2023年7月27日发(作者：)

虹鳟PPARα基因克隆、序列分析及其组织表达分布

贾成霞;张照斌;张清靖;刘盼;朱华

【摘 要】克隆了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)αmRNA全序列.对其序列分析发现,虹鳟PPARα与其他脊椎动物PPARα有较高的同源性,其中mRNA序列有66.4％～97.5％相同,氨基酸序列有69.2％～98.9％相同.DNA结合结构域和配体结合结构域从鱼类到人类高度保守,其中DNA结合结构域有88.0％～98.8％的氨基酸序列相同;配体结合结构域有74.6％～99.6％的氨基酸序列相同.系统发生树分析表明,虹鳟的PPARα基因与同属鲑科鱼类的大西洋鲑(Salmo salar)属于同一分支.实时定量RT-PCR方法分析虹鳟不同组织中的表达发现,PPARα基因在脂肪、肌肉、卵巢、肾脏和肠中表达量较高.%Peroxisome proliferator-activated

receptors (PPARs) belong to the nuclear receptor superfamily, which

regulates the biosynthesis and metabolism of lipids, and the differentiation

and formation of lipocytes. PPARa mRNA from the rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss) was cloned by RT-PCR. Sequence homology

analysis showed that rainbow trout PPARa gene was similar to those

reported in other vertebrate species. The mRNA sequence and the

deduced amino acid sequence of rainbow trout PPARa showed identities

of 66.4%-97.5% and 72.5%-93.8%, respectively, with those of other

vertebrates. The DNA-binding domain and the ligand-binding domain of

PPARa have been highly conserved in the evolution from fish to humans,

which show 88.0%-98.8% and 74.6%-99.6% amino acid sequence identities,

respectively, with those of other vertebrates. Phylogenetic analysis indicated that PPARa of rainbow trout and Atlantic salmon (Salmo salar)

belong to the same branch of the phylogenetic tree. Using quantitative

real-time RT-PCR, we observed that rainbow trout mRNA was expressed

predominantly in lipid, muscle, ovarian, renal, and intestinal tissues.

【期刊名称】《中国水产科学》

【年(卷),期】2012(019)004

【总页数】8页(P707-714)

【关键词】PPARα;虹鳟;基因克隆;序列分析;组织分布

【作 者】贾成霞;张照斌;张清靖;刘盼;朱华

【作者单位】北京市水产科学研究所,北京100068;北京大学城市与环境学院,北京100871;北京市水产科学研究所,北京100068;北京市水产科学研究所,北京100068;北京市水产科学研究所,北京100068

【正文语种】中 文

【中图分类】S96

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,

PPAR)是一类在脂肪合成代谢､脂肪细胞分化和脂肪堆积等过程中起着重要信号转导和调控作用的核受体超家族成员[1−6], 包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ 3种亚型[7]。大量研究证明, PPARα在调节过氧化物酶体增殖、能量代谢、脂肪细胞分化等过程中发挥着重要的作用, 近年来受到极大的关注[8−15]。PPARα可调节与脂肪酸氧化相关酶的基因, 被相应配体激活后可增强脂肪酸的 β氧化, 促进细胞对脂肪酸的摄取、活化和代谢, 在调节高密度脂蛋白代谢方面也具有重要作用, 可以影响三磷酸腺苷结合盒转运体Al、载脂蛋白AI等基因的表达, 而这些基因在胆固醇逆转运过程中对胆固醇的外流起着非常重要的作用, 可以减少脂肪在组织中的沉积[2−4]。研究指出, 鱼体脂肪含量和脂肪酸的组成是衡量鱼肉品质的重要标准之一[16−17], 而鱼体沉积的大量脂肪组织影响着养殖鱼类鱼肉品质的提高。这些脂肪组织不仅影响养殖鱼类的肉质、口感及营养价值, 而且对提高养殖效率、降低养殖成本也有很多的不利影响[18−20]。虹鳟(Oncorhynchus mykiss)由于生长速度快, 食用价值高, 受到许多国家消费者的青睐。但是, 随着虹鳟养殖面积的扩大,

其脂肪堆积问题日益突出, 严重影响了虹鳟的鱼肉品质。为此, 本研究参考其他物种PPARα基因序列设计兼并引物, 克隆了虹鳟 PPARα序列, 并与其他物种进行了同源性比较和系统发生进化树分析, 研究了虹鳟不同组织中 PPARα的表达分布,旨为进一步研究PPARα调控脂肪及脂肪酸的合成代谢奠定基础。

1.1 材料

实验动物: 虹鳟采自北京市顺通虹鳟养殖场,鱼体质量约为1.5 kg。

试剂: M-MLV反转录酶、dNTP混合液(10 mmol/L)和 Oligo(dT)15购自

Promega公司(美国); EX Taq PCR试剂盒、3’RACE试剂盒、5’RACE试剂盒、无RNA酶活性的DNAase I和RNA酶抑制剂购自大连宝生物公司(大连); 引物在上海生工合成; AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit购自 Axygen公司(杭州, 中国); Trizol试剂购自Invitrogen公司(美国); 氯仿、异丙醇和无水乙醇购自北京化工厂; Agarose购自 Biowest公司(法国); EB替代染料购自AndyBio公司(美国);

DEPC购自Solon Ind公司(美国); Marker 2购自广州东盛生物(广州, 中国)。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

虹鳟在实验室暂养 1 周后, 冰上解剖取心脏、鳃、肝、脾、脑、眼、肠、胃、腹部肌肉、背部肌肉、头部肌肉、肾、卵巢、精巢、皮肤和脂肪等组织或器官各取 50

mg, 用冰冷的0.1%(v/v)DEPC水快速清洗后, 迅速转移至预先加入1 mL Trizol试剂的玻璃匀浆器中匀浆, 然后按照Trizol使用说明提取总RNA。为了防止基因组DNA的污染, 对总RNA 进行DNAase I处理。DNase I 处理步骤: 在200 μL薄壁离心管中加入20 U DNA酶I、40 U RNA酶抑制剂、10 μg总RNA、1 ×

DNase I buffer和DEPC水至50 μL; 15℃温浴2 h; 80℃加热灭活10 min。DNase I 处理后经过两步酚/氯仿抽提, 异丙醇沉淀, 最后溶解于DEPC处理水中。分光光度计测量总RNA的A260/ A280比值, 所得总RNA紫外光吸收A260/A280大于1.8, 0.8%甲醛变性凝胶电泳证实 RNA无降解。cDNA的合成按照M-MLV反转录酶说明进行。取2 µg总RNA、2 μL dNTP混合液(10

mmol/L)、0.5 μg Oligo(dT)15和DEPC水至PCR管中混匀, 70℃预变性10

min后取出迅速置于冰中, 然后加入15 U M-MLV反转录酶、20 U RNA酶抑制剂和转录酶缓冲液, 37℃反应40 min合成cDNA, 最后70℃预变性 10 min灭活反转录酶活性。所得cDNA −20℃保存备用。

1.3 基因克隆和序列分析

根据NCBI (/) 上已经发布的 PPARα 基因序列, 通过序列比对获得PPARα 基因保守区域, 利用Primer Premier 5.0软件设计兼并引物, PPARα正义引物序列为5′GTGGGCATGT CSCACAAYGC3′; 反义引物序列为5′CAGCAGATRATRGC RGCCAC 3′。PCR反应扩增目标基因: 95 ℃ 1 min; 35个循环(95℃15 s, 58℃ 60 s); 72℃ 6 min。纯化PCR 产物测序获得670 bp

PPARα片段序列。然后通过3’RACE和 5’RACE获得 PPARα全序列, 方法分别按照3’RACE试剂盒和 5’RACE试剂盒说明进行。采用 Clustal X软件将获得的虹鳟 PPARα序列和NCBI公布的氨基酸和 mRNA序列进行比对; BioEdit

7.0.1软件Identity Matrix计算序列相同比例。基于氨基酸序列比对文件, 在PAUP 4.0中采用邻接法(neighbor joining method)分析系统发生关系, 构建系统发生树。 1.4 实时荧光定量PCR分析

定量PCR 引物采用Primer Express 2.0 软件设计, 引物跨越内含子以减少基因组

DNA 的影响。引物序列为: 正义5′GGCTGAGGTCCGCATC TTC 3′, 反义5′GCAGAGTCACCTGGTCGTTCA 3′。纯化的含有虹鳟PPARα目标片段的pMD18-T质粒作为定量 PCR标准品, 10倍梯度稀释获得10−2～10−8copies/µL 浓度梯度, 用于制备标准曲线。PCR反应体系为25 μL, 包括SYBR®Green PCR Master Mix12.5 μL、0.5 μL正义和反义引物(25 μmol/L)、cDNA/标准品和双蒸馏水, 每个样品设置3个重复。PCR反应程序为50℃, 2 min;

95℃, 10 min; 40个循环: 95℃ 15 s, 60℃ 60 s; 在最后一个循环后做熔解曲线, 确定PCR 反应质量。

1.5 统计分析

采用SPSS 软件(Ver 11.5; Chicago, IL, 美国)的 one-way ANOVA 和 Turkey 多重比较来检验相关数据的差异。当P ＜ 0.05 时认为差异显著。数据和图表以平均值±标准偏差表示。

2.1 PPARα基因克隆和序列分析

结合 GenBank数据库中提交的其他物种PPARα基因序列, 利用保守性较高的序列区域设计兼并引物克隆测序, 得到了虹鳟 PPARα cDNA序列, 将拼接以后的虹鳟PPARα核苷酸序列登录GenBank, 登录号为HM536190。分析发现, 虹鳟PPARα蛋白编码区有1 395个碱基(含终止密码子),对应464个氨基酸(图1)。将虹鳟PPARα氨基酸序列与其他物种PPARα氨基酸序列比对发现, 在从鱼类到人类的进化过程中, PPARα序列较为保守, 重要功能区域, 如DNA结合结构域(DBD)和配体结合结构域(LBD)变化不大, 特别是DNA结合结构域只有几个氨基酸发生变化, 数量一致(图2)。表1总结了虹鳟PPARα与其他物种mRNA、氨基酸序列(包括全序列、DBD和LBD)同源性数据。结果表明, 虹鳟PPARα与同属鲑科鱼类的大西洋鲑(Salmo salar)有较高的同源性, 其中 mRNA序列有 66.4%～97.5%相同,

氨基酸序列有 69.2%～98.9%相同, DBD有88.0%～98.8%的氨基酸序列相同,

LBD有74.6%～99.6%的氨基酸序列相同。

2.2 系统发生进化树分析

从 PPARα基因系统发生树的拓扑结构来看(图3), PPARα的分子进化关系与目前已知的相应物种进化关系一致。虹鳟PPARα基因与同科的大西洋鲑(Salmo salar)属于同一分支, 遗传距离最小。其次是鲈鱼(Lateolabrax japonicus)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀(Fugu

rubripes)、日本青鳉(Oryzias latipes)、乌鱼(Chelon labrosus)、海鲡(Rachycentron canadum)、金头鲷(Sparus aurata)等鱼类。与两栖类的非洲爪蟾、人类(Homo sapiens)和鸟类的家鹅、鸡等脊椎动物的遗传距离较远。

2.3 PPARα基因的组织表达分布

如图4所示, PPARα在虹鳟心脏、鳃、肝、腹部肌肉、背部肌肉、头部肌肉、皮肤、脂肪、卵巢、肾、脾、胃、肠、眼、脑和精巢中均有表达。其中, 脂肪组织中表达最高, 显著高于其他组织(P ＜ 0.05); 其次是脂肪含量较高的腹部肌肉, 其表达量显著高于背部肌肉和头部肌肉(P ＜ 0.05);在卵巢､肾脏和肠中表达量也较高; 眼睛、皮肤和头部肌肉中的表达水平较低。

本研究获得了虹鳟PPARα基因的全长cDNA序列和开放阅读框, 分析了该基因在虹鳟不同组织中的表达情况。虹鳟PPARα氨基酸序列不仅与同属鲑科鱼类的大西洋鲑有较高的同源性, 而且与人类等高等脊椎动物也具有较高的相似性。在从鱼类到人类的演化过程中, 重要功能区域DNA结合结构域(DBD)和配体结合结构域(LBD)较为保守, 说明该基因在脊椎动物的生命活动中起到不可替代的重要作用。PPARα基因系统发生树分析也表明, 虹鳟PPARα基因与同科的大西洋鲑遗传距离最小, 其次是花鲈、草鱼等鱼类, 与两栖类、人类和鸟类等脊椎动物的遗传距离相对较远。本研究与以前的一些研究结果相似, 如孟和等[21−22]将家禽与哺乳动物等物种的 PPAR基因进行同源性比较及进化分析表明, 该基因的进化与物种进化相一致, 说明了该基因在进化中的保守性及生理功能的重要性, 与本研究的结果一致。

实时荧光定量对PPARα在各组织中表达情况的研究发现, PPARα mRNA在虹鳟脂肪组织和脂肪含量较高的腹部肌肉、肠等组织以及肾脏等脂肪酸代谢率较高的组织中表达量较高, 这与在其他脊椎动物中的研究结果相似。对哺乳类和鸟类等的研究发现, PPARα主要在脂肪、肾、心脏、肌肉等脂肪酸代谢率高的组织中表达[23−25]。Sundvold等对猪10种组织PPAR的Northern blot检测发现,

PPARα较高表达于肝脏和肾脏, 中等程度表达于心肌、骨骼肌和十二指肠[26]。Diot等和孟和等对鸡9种组织的Northern blot检测发现, PPARα较高表达于肝、心和肾[27−28]。罗锦标对鹅 10种组织中PPARα的研究显示, PPARα较高表达于心、肝、肾、十二指肠和胸肌, 中等程度表达于肌胃、全脑、腿肌, 较低表达于脾和肺[25]。近几年的研究成果发现, 脂肪组织并非被动的、不活跃的组织,而是可以通过内分泌、旁分泌和自分泌的形式在能量调节中起到重要作用。脂肪细胞可分泌大量的活性物质, 目前发现的有近20种。大部分的活性物质通过自(旁)分泌途径调节脂肪细胞的代谢,进入血管后, 可以调节机体各组织的脂肪代谢,以及机体的能量平衡。而在这个过程中, PPAR受体在脂肪合成代谢、脂肪细胞分化和脂肪堆积过程中起着重要的信号介导和调控作用[13−15]。其中PPARα可调节与脂肪酸氧化相关的酶的基因, 被相应配体激活后能够增强脂肪酸的 β-氧化, 促进细胞对脂肪酸的摄取、活化和代谢, 在调节高密度脂蛋白代谢、减少脂肪在组织中的沉积等方面具有重要作用[2−4]。因此上述组织表达分布特点与其功能是密切相关的。长期以来, 脂肪组织一直被认为是被动的、不活跃的组织, 因此国内外大量研究在考虑减少鱼体脂肪含量时主要从饲料组成角度开展工作, 尝试通过降低饲料脂肪含量,

即被动减少养殖鱼类脂肪摄入量来减少鱼体脂肪含量,但是结果并不理想, 不仅鱼肉质量没有提高, 甚至抑制了鱼类的正常生长, 降低了养殖效率[1,20,29−30]。研究发现, 许多脂肪酸、类花生酸类物质、小檗碱、柚皮素、虎杖苷、山奈酚和大豆苷元等天然物质是某种或几种PPAR的天然激动剂,这些天然物质通过反馈作用, 可以影响生物体中的脂肪合成与代谢[6,30−34], 而其中部分物质广泛存在于鱼类饲料中。因此, 通过改变饲料中的天然PPARα结合活性物质的种类和含量, 或在饲料中添加特定天然 PPARα受体结合物质, 可以影响养殖鱼类的脂肪合成与代谢过程, 达到改善养殖鱼类鱼肉品质的目的, 需要进一步深入探索研究。

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