2024年5月19日发(作者：华硕笔记本客服)

遗　传

HEREDITAS

(

Beijing

)

27

(

5

)

:783

～

786,2005

研究报告

发根农杆菌

K599

对大豆、黄瓜和凤仙花活体

感染生根的研究

向太和

,

王利琳

,

庞基良

,

陈　敏

,

许　超

(

杭州师范学院生命科学学院

,

杭州

310036

)

摘　要

:

利用野生型的发根农杆菌

K599

对属于不同科属的大豆、黄瓜和凤仙花进行活体感染实验

,

结果表明

,

发根

农杆菌

K599

可使切割后的大豆、黄瓜和凤仙花子叶形成不定根

,

生根频率分别为

100%

、

65%

和

91%

。此外

,

发根

农杆菌

K599

还可以使未进行创伤切割的黄瓜腋芽处形成不定根

,

生根频率为

10%

。根据发根农杆菌所具有的

rolC

基因序列

,

设计

PCR

引物

,

对再生的毛状根

DNA

进行

PCR

扩增

,

验证了再生的毛状根中含有发根农杆菌

T

2

DNA

序列。文章中获得的转基因根为进一步开展大豆、黄瓜的根结线虫病理以及凤仙花的矮化育种研究提供了

前提材料。

关键词

:

发根农杆菌

;

大豆

;

黄瓜

;

凤仙花

;

活体

;

生根

中图分类号

:Q933

　　　文献标识码

:A

　　　文章编号

:0253-9772

(

2005

)

05-0783-04

HairyRootInducedbyWild

2

typeAgrobacteriumrhizogenes

K599inSoybean,CucumberandGardenBalsaminvivo

XIANGTai

2

He,WANGLi

2

Lin,PANGJi

2

Liang,CHENMin,XUChao

(

SchoolofLifeSciences,HangzhouNormalCollege,Hangzhou310036,China

)

Abstract:

Theplantletsofsoybean,cucumberandgardenbalsamwereinoculatedbywild

2

typeAgrobacteriumrhizo

2

genesK599,quenciesofhairyrootinductionfromwound

cotyledonsofsoybean,cucumberandgardenbalsamwere100%,65%and91%er,hairyroot

wasinducedfromhealthycucumberaxillarybudwithfrequencyof10%.PCRanalysisofhairyrootDNAwasconducted

resultsshowedthatallhairyrootlinescontainedT

2

ablished

systemshouldbeidealforstudyingsoybeanandcucumbernematodeandgardenbalsambreedingofflowerdwarfar

2

chitecture.

Keywords:

Agrobacteriumrhizogenes;soybean;cucumber;gardenbalsam;invivo;hairyrootinduction

　　农杆菌在植物转基因研究中具有重要的应用价

值

,

农杆菌按其对植物的致毒性可以分为根癌农杆

菌和发根农杆菌。有报道指出

:

发根农杆菌转基因

获得的毛状根可以作为研究作物根部寄生的病虫害

病理的良好材料

[1,2]

;

此外

,

由发根农杆菌感染植物

获得的毛状根所再生的后代出现矮化现象

,

因此在

花卉矮化育种中具有特别的意义

[3,4]

。

野生型发根农杆菌

K599

是由澳大利亚学者

收稿日期

:20041210;

修回日期

:20050107

基金项目

:

浙江省自然科学基金项目

(

编号

:Y304083

)

;

浙江省教育厅科研项目

(

编号

:20040069

)

和杭州师范学院科研启动基金项目

(

编号

:87

)

[FundedfromtheNaturalScienceFoundationofZhejiangProvince

(

No.Y304083

)

,theScienceFoundationoftheEducationDepartmentof

ZhejiangProvince

(

No

1

20040069

)

andtheScienceFoundationforthetalentsofHangzhouNormalCollege

(

No

1

87

)

]

)

,

男

,

安徽青阳人

,

副教授

,

博士

,

研究方向

:

植物细胞和基因工程及生物信息学。

Tel:0571

2

28865332;E

2

mail:xthcn@

作者简介

:

向太和

(

1965

—

784

遗　传

HEREDITAS

(

Beijing

)

2005

　　　　　　　　　　　　　　　　

27

卷　

AllenKerr

从土壤中分离而得

,SavkaMA

等

[1]

和

ChoHJ

等

[2]

用

9

个起源于美国的大豆基因型和

1

个起源于我国的野生大豆基因型

(

Peking

)

作为材

料

,

研究发现

K599

能有效地诱导大豆离体子叶生

根

;

并且

,ChoHJ

等还利用获得的毛状根完成了大

豆根线虫的繁殖

;

我们曾报道通过基因重组技术切

除了野生型发根农杆菌

K599T

2

DNA

中的致毒基

因

[5]

。不过

,

发根农杆菌

K599

对我国生产上主栽

的大豆品种以及其他科属植物的感染生根效果尚不

清楚

,

为此本研究选用我国华东地区主栽的大豆品

种交选

2

号和易感染根结线虫的黄瓜以及花卉凤仙

花等不同科属类型的植物作为实验材料

,

研究发根

农杆菌

K599

对它们的活体感染生根情况

,

以便进

一步利用发根农杆菌转基因形成的毛状根开展大

豆、黄瓜根线虫病理的研究和凤仙花矮化育种的研

究。现将结果报道如下。

结果。　　　　　　　　

1

1

4

　农杆菌

K599

质粒

DNA

和植物毛状根

DNA

的提取

农杆菌

K599

质粒

DNA

的提取同前文

[5]

,

参照

XiangTH

等的方法

[6]

提取毛状根

DNA,

即

:

剪取

少量毛状根放入

2mLEppendorf

离心管中

,

加液氮

μ

速冻后用玻璃棒捣碎

,

加

750LDNA

抽提液

(

100

mmol/LTris

2

HCl,20mmol/LEDTA,500mmol/

LNaCl,1

1

5%SDS

)

,60

℃水浴

1h

后加等体积的

氯仿、乙醇、异戊醇混合液

(

体积比为

80

∶

16

∶

4

)

,

室温静置

30min,

期间来回颠倒数次

,4

℃、

11000

r/min

下离心

10min,

取上层液相用等体积的异丙

醇沉淀

,

再用

70%

乙醇在

4

℃、

6000r/min

下离心

5min

清洗

2

次

,

室温干燥后溶于

20

μ

L

无菌

ddH

2

O

贮于

-20

℃备用。

1

1

5

　

PCR

反应

1

　材料和方法

1

1

1

　细菌菌株及培养

实验用菌种为野生型发根农杆菌

K599

。将

-80

℃保藏的菌种在

LB+Str

(

链霉素

)

50mg/L

的

固体培养基上划线

,28

℃过夜培养

,

挑取单菌落在

LB+Str

(

链霉素

)

50mg/L

的液体培养中、

230

～

250r/min

、

28

℃过夜培养

,

生长旺盛的菌液用作感

染实验。

1

1

2

　植物材料品种及培养

根据

FurnerIJ

等

(

1986

)

发表的序列

[7]

,

设计

并合成扩增

rolC

的

PCR

引物。

rolC

引物为

:P1:

5

′

CTCCTGACATCAAACTCGTC3

′

;P2:5

′

TGCTTCGAGTTATGGGTACA3

′。

PCR

扩增参

数如下

:

起始变性

94

℃

5min

后

,

接着进行

35

个循

环

,

每个循环包括

94

℃变性

45s,56

℃退火

45s

和

72

℃延伸反应

90s,

最后在

72

℃延伸

10min

。扩增

产物采用

1

1

2%

琼脂糖凝胶电泳、

120V1h,EtBr

(

溴化乙锭

)

染色

,

用凝胶成像系统

(

Bio/Rad

公司

)

进行拍照记录和分析。

植物品种为大豆品种交选

2

号、黄瓜品种中农

5

号、凤仙花品种白边康乃馨。大豆种子用氯气过

夜灭毒

(

氯气由

100mL5

1

24%NaClO+3

1

5mL

12mol/LHCl

产生

)

、黄瓜和凤仙花种子用稀释

5

倍的市售安替福民

(

次氯酸钠

)

灭菌

20min,

用无菌

的蒸馏水冲洗两次

,

无菌滤纸吸干水分。灭毒后的

种子直接接种于

SA

培养基

(

5%

蔗糖、

0

1

8%

琼脂、

pH5

1

8

)

上

,

在

24

～

26

℃、

14h

光照

/

天条件下发苗

和感染后培养。

1

1

3

　毛状根的诱导

2

　结　果

2

1

1

　毛状根的诱导

K599

侵染大豆、黄瓜和凤仙花后

,

毛状根形成

的形态、时间和频率在不同植物种类及感染部位有

所不同

(

表

1

)

。大豆子叶伤口处被

K599

感染后在

3

天左右即形成黄绿色愈伤组织

,

在

7

～

10d

之间从

将过夜培养生长旺盛的发根农杆菌

K599

用

LB

培养基清洗两次后重悬于

LB

培养基中

,

调光

密度

(

OD

600

)

到

0

1

5

左右。将培养

7d

的小植株

子叶用解剖刀纵横深切数刀

,

滴加农杆菌菌液于伤

口处

,

或者直接滴加农杆菌菌液于培养

14d

的不

进行任何切割的黄瓜叶腋处

,

随后继续培养并观察

愈伤组织处形成肉眼可见的毛状根

(

图

1,1

)

。黄瓜

子叶伤口处被

K599

感染后在

7

天左右形成淡绿色

的愈伤组织

,

在

9

～

12d

之间从愈伤组织处形成肉

眼可见的毛状根

(

图

1,2

)

;

但黄瓜腋芽处被

K599

感

染后未见任何愈伤组织出现

,

而是直接从腋芽处产

生单个的毛状根

,

并且黄瓜腋芽处产生的毛状根与

子叶伤口处的毛状根相比要粗状一些

(

图

1,3

)

。

K599

感染凤仙花切割的子叶在

3d

左右切口处可

见黄绿色愈伤组织

,9

～

12d

左右从愈伤组织处形

　

5

期　　　　　　　　　向太和等

:

发根农杆菌

K599

对大豆、黄瓜和凤仙花活体感染生根的研究

785

成肉眼可见的毛状根

(

图

1,4

)

。而未滴加

K599

菌

液的大豆、黄瓜和凤仙花子叶以及黄瓜的腋芽处均

没有出现生根现象。

表

1

　发根农杆菌

K599

对大豆、黄瓜和凤仙花的感染生根情况

Table1

　

ResultsofhairyrootinductionbyAgrobacteriumrhizogenesK599onsoybean,

cucumberandgardenbalsaminvivo

接菌的子叶或腋芽数

(

个

)

植物材料和接菌部位

Inoculatedsite

ledonor

axillarybudinoculated

withK599

20

20

20

22

肉眼可见毛状根的

时间

(

天

)

Appearancetimeof

hairyrootsobserved

bynaked

2

eye

(

d

)

7

～

10

9

～

12

13

～

15

9

～

12

大豆切割的子叶　

Soybeanwoundcotyledon

黄瓜切割的子叶　

Cucumberwoundcotyledon

黄瓜腋芽　

Cucumberaxillarybud

凤仙花切割的子叶　

Gardenbalsamwoundcotyledon

Frequencyof

ledonor

hairyroot

axillarybudwith

induction

(

%

)

hairyroots

20100

13

2

20

65

10

91

生根的子叶或腋

芽数

(

个

)

生根频率

(

%

)

图

1

　大豆、黄瓜和凤仙花活体被发根农杆菌

K599

感染后生根

1:

大豆子叶生根

;2:

黄瓜子叶生根

;3:

黄瓜腋芽生根

;4:

凤仙花子叶生根。

Fig.1

　

HairyrootinducedbyAgrobacteriumrhizogenesK599onsoybean,cucumberandgardenbalsaminvivo

1:Hairyrootonsoybeancotyledon;2:Hairyrootoncucumbercotyledon;3:Hairyrootoncucumberaxillarybud;

4:Hairyrootongardenbalsamcotyledon.

2

1

2

　毛状根中

rolC

基因的

PCR

扩增检测

利用根据

rolC

基因序列设计的

PCR

引物

,

从

大豆、黄瓜和凤仙花切割的子叶以及黄瓜腋芽处感

染所形成的毛状根

DNA

中均扩增到期望的

770bp

左右的特异性

DNA

片段

,

该片段与从发根农杆菌

K599

的

Ri

质粒

DNA

中扩增出的特异性片段大小

相同

;

而非转化根的

DNA

未扩增出任何

DNA

条带

(

图

2

)

。这表明野生型发根农杆菌

K599

的

RiT

2

DNA

已整合到大豆、黄瓜和凤仙花被感染形成的毛

图

2

　转基因获得的毛状根进行

PCR

扩增的结果

M:

λ

DNA/EcoR

Ⅰ

+Hind

Ⅲ分子量标记

;1

～

4:

大豆子

叶转化根

;5:

大豆普通根

;6

～

9:

黄瓜子叶转化根

;10

～

11:

黄瓜

腋芽转化根

;12:

黄瓜普通根

;13

～

16:

凤仙花子叶转化根

;

17:

凤仙花普通根

;18:

发根农杆菌

K599

质粒

DNA

。

状根基因组中

,

即获得的毛状根为转基因根。

3

　讨　论

SavkaMA

等和

ChoHJ

等先后报道指出野生

型发根农杆菌

K599

在诱导大豆子叶生根方面非常

有效

,

不过他们的研究所使用的大豆材料有

9

个基

因型是起源于美国

,

另一个为我国的野生大豆基因

Fig.2

　

PCRanalysisofhairyrootDNA

M:

λ

DNA/EcoR

Ⅰ

+Hind

Ⅲ

molecularmarker;

1

～

4:Transformedrootofsoybeancotyledon;5:Non

2

transformed

rootofsoybean;6

～

9:Transformedrootofcucumbercotyledon;

10

～

11:Transformedrootofcucumberaxillarybud;

12:Non

2

transformedrootofcucumber;13

～

16:Transformed

rootofgardenbalsamcotyledon;17:Non

2

transformed

rootofgardenbalsam;18:PlasmidDNAofAgrobacterium

rhizogenesK599.

786

遗　传

HEREDITAS

(

Beijing

)

2005

　　　　　　　　　　　　　　　　

27

卷　

[3]

　

MitiouchkinaTY,cationofchrysanthemum

plantandflowerarchitectureby

rolC

genefrom

Agrobacterium

rhizogenes

introduction.

ActaHorticulturae,

2000

,

508

:

163

～

型材料

(

Peking

)

,

并且其操作程序是将切割的子叶

进行离体状态下的培养

[1,2]

。本研究选用我国生产

上主栽的大豆品种以及黄瓜和凤仙花等不同科属类

型的植物

,

直接利用活体状态下的子叶进行了感染

生根

,

无需对子叶进行离体培养

,

因此更加方便快

捷。这为进一步利用转基因根开展大豆、黄瓜的根

结线虫病理以及凤仙花的矮化育种研究提供了前提

基础。此外

,K599

对大豆、黄瓜和凤仙花等不同科

属类型的植物均有侵染性

,

表明

K599

是侵染谱较

广的一种发根农杆菌。值得一提的是

,K599

还能对

黄瓜未经过任何创伤切割的腋芽进行感染形成毛状

根

,

这可能是生长旺盛的腋芽处含有大量的原分生

组织细胞所致

,

因为

SangwanRS

等研究发现原分

生细胞对农杆菌侵染特别敏感

,

并报道利用农杆菌

对拟南芥发芽的种子和萌发的胚直接进行感染获得

了转基因后代

[8]

169

.

[4]

　

CHAIMing

2

Liang,WANGBing

2

tusandpros

2

pectsofgenetictransformationinseveralflowers.

ActaHorti

2

culturaeSinica,

2002,29

(

Suppl.

)

:664

～

670.

柴明良

,

汪炳良

.

若干花卉转基因研究的现状和前景

.

园艺学

报

,2002,29

(

增刊

)

:664

～

670.

[5]

　

XIANGTai

2

He,YANGJian

2

Bo,ingof

wildtype

Agrobacteriumrhyzogenes

K599.

jing

)

,2001,23

(

4

)

:336

～

340.

Hereditas

(

Bei

2

向太和

,

杨剑波

,SomersDA.

野生型发根农杆菌

K599

的解

毒

.

遗传

,2001,23

(

4

)

:336

～

340.

[6]

　

XIANGTai

2

He,YANGJian

2

Bo,LILi,NIDa

2

Hu,YANG

Qian

2

Jin,ZHUQi

2

Sheng,WANGXiu

2

Feng,ZHANGYi,

HUANGDa

2

pmentofRAPDmarkersandSCAR

markerslinkedtobentazonsusceptiblelethalitygeneinrice.

ActaBotanicaSinica,

2003

,

45

(

2

)

:

223

～

228

.

。

[7]

　

FurnerIJ,HuffmanGA,AmasinoRM,GarfinkelDJ,Gor

2

参考文献

(

References

)

:

[1]

　

SavkaMA,RavillionB,NoelGR,ionof

hairyrootsoncultivatedsoybeangenotypesandtheiruseto

propagatethesoybeancystnematode.

Phytopathology,

1990

,

80

(

5

)

:

503

～

508

.

[2]

　

ChoHJ,FarrandSK,NoelGR,

2

effi

2

ciencyinductionofsoybeanhairyrootsandprogagationofthe

soybeancystnematode.

Planta,

2000

,

210

:

195

～

204

.

donMP,

Agrobacterium

transformationin

theevolutionofthegenus

,

1986

,

319

:

422

～

427

.

[8]

　

SangwanRS,BourgeoisY,Sangwan

2

c

transformationof

Arabidopsisthaliana

zygoticembryosand

identificationofcriticalparametersinfluencingtransformation

efficiency.

MolGenGenet,

1991,230

(

3

)

:475

～

485.

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