎｔｅｄｐｌａｓｍａａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅ．ｏｒｎｕｄｅｎｕｃｌｅｉｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕＩｌｙｉ－ｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＣＴＣｓｂｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ａｎｄ２０ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｃｈａｎｇｅｓ．『Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ］１１１ｅＡＣｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ａｎｄ２０ｃａｎｂｅａｓａｃｒｉｔｅｒｉａｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＣＴＣｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｈ】Ｉ）ｔＪ【】ｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａＪｃａｒ．ｃｉｎｏｍａ．ＩｎｔｅｇｒａｔｅｂｏｔｈｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａｏｆＣＫ８／１８／１９７ＣＤ４５一ｂｙＩＦａｎ｛ｌ８／２０ａｎｅｕｐｌｏｉｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｂｙＦＩＳＨ．ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｐｅｒｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄＣＴＣｓｎｏｔｏｎｌｙｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｉｎｔａｅｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｂｕｔａｌｓｏｔｈｅｏＩｌｅｗｉｔｈｆｒａｇｍｅｎｔｅｄｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｒｎｕｄｅｎｕｃｌｅｕｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｎｃｅｒ；ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ收稿日期：２００８—０４—１４；修回日期：２００８一０５—２６基金项目：国家自然科学基金（３０７７２５０７、３０７２１００１）：“９７３”（２００４ＣＢ５１８７０７Ｊ；“８６３”（２００６ＡＡ０２２１９Ｂ、２００６ＡＡ０２Ａ４０３、２００６ＡＡ０２２３４１）；博士学科点专项基金（２００６００２３０ｌＯ）通讯作者：赵晓航中国肿瘤２００８年第１７卷第６期万　方数据５１３食管癌预后不良，５年生存率仅１５％，术后２年生存率仅为２０％～３０％，复发转移是食管癌死亡的主要原因之一ｆＩＩ。研究表明，实体瘤患者外周血存在循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ），其数目和动态变化与肿瘤的复发转移密切相关。利用免疫磁珠分离技术．已经从包括乳腺癌、前列腺癌等实体瘤患者外周血富集和分离到ＣＴＣｓ１２．３１。有关食管癌ＣＴＣｓ的相关研究．目前主要通过ＲＴ—ＰＣＲ检测外周血上皮标记基因产物的方法判断是否存在ＣＴＣｓｌ４１．尚无运用细胞学“金标准”筛选与鉴定食管癌患者外周血ＣＴＣｓ的研究报道。肿瘤患者外周血中出现上皮来源细胞通常为恶性细胞１５】．研究表明外周血ＣＴＣｓ具有多种形态蚓。同时我们发现．免疫磁珠负性富集后的血液稀有细胞中存在一些体积较大的裸核细胞．通过常规细胞表面标志的免疫荧光染色（ｉｍｍｕｎｏｎｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎ．ｉｎｇ，ＩＦ）仍然难以判断其良恶性，需要结合细胞遗传学技术，如荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙ—ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ。ＦＩＳＨ）进一步加以区分和鉴定。本研究应用基于负性富集策略（ＣＫ８／１８／１９阳性／ＣＤ４５阴性）的免疫荧光染色技术富集和鉴定了１６份食管癌外周血的ＣＴＣｓ．对富集后发现的大裸核细胞利用ＦＩＳＨ技术进一步分析了８／２０号染色体拷贝数，通过８／２０号染色体扩增分析迸一步提高了ＣＴＣｓ鉴定准确率。１材料与方法１．１材料食管癌细胞系：人食管癌细胞系ＥＣ０１５６由本实验室建系［７１、ＷＨＣＯＩ为南非开普敦大学Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ博士惠赠｜８ｌ。ＫＹＳＥｌ５０为日本兵库县医学院Ｓｈｉｍａｄａ教授惠赠【９Ｉ。食管癌样本：采集海军总医院胸外科２００６年１１月．２００７年８月１ｌ例接受单纯手术治疗的食管鳞癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＥＳＣＣ）患者静脉血。其中，男性８例，女性３例，年龄范围５７～７６岁，平均年龄６５岁，中位年龄６４岁：术前血１１例，术后血５例，共１６份外周血样本。主要试剂：枸橼酸抗凝血采血管（ＡＣＤ）购自美国ＢＤ公司（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）；抗ＣＤ４５免疫磁珠、抗．ＣＫ８／１８／１９．ＦＩＴＣ抗体、Ｌｓ柱和５１４万　方数据强磁场磁性细胞分离器购自德国美天旎公司（Ｍｉｌ．ｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）：抗ＣＤ４５一Ａｌｅｘａ５９４抗体南奥维腾隆公司（ＡＶＩＶＡＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ。ＳａｎＤｉｅｇｏ。ＣＡ）馈赠；Ｔｒｉｔｏｎ．Ｘ１００购自Ａｍｅｒｓｃｏ公司（ＡｍｅｒｓｅｏＩｎｃ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）；细胞核荧光染料４。６．联脒．２一苯基吲哚（４．６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２．ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，ＤＡＰＩ），ＢＳＡ和胃蛋白酶购自Ｓｉｇｍａ．Ａｌｄｒｉｃｈ公司（Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＩ）；载玻片和盖玻片购自Ｆｉｓｈｅｒ公司（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｒｏｙ。ＭＩ）；ＣＥＰ８、ＣＥＰ２０染色体计数探针购自Ｖｙｓｉｓ公司（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＤｏｗｎｅｒｓＧｒｏｖｅ，ＩＬ）：ＲＮＡ酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；ＤＭＥＭ培养基和灭活胎牛血清购自ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司（ＧｉｂｅｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。１．２方法细胞培养：食管癌细胞ＥＣ０１５６、ＷＨＣ０１和ＫＹＳＥｌ５０细胞培养于含１０％小牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素和１００１－Ｌｇ／ｍｌ链霉素的ＤＭＥＭ培养基中。在５％Ｃ０２的３７ｑＣ孵箱中培养，每３～５天传代一次。ＣＴＣｓ富集实验：从肘正中静脉用ＡＣＤ采血管在知情同意前提下采集清晨空腹外周血７．５ｍ１．室温保存。并于２４ｈ内富集肿瘤细胞。用缓冲液（１３７ｍＭＮａＣＩ，２．７ｍＭＫＣＩ，１０ｍＭＮａ２ＨＰ０４，２ｒａＭＫＨ２Ｐ０４，２ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ和０．５％ＢＳＡ．ｐＨ７．４）将血样本转移至５０ｍｌ离心管并定容至４５ｍｌ。室温翻转孵育８ｍｉｎ；４００ｘｇ室温离心５ｍｉｎ后去除上清．保留少量液体并温和轻柔地用手指将细胞弹起，加人红细胞裂解液（１５５ｍＭＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭＫＨＣＯｈ０．１ｍＭＥＤＴＡ）至４５ｍｌ，裂解并重悬细胞。此步骤重复两次：加入上述缓冲液至４５ｒＩｌｌ，重悬细胞后计数。４００ｘｇ室温离心５ｒａｉｎ，去上清；按每１０・个细胞加入２０“ｌ磁珠比例加入Ｍｉｈｅｎｙｉ磁珠。混匀后于４ｃ｜Ｃ冰箱孵育１５ｒａｉｎ：按每１０７细胞／２ｍｌ缓冲液比例加入缓冲液。重悬并洗涤细胞，４００ｘｇ离心５ｍｉｎ。按１０８细胞／５００１ｘｌ缓冲液比例重悬细胞：同时。把Ｌｓ分离柱放在ＭＡＣＳ分离器上．将细胞悬液加入已润湿的ＬＳ柱中．在磁场作用下收集流出的非ＣＤ４５标记的细胞组分（含ＣＴＣ），用３ｍｌ洗涤液洗涤柱子，共洗涤３次。所收集的细胞经离心滴加于载玻片上，室温至细胞干燥。加入２％多聚甲醛同定４０ｒａｉｎ，ＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣＩ，２．７ｍＭＫＣｌ，ｌＯｍＭＮａ２ＨＰ０４，２ｍＭＫＨ２Ｐ０４，ｐＨ７．４）冲洗、晾干，一２０ｃｃ保存备用。中国肿瘤２００８年第１７卷第６期免疫荧光染色：细胞滴片经ＰＢＳ洗５ｍｉｎ．０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００．ＰＢＳ膜通透５ｍｉｎ．再用ＰＢＳ洗涤３次。以２％ＢＳＡ—ＰＢＳ．室温封闭３０ｍｉｎ．加１：２００稀释的ＣＫ８／１８／１９．ＦＩＣＴ和１－１０００稀释的ＣＤ４５．Ａｌｅｘａ５９４荧光抗体．室温孵育６０ｍｉｎ。０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ洗涤３次，每次３ｍｉｎ。避光、晾干、加６１ｘｌＤＡＰＩ复染、封片。染色体荧光原位杂交：经免疫荧光染色的玻片浸入ＰＢＳ中去除盖玻片。滴加５０ｔｘｌｌＯｍｇ／ｍｌ的ＲＮＡｓｅＡ，置于杂交仪上于３７℃孵育４０ｍｉｎ。玻片以２ｘＳＳＣ溶液（０．３０ＮａＣＩ，０．０３ＭＮａ３Ｃ６Ｈ５０７，ｐＨＭ食管癌细胞ＥＣ０１５６、ＷＨＣ０１和ＫＹＳＥｌ５０滴片经ＣＫ８／Ｉ８／１９．ＦＩＴＣ和ＣＤ４５一Ａｌｅｘａ５９４免疫荧光染色和ＤＡＰＩ复染。结果显示：胞浆ＣＫ８／１８／１９等细胞角蛋白表达阳性；白细胞表面抗原ＣＤ４５表达阴性（图１７．０）洗两次，每次３ｍｉｎ。分别用７５％、８５％、１００％梯度酒精浸泡。每次２ｍｉｎ，室温晾干。滴加１００１Ｍ的５０ｌｘｇ／ｍｌ胃蛋白酶（溶于０．０ｌＭＡ—Ｄ）。经过Ｍｉｔｉｎｅｙｉ磁珠富集后。食管癌患者外周血检出ＣＫ８／１８／１９角蛋白抗原阳性／ＣＤ４５白细胞表面抗原阴性的上皮来源细胞，即ＣＴＣｓ（图ｌＥ—Ｈ），检出率为４３．８％（７／１６），ＣＴＣｓ中位数为３（１．２２３）。同时．可见ＣＫ８／１８／１９阴性／ＣＤ４５阳性的向细胞。２．２食管癌细胞８／２０号染色体拷贝数改变用ＦＩＳＨ方法检测不同食管癌细胞的染色体拷贝数改变。结果发现，８号和２０号染色体的拷贝数异常最为常见（图２）。荧光显微镜下随机计数１００个细胞。发现食管癌ＷＨＣ０１细胞的８号染色体具ＨＣＩ）于玻片上，杂交仪中３７℃孵育ｌＯｍｉｎ。玻片经２ｘＳＳＣ洗５ｒａｉｎ．用ｌ％多聚甲醛固定ｌＯｍｉｎ．再以２ｘＳＳＣ洗５ｍｉｎ，空气晾干。混合７１ｘｌＣＥＰ杂交缓冲液、ｌＩｘｌＤＮＡ探针和２ｔｘｌ去离子水，将含有探针的杂交液于７４℃水浴处理５ｍｉｎ。玻片在７０％甲酰胺／２ｘＳＳＣ中于７４ｃｃ变性９ｍｉｎ。７５％、８５％和１００％梯度酒精浸泡各ｌｍｉｎ。滴加５ｌｘｌ含有探针的杂交液于细胞上．加盖玻片和封片液．置杂交仪中于４２℃避光杂交过夜。去掉盖玻片，玻片经０．４ｘＳＳＣ－０．１％ＮＰ４０．］７３℃清洗２ｒａｉｎ；再以２×ＳＳＣ一０．１％ＮＰ４０．室温清洗ｌＯｓ。避光晾ｆ，加６１Ｍ重复＝三次。ＤＡＰＩ复染、封片。所有实验都各２结果２．１食管癌细胞和外周血ＣＴＣｓ的免疫荧光分析结果中国肿瘤２００８年第１７卷第６期５１５万方数据　墨！至里堡竺堕竺竺！竺！兰竺皇竺斐兰竺竺竺奎！丝１３讨论早在１００多年前就有文献报道在外周血发现ＣＴＣｓｔ＇ｏＩ。随着分子生物学技术和多色荧光标记技术注：ＮＡ为未检测。的发展，在实体瘤外周血中检测ＣＴＣｓ的灵敏度有了很大提高…】。基于基囚水平鉴定ＣＴＣｓ，常用ＲＴ—ＰＣＲ扩增食管癌外周ＩＩＩＬ肿瘤相关标志ＣＥＡ的方法。实验过程中该方法容易受到ＤＮＡ的污染，不能定量肿瘤负荷，不能进一步做功能分析。可能含有来自手术造成的【ｌ『Ｌ液播散肿瘤细胞使外周血ＣＴＣｓ数量增加，这种现象可能与食管癌转移相关１４１。目前．基于细胞学富集和鉴定ＣＴＣｓ的方法主要有密度梯度离心、免疫磁珠富集、膜过滤法及芯片富集法等…Ｉ，其中免疫磁珠分离法比较常用。外周血稀有细胞的免有多种异常改变．包括９．１％缺失和６８．２％扩增等；食管癌ＥＣ０１５６细胞的８号染色体异常包括３．６％缺失和７５．０％扩增：食管癌ＫＹＳＥｌ５０细胞８号染色体异常包括２５．０％缺失和５０％扩增。同时．发现该细胞２０号染色体异常改变，包括２４．４％缺失和５３．５％扩增（表１）。２．３食管癌外周血ＣＴＣｓ的８／２０号染色体拷贝数改变１６份食管癌患者外周血经富集和ＣＫ８／１８／１９阳性／ＣＤ４５阴性的负性筛选确定其中７份含有完整细胞的ＣＴＣｓ。进一步经ＦＩＳＨ检测，发现其中８０％的ＣＴＣｓ同时具有８号和／或２０号染色体的非整倍体改变。尤其是“ＣＫ８／１８／１９阳性／ＣＤ４５阴性”免疫荧光分析只能鉴定那些具有完整胞膜和胞浆结构的ＣＴＣｓ。然而，肿瘤患者外周血中可见许多胞膜不完整或完全缺失．但直径大于１５／ｘｍ的裸核．仅用ＣＫ８／１８／１９＋／ＣＤ４５一免疫荧光分析无法判断是否为恶性来源细胞核。冈此，对其中编号为Ｍ６０４的外周血经免疫荧光分析含有７个ＣＴＣｓ（ＣＫ８／１８／１９＋／ＣＤ４５一）的病例进一步做了８／２０号染色体拷贝数ＦＩＳＨ分析。结果发现除了上述７个ＣＫ８／Ｉ８／１９＋／ＣＤ４５一细胞外，另有１２个直径大于１５１ｘｍ的裸核，共计１９个细胞都具有８／２０号染色体的非整倍体改变（图３）。疫磁珠分离，包括以抗ＥｐＣＡＭ抗体偶联磁珠直接捕获上皮细胞的“正性富集”和以抗白细胞表面标记ＣＤ４５抗体偶联磁珠去除白细胞而富集外周ＩｆｆＬ稀有细胞的“负性富集”两种。通常正性富集可能会受到肿瘤类型和异质性的影响，如肿瘤细胞表面ＥｐＣＡＭ抗原表达缺失或降低旧。但这种方法具有计数优势陋妇Ｉ，负性富集可能避免这种缺陷。基于细胞学“金标准”鉴定ＣＴＣｓ．可以结合形态学和上皮来源肿瘤细胞分子标志分析，具有较好的灵敏度和特异度。目前尚无基于细胞学标准分离鉴定食管癌外周血ＣＴＣｓ的相关报道。本研究通过抗ＣＤ４５抗体偶联磁珠负性富集了食管癌患者外周血稀有细胞，继而通过两个步骤鉴定ＣＴＣｓ。首先，用免疫荧光分析，即抗上皮来源细胞表面标志ＣＫ８／１８／１９阳性和抗白细胞表面抗原ＣＤ４５阴性的标准．从１６份食管癌外周血样本中鉴定出７份含有ＣＴＣｓ细胞，检出率为４３．８％（７／１６），ＣＴＣｓ中位数为３（１—２２３）。第二，用８／２０ｎ．染色体计数探针，通过ＦＩＳＨ方法分析染色体拷贝数改变。从来自ｉ个不同人群的ＥＣ０１５６（中国人）［７１、ＷＨＣ０１（南非人）ｌａｌ和ＫＹＳＥｌ５０（日本人）１９１等食管癌细胞系中均鉴定到８／２０号染色体的高频非整倍体改变，与Ｓｕ等¨４Ｉ使用比较基因组杂交的方法所得结果吻合。同时，ＣＴＣｓ的染色体非整倍体改变也在乳腺癌、肾Ａ、Ｂ‘，圳为编：ｊ为Ｍ６０４柄驯的外Ｊ一‘ＪｍＬ胞憷允靛干¨胞膜、Ｊ地浆小完整（裸核）的ＣＴＣｓ．与８号（绿色）和／或２０号（红色）染色体杂交的结果二篮色芡光信号为经ＤＡＰＩ染色的细胞核。周开；ｉ可见具有二倍体的白细胞．图像放大倍数为ｘ１０００，图中标尺为１０“ｍ。癌、前列腺癌和结肠癌等文体瘤巾得到证实Ｉ”。对编号为Ｍ６０４的病例。外周血经免疫磁珠分离富集和免疫荧光染色后发现多个胞膜不完整。ＣＫ８／１８／１９圈３食管癌外周血Ｃ陀ｓ的８，２０号染色体非整倍体改变阴性．但细胞核体积巨大，具有明显异型性的细胞难中国肿瘤２００８年第１７卷第６期５１６万方数据　以判断是否为ＣＴＣｓ。进一步用ＦＩＳＨ分析了该病例的８／２０号染色体拷贝数。除已经用免疫荧光分析鉴定的７个ＣＴＣｓ（ＣＫ８／１８１１９＋／ＣＤ４５一）外，另有１２个直径大于１５１ｘｍ的裸核也具有８／２０号染色体的非整倍体改变。证实其恶性来源的细胞。该病例共计发现１９个ＣＴＣｓ。但食管癌外周血巾裸核ＣＴＣｓ形成的原因尚不清楚，可能受到外周血剪切等原因导致胞浆的丢失，常规方法难以鉴定这种类型的ＣＴＣｓ。食管癌８／２０号染色体非整倍体改变可以作为判断食管癌患者外周血ＣＴＣｓ恶性表型的标准之一。结合ＣＫ８／１８／１９＋／ＣＤ４５一免疫荧光分析的ＣＴＣｓ判断标准。不但可以鉴定具有完整细胞结构的ＣＴＣｓ．还可以进一步鉴定那些胞浆、胞膜不完整。甚至呈裸核样的ＣＴＣｓ的恶性表型。参考文献：ＪｅｍａｌＡ，ＳｉｅｇｅｌＲ，ＷａｒｄＥ，ｅｔａ１．Ｃａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００６【Ｊ】．ＣＡＣａｎｃｅｒＪＣｌｉｎ。２００６，５６（２）：１０６－１３０．【２】ＣｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉＭ，ＢｕｄｄＧＴ，ＥｌｌｉｓＭＪ。ｅｔａ１．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄｓｕｒｖｉｖａＩｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，２００４，３５１（８）：７８１－７９１．【３】３ＭｏｃｅｌｌｉｎＳ，ＫｅｉｌｈｏｌｚＵ，ＲｏｓｓｉＣＲ，ｅｔａ１．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ’ｌｅｕｋｅｍｉｃｐｈａｓｅ’ｏｆｓｏｌｉｄｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ，２００６，１２（３）：１３０－１３９．【４】ＬｉｕＺｄｉａｎｇＭ，ＺｈａｏＪ。ｅｔａ１．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｐｅ－ｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｃｌｉｎｉｃａｌｕｔｉｌｉｔｙ【Ｊ】．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００７，Ｉ３（１０）：２９９２－２９９７．【５】５ＦｅｈｍＴ，ＳａｇａｌｏｗｓｋｙＡ，ＣｌｉｆｆｏｒｄＥ，ｅｔａ１．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｅｖｉ—ｄｅｎｃｅｔｈａｔｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃａｒ—ｃｉｎｏｍａａｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ【Ｊ１．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００２，８（７）：中国肿瘤２００８年第１７卷第６期万　方数据２０７３－２０８４．【６】ＡｌｌａｒｄＷＪ，ＭａｔｅｒａＪ，ＭｉｌｌｅｒＭＣ，ｅｔａ１．Ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｃｉｒｃｕ—ｌａｔｅｉｎｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆａｌｌｍａｊｏｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓｂｕｔｎｏｔｉｎｈｅａｌｔｈｙｓｕｂｊｅｃＬｓｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔｄｉｓ—ｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００４，１０（２０）：６８９７—６９０４．【７】ＷａｎｇＱ，ＸｕＹ，ＺｈａｏＸ，ｅｔａ１．Ａｆａｃｉｌｅｏｎｅ．ｓｔｅｐｉｎｓｉｔｕｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓｗｉｔｈｐｒｅｓｅｒｖｅｄｐｈｏｔｏｌｕ・ｍｉｕｅｓｃｅｎｃｃｆｏｒｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｆＪ］．ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ，２００７，１２９（２０）：６３８０一６３８１．【８】８ＷａｎｇＢ，ＨｅｎｄｒｉｃｋｓＤＴ，ＷａｍｕｎｙｏｋｏｌｉＦ，ｅｔａ１．Ａｇｒｏｗｔｈ・ｒｅｌａｔｅｄｏｎｃｏｇｅｎｅ／ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２ａｕｔｏｅｒｉｎｅｌｏｏｐｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｕｃｅｒ［Ｊ】．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００６，６６（６）：３０７１－３０７７．【９】ＯｋｕｍｕｒａＴ，ＴｓｕｎｏｄａＳ，ＭｏｉｌＹ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙｐ７５ｎｅｕｒｏｔｍｐｈｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００６，１２（１７）：５０９６—５１０３．【１０］ＡｓｈｗｏｒｔｈＡ．ＡｃａｓｅｏｆｃａｎｃｅｒｉｎｗｈｉｃｈｃｅｌｌｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｔｕｒｎｏｕｔｓｗｅｒｅｓｅｅｎｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄａｆｔｅｒｄｅａｔｈＩＪ］．ＡｕｓｔＭｅｄＪ，１８６９。１４：１４６．【１１】ＮａｇｒａｔｈＳ，ＳｅｑｕｉｓｔＬＶ，ＭａｈｅｓｗａｒａｎＳ，ｅｔａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｒａｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌｓｉｎｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓｂｙｍｉ－ｃｒｏｃｈｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ【Ｊ１．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１７３）：１２３５一１２３９．【１２１ＲａｏＣＧ，ＣｈｉａｎｅｓｅＤ，ＤｏｙｌｅＧＶ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｐ－ｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｂｌｏｏｄａｎｄｐｒｉｍａｒｙａｎｄｍｅｔａｓｔａｔｉｃｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｎ－ｃｏｌ，２００５，２７（１）：４９－５７．【１３】ＤａｗｏｏｄＳ，ＣｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉＭ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌａｓｓａｙｓｉｎｔｏｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣｕｒｒＴｒｅａｔＯｐｔｉｏｎｓＯｎｃ０１．２００７．８（１）：８９—９５．【１４】ＳｕＭ，ＣｈｉｎＳＦ，ＬｉＸＹ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙ—ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ［Ｊ］．ＤｉｓＥｓｏｐｈａｇｕｓ，２００６，ｌ９（１）：１０－１４．５１７