2024年4月28日发(作者：三星手机中关村)

浙江大学博＋学位论文

第三部分材料与方法

◆微波炉：广东Ｇａｌａｎｚ公司，中国

◆电子天平：ＡＢ３０３一Ｓ型，ＭｏｎｏＢｌｏｃ公司，瑞士

◆．８０度冰箱：Ｔｈｅｒｍｏ

Ｆｉｓｈｅｒ

Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司，美国

◆－２０度冰箱：伊莱克斯公司，意大利

１．１．２主要试剂

◆ＤＮＡ提取盒：ＱＩＡＧＥＮ公司，德国

◆热启动Ｔａｑ

ＤＮＡ聚合酶：（含ｌＯｘｂｕｆｆｅｒ和ｌＯｍＭ

ｄＮＴＰ），ＴａＫａＲａ公司，

日本

◆ＰＣＲｘＥｎｈａｎｃｅｒ

Ｓｙｓｔｅｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，美国

◆引物：上海生工生物工程技术服务有限公司，中国

◆ＰＣＲ纯化试剂盒：ＱＩＡＧＥＮ公司，德国

◆限制性内切酶ＡｆｔＩＩ：（含１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ２和１００ｘＢＳＡ），Ｎｅｗ

ＢｉｏＬａｂｓ公司，美国

◆限制性内切酶Ｍｓｐ

Ｉ：（含１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ２），Ｎｅｗ

美国

◆溴化乙锭（ｅｔｈｉｄｉｕｍ

ｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）：上海生工生物工程技术服务有限公

司，中国

Ｅｎｇｌａｎｄ

Ｅｎｇｌａｎｄ

ＢｉｏＬａｂｓ公司，

◆Ａｇａｒｏｓｅ琼脂糖：上海生工生物工程技术服务有限公司，中国

◆ｐＵＣ

Ｍｉｘ

Ｍａｒｋｅｒ

◆１００ｂｐ

ＤＮＡ

８：上海生工生物工程技术服务有限公司，中国

Ｌａｄｄｅｒ：上海生工生物工程技术服务有限公司，中国

◆５ｘＴＢＥ（自配）：

Ｔｒｉｓ。ｂａｓｅ：５４９

Ｂｏｒｉｃ

ａｃｉｄ：２７．５９

０．５Ｍ

ＥＤＴＡ：３．７２９

溶于１Ｌ：ｄｄＨ２０

３８

浙江大学博士学位论文第三部分材料与方法

１．２研究对象

经医院伦理道德委员会批准许可，并由病人或其亲属签署知情同意书后，将

２４０名重症脓毒症患者和３２３名健康对照个体纳入本研究中。脓毒症的诊断符合

２００１年美国胸科医师协会和美国危重病医学会联合会议所制定的标准［７１。重症脓毒

症定义为至少伴有一个急性脏器功能不全的脓毒症。急性脏器功能不全的诊断标

准为单个系统的序贯性脏器衰竭评分（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ

Ｏｒｇａｎ

Ｆａｉｌｕｒｅ

Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ＳＯＦＡ

评分【８１）≥２分。脓毒症患者的急性生理和慢性健康状况评分（ＡＰＡＣＨＥＩＩ）ｆ９１在

入ＩＣＵ的２４小时内完成。ＳＯＦＡ评分每天测定，最高ＳＯＦＡ评分是指患者在ＩＣＵ期间

所测ＳＯＦＡ评分的最大值，以此表示患者在ＩＣＵ期间发生的最严重的器官功能障碍。

重症脓毒症患者的预后以２８天生存率为准。存在下列情况的患者不被纳入本研究

中：（１）患有获得性免疫缺陷综合征；（２）患者在前８周内接受过化疗；（３）患者在器官

移植术后接受过免疫抑制剂治疗；（４）患者在前４周内使用过糖皮质激素。

标本的采集和处理：抽取外周静脉血１０ｍｌ，以２％乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）

抗凝，．８０℃冻存备用。

１．３方法

１．３．１血样基因组ＤＮＡ的提取

步骤如下：

取２０１．ｄ蛋白酶ｋ加入１．５ｍｌ

Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管中

上

加入２００１ｘｌ全血标本

上

加入２００１．ｔｌ

ＢｕｆｆｅｒＡＬ充分混匀１５ｓ

土

５６℃水浴，１０ｍｉｎ

１Ｌ

３９

浙江大学博士学位论文

第三部分材科与方法

快速离心后加入２００１ｘｌ无水乙醇，充分混匀１５ｓ

上

将１．５ｍｌ离心管中的混合液小心的移入ＱＩＡａｍｐ

Ｍｉｎｉ离心柱中

（已连接好２ｍｌ收集管），８０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ

、Ｌ

将ＱＩＡａｍｐ

Ｍｉｎｉ离心柱放入一新的２ｍｌ收集管中，

加入５００１ｘｌ

Ｂｕｆｆｅｒ

ＡＷｌ，８０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ

’Ｌ

将ＱＩＡａｍｐ

Ｍｉｎｉ离心柱放入一新的２ｍｌ收集管中，

加入５００９ｌ

ＢｕｆｆｅｒＡＷ２，１４０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ

’Ｌ

将ＱＩＡａｍｐ

Ｍｉｎｉ离心柱放入一１．５ｍｌ离心管中，加入２００Ｉ．ｔｌ

ＢｕｆｆｅｒＡＥ，室温（１５．２５。Ｃ）放置ｌｍｉｎ后８０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ。

土

离心后离心管中的清亮液体为基因组ＤＮＡ，经紫外分光光度仪

（ＨＰ８４５３）定量，总ＤＮＡ为４－１２１．ｔｇ，平均６１ｘｇ。－８０４Ｃ冰箱保

存

１．３．２聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增

１．３．２．１

ＳＮＰｓ位点的选取

ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ网站获得Ｏ‘７烟碱乙酰胆碱受体（ｃｘ７ｎＡＣｈＲ）基因序列７

（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＣ０５８８０３），并对该网站提供的伐７

ｎＡＣ雌因启动子区的４个

ＳＮＰｓ（一１８３１、．１５１２、．１３１３和．１９４位点）和以往相关文献【１０１报道过的（．３２４弄Ｆ口．２１３

位点）进行研究。

１．３．２．２

引物设计

６引物设计软件设计ＰＣＲ引物。一１９４、－２１３弄阳－３２４－＋位

Ｐｒｉｍｅｒ

Ｐｒｅｍｉｅｒ和Ｏｌｉｇｏ

点距离较近，而．１３１３和．１５１２两个位点距离较近。

浙江大学博十学位论文第三部分材料与方法

故ＰＣＲ引物设计如下：

（１）．１３１３和．１５１２两个位点ＰＣＲ引物序列

上游引物Ｆ１：５’ＣＴＧ

ＣＴＣ

下游引物Ｒ１：５’ＧＴＡ

ＣＣＣ

目的片段长：３６２ｂｐ

（２）．１８３１位点ＰＣＲ引物序列

上游引物Ｆ３：５’ＣＣＡ

ＡＣＴＴＣＣ

下游引物Ｒ３：

ＡＧＣＡＧＴＣＣＴ

Ａ３’

ＴＧＴＧＡＴＧＴＡＣＧＧＡＣ３’

ＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧ３’

５’ＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＡＧＴＡＧＣＡＧＡ３’

目的片段长：３５５ｂｐ

（３）．１９４、．２１３和．３２４－－个位点ＰＣＲ引物序列

上游引物Ｆ６：５＇ＡＧＣ

下游引物Ｒ６：５’ＣＣＡ

目的片段长：３４２ｂｐ

ＧＧＧＣＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣ３’

ＣＡＧ

ＡＧＧ

ＣＡＣ

ＣＴＣ

ＧＣ

３’

注：引物设计基本遵循以下原则：

◆引物长度为１５～３０，一般为１６—２４ｂｐ，上游引物－９模板序列相同，下

游引物与模板序列互补。

◆Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ随机分布，Ｇ＋Ｃ含量在４５％一５５％左右。

◆引物自身不存在互补序列，不形成自身二级结构或引物自身复性，尤

其３’端不能有互补链存在。

◆通过电脑基因库检索后证明其与非扩增序列的同源性不超过７０％。

◆引物３’端碱基原则上要求与模板ＤＮＡ相配，但最好选用Ｔ、Ｇ、Ｃ，

而不选Ａ。

１．３．２．３

ＰＣＲ反应体系

（１）．１３１３和．１５１２位点ＰＣＲ反应体系：总反应体积为２５１ｘｌ

模板ＤＮＡ

２．０１ｘｌ

４１

浙江大学博士学位论文第三部分材料与方法

ｄｄＨ２０

ｌ

６．３５１ｘｌ

２．５１．ｄ

２．０ｐ，１

１．Ｏ｝ｄ

１．０ｐ，１

Ｏ．１５１，ｔｌ

１０×ＰＣＲ缓冲液

ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）

上游引物Ｆ１（１０ｐｍｏｌ／ｌｘｌ）

下游引物Ｒ１（１０ｐｍｏｌ／ｌ，ｄ）

热启动Ｔａｑ

ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／ｐ，１）

（２）．１８３１位点ＰＣＲ反应体系：总反应体积为２５１，ｄ

模板ＤＮＡ

ｄｄＨ２０

２．０ｂｔｌ

１

６．３５Ｉ＿ｔｌ

２．５１ａｌ

２．０｝．ｔｌ

１．０Ｉ．ｔｌ

１．０ｐ１

０．１５ｐ，ｌ

１０ｘＰＣＲ缓冲液

ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）

上游引物Ｆ３（１０ｐｍｏｌ／Ｉ＿ｔ１）

下游引物Ｉ玛（１０ｐｍｏｌ／ｌｘｌ）

热启动Ｔａｑ

ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／ｂｔｌ）

（３）．１９４、一２１３和．３２４位点ＰＣＲ反应体系：总反应体积为２５１，ｔｌ

模板ＤＮＡ

ｄｄＨ２０

１０ｘＰＣＲＥｎｈａｎｃｅｒＢｕｆｆｅｒ

１０ｘＰＣＲ

Ａｐｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

Ｂｕｆｆｅｒ

２．Ｏｌｘｌ

１１．６肛ｌ

２．５ｐｌ

５．Ｏｐ．１

０．７５Ｉ．ｔｌ

２．０“ｌ

０．５ｐｌ

Ｏ．５肛ｌ

Ｏ．１５Ｉ＿ｔｌ

ＭｇＳ０４（５０

ｍＭ）

ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）

上游引物Ｆ６（１０ｐｍｏｌ／ｌａｌ）

下游引物Ｒ６（１０ｐｍｏｌ／Ｉ．ｄ）

热启动Ｔａｑ

ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／ｐ，Ｉ）

１．３．２．４

ＰＣＲ反应条件

（１）．１３１３和．１５１２两个位点的ＰＣＲ反应条件

４２

浙江大学博士学位论文

第三部分材料与方法

９５。Ｃ预变性１０ｍｉｎ

９５０Ｃ

５６０Ｃ

７２０Ｃ

１０ｓ

１０ｓ

２０ｓ（３４个循环）

１０ｍｉｎ

７２０Ｃ延伸

４０Ｃ保存

（２）．１８３Ｉ位点ＰＣＲ反应条件

９５０Ｃ预变性１０ｍｉｎ

９５０Ｃ

５５０Ｃ

７２０Ｃ

１０ｓ

１０ｓ

２０ｓ（３２个循环）

１０ｍｉｎ

７２０Ｃ延伸

４０Ｃ保存

（３）．１９４、一２１３和．３２４三个位点ＰＣＲ反应条件

９５０Ｃ预变性１０ｍｉｎ

９５０Ｃ

５６０Ｃ

７２０Ｃ

１０ｓ

１０ｓ

１５ｓ（３２个循环）

１０ｍｉｎ

７２０Ｃ延伸

４０Ｃ保存

１．３．２．５

电泳：琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链式反应扩增效果

取ＰＣＲ扩增产物４斗ｌ加上样缓冲液２９ｌ，混匀后在２％琼脂糖凝胶（合０．５｝ｔｇ／ｍｌ

溴化乙锭）上电泳（１００Ｖ，２５分钟），ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ．２０００做为分子量对照，凝

胶成像仪下观察并保存结果（图１．１’１．２、１．３）。

４３

浙江大学博士学位论文第三鄢丹材料与方法

４Ｃ日ｂｐ

３００ｂｐ

图１．１舍．１３１３和．１５１２两个位点的目的片段的ＰＣＲ结果电泳图

４００ｂｐ

３００ｂｐ

固Ｌ２含一１８３１位点的目的片段的ＰＣＲ结果电泳图

４００ｂｐ

３００ｂｐ

３４２ｂｏ

图１．３含－１９４、－２１３和－３２４三个位点的目的片段的ＰＣＲ结果电泳图

１．３．３

ｃｔ７ａＡＣｈＲ基因多态位点的基因型分析

１，３．３．１．１３１３位点和．１５１２位点的基因型分析

．１３１３位点和．１５１２位点的基因型分析采用限制性内切酶片段长度多态性技术

浙江大学博士学位论文第三部分材料与方法

进行舟析。

（１）．１３１３位点基因型分析：

用ＡｆｔＩＩ限制性内切酶对４Ｉｘ［ＰＣＲ产物进行酶切。由于ＰＣＲ反应引入了Ａｎｌｌ

限制性内切酶的酶切位点，Ａｆｔｌｌ酶的识别序列为ＣＴＴＡＡＧ，故Ａｆｔｌｌ酶可将３６２ｂｐ

（ＡＡ）片段酶切为９２ｂｐ和２７０ｂｐ片段。

酶切总体系为２０山：

ＰＣＲ产物４ｌａｌ

１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ

１００ｘＢＳＡ

２

ｕｌ

０．２

ｍ

０１ｉｔｌ

２０

ｕｌ

ＡｆｔＩｒ酶

灭苗双蒸水补至

３７℃水浴１．５ｈ

酶切产物经１．８％琼脂栲凝胶（含０．５ＩｔｅｄｍＬ澳化乙锭）电涑，电压１１０Ｖ，时

问ｏ

５ｈ，在紫外成像仪观测结果，判定基因型（圉１．４）。

｛黜：

图１．４—１３１３位点的酶切结果电泳图。Ｍ为ＤＮＡ标准ｐｕｃＭｉｘ

８，样本１、２、

７为ＧＧ基因型，样本３、５、９、１０、１１为ＧＡ基因型，样本４、６、８、１２为

ＧＡ基因型。

（２）－１５１２位点基因型分析：

用Ｍｓｐ

Ｉ限制性内切酶对４

ｐｌ

ＰＣＲ产物进行酶切。由于ＰＣＲ反应引入了

浙江大学博±学位论文

第三部分材料与方睦

Ｍｓｐ

Ｉ限制性内切酶的酶切位点，Ｍｓｐ

Ｉ酶的识别序列为ＣＣＧＧ

故ＭｓｐＩ酶可将

３６２ｂｐ（ＴＴ）片段酶切为６８ｂｐ和２９４ｂｐ片段。

酶切总体系为２０¨１：

ＰＣＲ产物４

１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ

ｕｌ

２“Ｉ

Ｍ叩Ｉ酶Ｏ．１Ⅲ

２０ｕ１

灭菌双蒸水补至

３７℃水浴２ｈ

酶切产物经１８％琼脂糖凝胶（台０

５Ｉ＿ｔｇ／ｍＬ澳化乙锭）电泳

间０

５ｈ，在紫外成像仪观测结果，判定基因型（图１．５）。

ｒｖｌ

１，

ｏ

电压１１０ｖ，时

‘

￡

Ｆ７Ｒ

ｏ

１ｎ

１１

１０。ｂ０一

一６８ｂ

图１．５－１５１２位点的酶切结果电泳围．Ｍ为ＤＮＡ标准ｐＵＣＭｉｘ

８，样本１

５、６、８为（ｉＴ基因型，样本２为ＧＧ基因型，样本３、４、７、９、１０．１１

１２为ＴＴ基因型．

１．３３

２・１８３１、．１９４、－２１３和－３２４四个位点通过测序分析多态性．

－１８３１、－１９４、・２１３和－３２４、四个位点的基因型经ＰＣＲ扩蜡目的片段后由上海

生工生物工程技术服务有限公司进行直接测序分析，．１８３１测序引物为：５’ＣＣＡ

ＡＣＴＴＣＣＡＣｒＣＡＯＴＣＣＴＡ

ＣＡＣ

ＣＴＣ

ｏｃ

３’，．１９４、－２１３、－３２４、三位点测序引物５’ＣＣＡＣＡ（ｉＡＧＧ

测序结果用Ｐｏｌｙｐｈｒｅｄ

软件

３’．

《ｈｔｌｐ：／／ｄｒｏｏｇ．ｍｂｔｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｏｌｙ＿ｇｅｔ．ｈｔｍｌ）分析，并将其与盯烟碱乙酰胆碱

＊江人学博±学位论ｉ第ｔⅫ分材料与方法

受体基因的标准序列比较君确定样本的基因型（图Ｉ

６）。

㈣

２２０

ＧｉＧ

ｉ

¨”！

ＧＩＧ

…

。

！三．！：。Ｌｌ￡．．

ｚ・Ｔ－：・：。‘；。：：・！１

”，

粼∽

：Ｒｏ；：；：；：：：：？：

１．３．４统计分析

』：：！：上匕Ｌ！二

』

。ｎ１

；：。

，１。

ｊ

Ｉ

．’

图１．６—１８３１（左边列）和一１９４（右边列）的基因型分析

———二ｊ．—Ｊ二。ｉ。．：—ｊ！：ｊ．。！。：、—．．．一

实验数据以均数±标准差（Ｍｅａｎ±ＳＤ）或百分数表示。ＡＰＡＣＨＥｌｌ４，｝－分和最高

ｓＯＦＡ评分的｝匕较采用啦验；两组研究对象间的性别差异用Ｆｉｓｈｅｒ’Ｓ

Ｅｘａｃｔ检验。

［１ａｒｄｙ・Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（Ｈ—Ｗ）平衡采用ｆ检验。各组间基因型频率和等位基因频率的｝匕

鞍采用ｆ桂㈣Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃｔ，＇ｌ盘验。采用ＳＮＰＳｔａｔｓ分析软件按不同的遗传学模型（如

显性遗传、隐性遗传、共显性遗传、乘积性遗传和可加性遗传等）分析所剥遗传

浙江大学博士学位论文

第三部分材料与方法

变异与脓毒症易感性和预后的相关性。同时，将单因素分析中ｐ＜Ｏ．１的与脓毒症发

病可能相关的参数作为共变量，用多因素回归分析法分析相应遗传因素对重症脓

毒症的影响。连锁不平衡和单倍型分析在Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ２．０５程序上进行，单倍型频率

比较采用Ｆｉｓｈｅｒ’ＳＥｘａｃｔ检验。多重比较用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法进行校正。所有统计学分析

采用ＳＰＳＳ

１４．０和ＧｒａｐｈＰａｄ

３．０软件进行分析，ｐ＜Ｏ．０５为有统计学差异。

浙江大学博十学位论文第三部分结果

２结果

２．１研究对象的临床特征

健康对照组包括男２１１例，女１１２例，平均年龄５６．５＋１６．３岁。重症脓毒症组包

括男１５６例，女８４例，平均年龄５８．７＋１７．２岁，２８天生存率为５５．４％。两组间性别与

年龄具有可比性（ｐ＞０．０５）。重症脓毒症患者中，多发・Ｉ剀＇１－伤（２２．９％）最常见，

其次为腹部手术后胃肠道穿孔或肠瘘（２０．８％）、重症胰腺炎（１９．２％）、肝或胆

道感染（１２．０％）及肺炎（１１．２％）。肺（６８．３％），腹部（５７．２％）及血（３５．８％）

是主要感染源。４５．２％重症脓毒症患者采用手术治疗。所有患者普遍使用广谱抗生

素。常用为泰能（亚胺培南加西司他丁），舒普森（舒巴坦加头孢哌酮），万古

霉素（静脉注射盐酸化万古霉素）及特治星（哌拉西林）。３７．５％患者使用抗真菌

剂。脓毒症患者的具体性状见表２．１。

表２．１重症脓毒症患者临床特征

临床特征

年龄（均数４－标准差）

男性（例数，％）

２８天生存（例数，％）

ＡＰＡＣＨＥ

重症脓毒症患者（ｎ＝２４０）

５８．７±１７。２

１５６（６５．０％）

１３３（５５．４％）

１９．９士８．Ｏ

９．７４－４．９

ＩＩ评分（平均值４－标准差）

ＳＯＦＡ评分最高值（平均值４－标准差）

感染源（例数，％）

肺

１６３（６７．９％）

１３９（５７．９％）

３８（１５．８％）

８７（３６．２％）

４６（１９．２％）

１５（６．２％）

９（３．８％）

腹部

有创置管

外周血

伤口

泌尿道

其他部位

感染菌种（例数，％）

Ｇ＋菌

Ｇ－菌

１２１（５０．４％）

１５８（６５．８％）

９０（３７．５％）

３７（１５．４％）

真菌

不明原因感染

４９

浙江大学博士学位论文第三部分结果

２．２仅７烟碱乙酰胆碱受体基因遗传变异与重症脓毒症的关联分析

本研究中，共选取６个位点进行分析（．１８３１Ｇ／Ｔ、．１５１２Ｔ／Ｇ、．１３１３Ａ／Ｇ、．３２４Ａ／Ｇ、

．２１３Ｇ／Ａ和．１９４Ｇ／Ｃ），所有样本都成功进行基因型分析。本研究未发现中国汉族

人口中．３２４Ａ／Ｇ和．２１３Ｇ／Ａ存在单核苷酸多态性现象。重症脓毒症组与对照组０【７烟

碱乙酰胆碱受体基因的４个ＳＮＰｓ都遵循Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅ唱平衡（所有ｐ＞０．０５）。

２．３

０‘７烟碱乙酰胆碱受体基因与重症脓毒症的发生不相关

０【７烟碱乙酰胆碱受体基因．１８３ｌ位点基因型ＧＧ、ＧＴ、ＴＴ在重症脓毒症组的分

别频率分别为６９．１７％、２７．０８％、３．７５％，在对照组分别为６８．４２％、２７．２４％、４．３３％；

．１５１２位点基因型ＴＴ、ＴＧ、ＧＧ在重症脓毒症组的分布频率分别为７７．９２％、１９．１７％、

２．９２％，在对照组分别为７４．６１％、２４．１５％、１．２４％；．１３１３位点基因型ＡＡ、ＡＧ、ＧＧ

在重症脓毒症组的分别频率分别为４０．Ｏ％、４３．３３％、１６．６７％，在对照组分别为

３８．０８％、４３．６５％、１８．２７％；．１９４位点基因型ＧＧ、ＧＣ、ＣＣ在重症脓毒症组的分布

频率分别为８２．９２％、１６．２５％、０．８３％，在对照组分别为８２．９２％、１７．３４％、０．６２％。

两组间所有位点的基因型分布在统计学上无显著性差异（所有ｐ＞０．０５，表２．２）。同

时，各位点的等位基因频率在重症脓毒症组和对照组之间的分布也无显著性差异

（所有ｐ＞０．０５，表２．２）。

０ｃ７烟碱乙酰胆碱受体基因的．１８３１、．１５１２、．１３１３和．１９４四个ＳＮＰｓ的单倍型与

重症脓毒症发生也被评估。经ＳＮＰＳｔａｔｓ软件分析发现，单倍型Ｇ／Ｔ／Ａ／Ｇ、Ｔ／Ｔ／Ｇ／Ｇ、

Ｇ／Ｇ／Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ／Ｇ／Ｃ是两组人群中常见的四种单倍型。这四种单倍型在重症脓毒症

组和对照组之间的分布频率在统计学上无显著性差异（所有ｐ＞０．０５，表２．３）。

２．４

Ｏｒ７烟碱乙酰胆碱受体基因的遗传变异与重症脓毒症的预后不相关

为分析仅７烟碱乙酰胆碱受体基因的遗传变异对重症脓毒症预后的影响，重症

脓毒症患者被分为生存组和死亡组。经Ｚ检验、Ｆｉｓｈｅｒ’Ｓ

ｅｘａｃｔ

ｔｅｓｔ统计分析和

ＳＮＰＳｔａｔｓ软件分析，发现上述ＳＮＰｓ的基因型频率、等位基因频率和单倍型频率在

５０

浙江大学博上学位论文第三部分结果

重症脓毒症生存组和死亡组之间的分布无统计学差异（所有ｐ＞０．０５，表２．２和表２．４）。

表２．２

ｃｘ７

ｎＡＣｈＩ迭因．１８３１、．１５１２、．１３１３和一１９４位点基因型

和等位基因在重症脓毒症组和对照组中的分布

浙江大学博上学位论文第三部分结果

表２．３

ｃｔ７

ｎａＣｈＲ基因．１８３１、．１５１２、．１３１３和．１９４常见单倍型

在对照组和重症脓毒症组中的分布

表２．４

ａ７

ｎＡＣｈｇ；基因．１８３１、．１５１２、．１３１３和．１９４常见单倍型

在重症脓毒症生存组和死亡组中的分布

５２

浙江大学博士学位论文第三部分讨论

３讨论

本研究对２４０名重症脓毒症患者和３２３名健康对照者进行分析，发现中国汉族

人口中仅７烟碱型乙酰胆碱受体基因．３２４和．２１３位点不存在单核苷酸多态性；

．１８３１Ｇ／Ｔ、．１５１２Ｔ／Ｇ、．１３１３Ａ／Ｇ和．１９４Ｇ／Ｃ位点的等位基因和基因型与重症脓毒症

的易感性和预后不相关；上述４个ＳＮＰｓ的常见单倍型Ｇ／Ｔ／Ａ／Ｇ、Ｔ／Ｔ／Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｇ／Ｇ／Ｇ、

Ｇ／Ｔ／Ｇ／Ｃ与重症脓毒症的易感性和预后也不相关。

０ｃ７烟碱型乙酰胆碱受体是由０‘．和ｐ．亚基组成的五聚体，属于配体门控离子通

道蛋白［Ｉｆ－１３］，主要表达于巨噬细胞、内皮细胞、树突状细胞及淋巴细胞等免疫细

胞。胆碱能受体激动剂尼古丁与ａ７．烟碱型乙酰胆碱受体结合后能有效地抑制巨噬

细胞释放促炎介质［１４－１６１。这种作用甚至比副交感神经系统主要的神经递质——乙

酰胆碱（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＡＣｈ）本身更有效［１５，１６］，而且这种抑炎效应是特异的，因为

无论是Ａｃｈ还是尼古丁都不能抑制抗炎介质如转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ

ｆａｃｔｏｒ

ｇｒｏｗｔｈ

ｐ，ＴＧＦ—ｐ）和ＩＬ．１０的产生。进一步的研究表明，应用０【７烟碱乙酰胆碱受体激

动剂ＧＴＳ．２１能抑制促炎症细胞因子的释放，并提高脓毒症小鼠的生存率【１６，１刀；而

缺乏０ｃ７烟碱乙酰胆碱受体则降低迷走神经抑制肿瘤坏死因子释放的功能【”】。

目前胆碱能抗炎通路的确切机制尚未完全明确，但众多研究结果发现，神经

系统的胆碱能抗炎通路与免疫细胞活化密切相关的两种细胞内信号通路——酪氨

酸激酶／活化转录因子Ｊａｋ／ＳＴＡＴ３和核因子ＮＦ．ＫＢ通路有关。Ｒｉｏｕｘ和Ｃａｓｔｏｎｇｕａｙ等

研究【１８】发现，激活的ｔｘ７

ＩＡＣｈＲ能抑制ＩＫＢ的降解和ｐ６５１均核转位，从而解释了胆

碱能激动剂在单核细胞、巨噬细胞以及内皮细胞的抗炎效应。Ｄｅ

Ｊｏｎｇｅ和

Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ等研究［１９，２０］发现，０【７ｎＡＣｈＲ能诱发酪氨酸激酶Ｊａｋ聚集和磷酸化、继而

活化转录因子ＳＴＡＴ３。而且，研究还发现刺激迷走神经能成功抑制小鼠肠道炎症

反应，但对巨噬细胞（ＬｙｓＭ．ＳＴＡＴ３ｆｌ／ｆ１）缺失ＳＴＡＴ３的小鼠却不起作用［１９１，表明

迷走神经的抗炎效应离不开Ｊａｋ／ＳＴＡＴ３信号。但Ｍｕｒｒａｙ等的研究【２１】认为，ＳＴＡＴ３

信号在此抗炎作用中仅起间接作用，它没有直接抑制ＴＮＦ，ＩＬ．６和ｉＮＯＳ等促炎介

质的转录能力，可能原因在于ｎＡＣｈＲ的活化干扰了经Ｊａｋ／ＳＴＡＴ信号的其他信号途

浙江大学博上学位论文第三部分讨论

径和转录因子‘２２’２３１。除了ＮＦ．ＫＢ和Ｊａｋ／ＳＴＡＴ信号途径外，也有研究报道［２０，２４１认为胆

碱能激动剂调控了其他信号通路如细胞外信号调节激酶ＥＲＫ和ｐ４４／ｐ４２

ＭＡＰＫ等。

此外，Ｔａｋａｌｌａｓｈｉ等研究【２５１显示，尼古丁能上调人单核细胞环氧合酶（ＣＯＸ）．２的

表达，诱导ＰＧＥ２的产生，ＰＧＥ２增加了环磷腺苷水平和激活蛋白激酶（ＰＫＡ）。研

究【２５，２６１还显示ＣＯＸ．２和ＰＫＡ抑制剂能阻断尼古丁对黏附分子和促炎因子的抑制作

用，表明尼古丁可能经内源性的ＰＧＥ２产物起抗炎效应。总之，仪７ｎＡＣｈＲ的活化与

免疫细胞的众多信号途径相关，在胆碱能抗炎效应中共同起作用。

本研究发现ｔｘ７烟碱乙酰胆碱受体基因．１８３１Ｇ／Ｔ、．１５１２Ｔ／Ｇ、．１３１３Ａ／Ｇ和

．１９４Ｇ／Ｃ位点的单核苷酸多态性与重症脓毒症易感性及预后之间不相关，可能原因

如下：①由于本研究所选样本量小而引起，因而进一步研究可能需要更大样本量

进行检测。②可能为本研究所选研究对象种族有关。Ｆａｒａｏｎｅ及Ｋａｕｆｍ锄等研究口７，２８】

发现ａ７烟碱型乙酰胆碱受体基因与非洲裔美国人精神分裂症之间存在联系，而与

欧洲裔美国人无关。Ｌｅｏｎａｅｄ等研究发现０ｃ７烟碱乙酰胆碱受体基因启动子区域变异

与白种人精神分裂症相关而与中国汉族人种无联系［２９，３０１。本研究所选研究对象均

为中国汉族人口，对于欧美及非洲人０【７烟碱乙酰胆碱受体基因单核苷酸多态性与

重症脓毒症易感性及预后之间的相关性未进行检测。且本研究发现中国汉族人口

中．３２４Ａ／Ｇ和．２１３Ｇ／Ａ两位点未存在单核苷酸多态性现象。此外，本研究仅选取

．１８３１Ｇ／Ｔ、．１５１２Ｔ／Ｇ、．１３１３Ａ／Ｇ、．３２４Ａ／Ｇ、．２１３Ｇ／Ａ和．１９４Ｇ／Ｃ等六个位点进行分

析，０【７烟碱乙酰胆碱受体基因的其它单核苷酸多态性位点与重症脓毒症易感性及

预后是否存在联系仍未可知。另外，本研究没有检测研究对象的血浆ｔｘ７烟碱乙酰

胆碱受体水平，这是本研究的一项不足，有待进一步研究。

综上所述，本研究未发现中国汉族人种０【７烟碱乙酰胆碱受体．１８３１Ｇ／Ｔ、

．１５１２Ｔ／Ｇ、．１３１３Ａ／Ｇ和一１９４Ｇ／Ｃ位点基因多态性与重症脓毒症易感性及预后之间存

在相关性。进一步研究可能需要选取不同种群或更大样本量进行分析。同时，０【７

烟碱乙酰胆碱受体基因的其它单核苷酸多态性位点与重症脓毒症之间的相关性仍

需进一步分析。

浙江大学博上学位论文

第三部分参考文献

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５７

浙江大学博上学位论文结论

结论

ＭＯＤＳ、ＳＯＦＡ和ＬＯＤＳ评分可反映重症脓毒症患者器官损伤的程度，对其预

后有评估价值，其中ＬＯＤＳ评分的最高值对重症脓毒症预后的预测能力最强。

蛋白Ｃ单倍型．１６４１Ａ／．１６５４Ｃ－与重症脓毒症器官功能障碍密切相关，是重症脓

毒症死亡的独立危险因素。

０ｃ７烟碱乙酰胆碱受体一１８３１Ｇ／Ｔ、。１５１２Ｔ／Ｇ、．１３１３Ａ／Ｇ和一１９４Ｇ／Ｃ位点与重症脓

毒症易感性及预后不相关。

通过上述研究，为ＰＩＲＯ系统提供易感因素（Ｐ）及器官功能障碍等相关资料，

为从事于危重病医学基础与临床研究工作者、医务人员在脓毒症的病理生理、疾

病诊断／预警、防治等方面提供信息。

浙江大学博上学位论文综述

脓毒症的发病机制

——凝血／纤溶系统和神经系统在其发生发展中的作用

浙江大学医学院

王海宏

方向明

外科学（麻醉学）

综述

审校

脓毒症（ｓｅｐｓｉｓ）是指病原微生物入侵机体所致的全身炎症反应综合征（ｓｙｓｔｅｍｉｃ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

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ｏｒｇａｎｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ

ｓｙｎｄｒｏｍｅ，

ｓｈｏｃｋ）和多器官功能障碍综合征（ｍｕｌｔｉｐｌｅ

ＭＯＤＳ）是脓毒症的后续症【１，２１。机体促炎反应和抗炎反应间的不平衡、凝血／纤溶

系统功能紊乱、神经．内分泌．免疫网络调节异常和个体遗传学背景的差异是脓毒症

发生、发展的病理生理学基础。国内外流行病学调查显示，全球每年大约有１８００

万人患严重脓毒症，脓毒症的病死率高于心肌梗死，已成为威胁人类健康的重大

疾病［３４５１。而且脓毒症的发病人数、死亡人数呈现逐年增加的趋势，因此，正确评

估脓毒症患者的病情、有效防治脓毒症的发生发展和努力提高危重病救治成功率

是当前脓毒症学需解决的迫切问题。

１脓毒症分期系统的概念

２００１年美国危重病医学会、欧洲重症监护学会、美国胸科医师协会、美国胸

科学会及外科感染学会在美国华盛顿召开联席会议【２１，共同讨论与重新评价１９９１

年【ｌＩＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ提出的脓毒症及其相关术语的定义和诊断标准等问题，会议还

参照恶性肿瘤病人的ＴＮＭ分期系统提出了提出了脓毒症分期系统（Ｓｔａｇｉｎｇ

ｆｏｒ

Ｓｙｓｔｅｍ

Ｓｅｐｓｉｓ，ＰＩＲＯ）的概念，根据脓毒症病人的易感因素、感染的性质和程度、机体

５９

浙江大学博士学位论文

反应的性质和程度以及并发器官功能障碍的程度对病人进行分期。Ｐ指易感因素

（Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｐ）：对脓毒症的发生、病程、治疗和预后有明丝影响的发病前因

素，特别值得注意的是遗传易感因素；Ｉ代表感染（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉ）：感染本身的特点

对机体反应、治疗和预后有明显影响；Ｒ指反应（Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｒ）：为炎症反应程度包

括前降钙素和白介素．６（ＩＬ．６）的释放等；Ｏ指器官功能障碍（Ｏｒｇａｎ

ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，０）：

器官功能障碍的程度对脓毒症病人的预后有重要影响，器官受累的程度可根据各

种器官衰竭评分系统进行定量评价。会议提出ＰＩＲＯ系统的概念，希望有一些指标

和／或标示物能合理评估乃至量化脓毒症患者病情的轻重，对其临床过程进行分

期，判断预后，指导选择治疗方法。

２脓毒症发病机制

脓毒症是由环境因素和遗传因素共同作用而引起的复杂疾病，发病机制非常

复杂，涉及感染、炎症、免疫、凝血、神经等一系列问题。

２．１促炎／抗炎介质

当病源微生物越过机体屏障结构、入侵机体后，机体首先动员非特异性免疫

或天然免疫（ｉｎｎａｔｅ

ｉｍｍｕｎｉｔｙ），调动免疫分子（经旁路途径或ＭＢＬ途径激活的补

体、防御素、急性期蛋白、细胞因子等）及免疫细胞（单核吞噬细胞系统、中性

粒细胞、树突状细胞、ＮＫ细胞等）消灭病原微生物。天然免疫应答是机体防御感

染性疾病的第一防线，在天然免疫中，机体最重要的就是通过模式识别受体（ｐａａｅｍ

ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ

ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＲＲ）迅速识别大量不同的病原相关的分子模式（ｐａｔｈｏｇｅｎ

ｐａｔｔｅｍ，ＰＡＭＰ）并作出应答【１６１。可以这么说，机体如没有免疫

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

系统的精确调节是不可能生存的。在组织增生、治愈、创伤、感染以及保护机体

避免出血、缺血、肿瘤和脓毒症等过程中，产生的促炎／抗炎介质是介导免疫和

代谢的一个关键的生理过程。肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒ

ｎｅｃｒｏｓｉｓ

ｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）、自介素

．１（Ｉｍｅｒｌｅｕｋｉｎ．１，ＩＬ．１）是主要的促炎因子，白介素．１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ．１０，ＩＬ．１０）是

主要的抗炎因子。适当的促炎／抗炎介质有利于炎症反应、促进局部的凝血从而

浙江大学博士学位论文

综述

限制感染的发展和组织损伤【１７１。炎症介质（促炎性或抗炎性介质）的过度释放，

甚至比原发病更危险，将促发高危的全身性炎症反应或严重的免疫抑制或二者交

替混合出现［１８，１９］。脓毒症患者循环中促炎或／和抗炎介质的血浆水平与其体内的

ｓｔａｓｈ，或ＣＡＲＳ状态、疾病的转归密切相关。目前，关于促炎／抗炎介质在脓毒症

发病机制中作用的阐述已非常多。

２．２凝血／纤溶系统

随着对脓毒症发病机制认识的加深，人们逐渐注意到凝血／纤溶系统紊乱与脓

毒症发生发展相关，这种凝血／纤溶系统紊乱包括促凝血活性增加、抗凝活性减少、

纤溶系统受抑等。脓毒症时炎性介质（缓激肽、组胺等）的刺激会触发凝血级联

反应，导致血小板聚集及黏附增加、纤维蛋白聚集并形成血栓，并且抑制纤维蛋

白溶解导致机体清除循环中血栓能力下降【２０－２２］。同时，凝血级联反应促进炎症进

一步发展，二者相互影响，共同促进脓毒症的恶化。因此机体本身的天然抗凝体

系之一的蛋白Ｃ及其所属的蛋白Ｃ系统越来越受到关注。

蛋白Ｃ及其所属的蛋白Ｃ系统，其活性的发挥主要依赖于活化蛋白Ｃｆ２１＇２３１。

蛋白Ｃ系统的主要成分包括血栓调节蛋白、内皮细胞蛋白Ｃ受体、蛋白Ｃ（ＰＣ）

和蛋白ｓ。蛋白Ｃ是肝脏产生的一种丝氨酸蛋白酶，是维生素Ｋ依赖性糖蛋白，

在正常情况下以无活性形式存在于循环中。当凝血酶与血栓调节蛋白结合成复合

物后，蛋白Ｃ转化为活化蛋白Ｃ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ，ＡＰＣ）。激活的蛋白质Ｃ（ＡＰＣ）

主要有以下作用：（１）在磷脂和Ｃａ２＋存在的情况下可灭活活化的凝血因子ＦＶａ和

ＦＶｌｌＩａ；（２）阻碍凝血因子ＦＸａ和血小板上的磷脂膜结合，从而削弱ＦＸａ对凝血

酶原的激活作用；（３）刺激纤溶酶原激活物的释放，增强纤溶酶活性，从而促进

纤维蛋白溶解。另外，血浆中的蛋白质Ｓ可使激活的蛋白质Ｃ的作用大大增强。

在动物实验中，ＡＰＣ的抗炎作用表现为：（１）抑制组织和循环中的ＴＮＦ生成１２４。２６１，

抑制ＡＰＣ途径可以加剧细胞因子的反应【２７１。（２）ＡＰＣ也通过抑制ＴＮＦ来阻止凝

血酶作用。（３）通过阻断单核细胞和内皮细胞的ＮＦ．ｒｄ３活化，阻止炎症因子的产

生和粘附分子的表达，从而发挥抗炎作用［２８，２９］。（４）阻止在炎症反应中凝血酶受

体的上调，比如那些表达的内皮细胞粘附分子和炎症因子，提高抗凋亡基因的表

６１

浙江大学博士学位论文

达【２９１。由此可见，ＡＰＣ不仅对凝血酶有负反馈调节，而且直接影响炎症相关因子

的产生。不仅如此，有研究发现血栓调节蛋白本身具有抗炎活性，可以下调核因

子（ＮＦ．ｋＢ）和有丝分裂原激活蛋白（ＭＡＰ）激酶的活性，减少细胞因子在内皮

细胞的形成、减少白细胞与内皮细胞的黏州３０１。

脓毒症时，在ＴＮＦ．ｏ‘、ＩＬ．１等炎症介质刺激下，内皮细胞、单核细胞、巨噬细

胞表达组织因子，激活凝血系统，导致微血管血栓形成、循环衰竭、休克甚至多

器宫功能障碍综合征。同时内毒素导致纤溶酶原激活剂抑制因子（ＰＡＩ．１）增加，

抑制纤维蛋白溶解并导致机体清除循环中血栓能力的下降【３¨。而蛋白Ｃ系统可调控

脓毒症中的凝血和炎症反应（图１）。研究发现脓毒症患者的蛋白Ｃ浓度显著降低【翊。

蛋白Ｃ水平的降低导致了蛋白Ｃ活性缺失，从而增强了炎症反应的易损性、凝血反

应的活性和微血管血栓的形成。这些病理生理过程的改变进一步引发器官功能障

碍，并严重影响重症脓毒症的预后。Ｂｒｕｎｋｈｏｒｓｔ等研究证实低蛋白Ｃ水平与重症脓

毒症患者器官功能障碍及死亡有关【３引。Ｆｅｉｓｔｒｉｔｚｅ等研究【３４１证实内毒素和炎症介质

可下调内皮细胞表面血栓调节蛋白表达，血栓调节蛋白也可被中性粒细胞弹性蛋

白酶分解。血栓调节蛋白水平下调进一步诱发循环活化蛋白Ｃ浓度下降，蛋白ｃ系

统功能障碍，从而加剧脓毒症的发生发展。

目前通过在载体的特异性表达和细胞工程，已能生产具有完全活性的重组人

体活化蛋白Ｃ（ｒｈＡＰＣ），药名为ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎａｌｆａ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ），商品名为Ｘｉｇｒｉｓ。

并于２００１年１１月被美国ＦＤＡ批准使用。ｒｈＡＰＣ通过减少凝血酶、恢复正常纤溶

作用和抑制机体过度应激反应，可有效治疗脓毒血症。但在使用中要注意出血的

可能性。有研究通过对全身性感染患者２８天的随访发现【３５１，使用ｒｈＡＰＣ的绝对死

亡率减少６．１％，相对死亡率减少１９．４％。８５０个使用ｒｈＡＰＣ的患者和８４０个使用

安慰剂的患者都给予全身性感染的正规治疗。静脉ｒｈＡＰＣ２０ｕｇ．ｋｇ．１・ｈ—ｌ连续使用４

天（除过度出血特别是要进行有创性操作的外）。严重出血（定义为每天出血超过

３Ｕ连续２天以上或者发生颅内出血）的发生率在ｒｈＡＰＣ组是３．５％，在安慰剂组

是２．Ｏ％。与安慰剂组相比，使用ｒｈＡＰＣ组没有更高的继发感染、过敏反应或者其

他副反应发生率。而且使用ｒｈＡＰＣ患者体内的ＤＤ低，ＩＬ．６的使用剂量也低（ＩＬ．６

６２

浙江大学博±学位论文

是抗凝血因子和抗炎症反应的药物）。

至今为止ＡＰＣ是唯一的可以直接阻止凝血酶生成．增强纤溶和减少炎症因子

表达的天然抗凝血因子．ＡＰＣ；勺脓毒症．ＳＩＲＳ和ＭＯＤＳ等危重病的治疗带来了一

线曙光，但其确切的临床效果和适应症仍在进一步的研究中．

乞

●

围１活蛋白ｃ在腋毒症中的病理生理作用以及它与炎症、凝血／纤溶的关系

ａＰＣ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｃ；ＣＤｌ／ＭＨＣ，ｍａｊｏｒ

ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ；

ＰＡＩ一１＿ｐｌａｓｍｌｎｏｇｅｎ

ａｃｔｉｖａｔｏｒ

ｉｎｌｄｂｉｔｏｒ－１；ＰＣ，ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ；ＰＳ，ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｓ；Ｔｒ，

ｔｈｒｏｍｂｉｎ

ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｖａ，ａｃｔｉｖａｔｅｄｆａｃｌｏｒ

ｖ＝ＶｌＩｌａ，ａｃｔｉｖａｔｅｄｆａｃｔｏｒＶＩＩＩ

图片来自Ｄｅｔｔｅｍｎｅｉｅｒ只ＳｗｉｎｄｅｌｌＢ，ＳｔｒｏｕｄＭ，ｅｔ

ａｌ

Ｒｏｌｅｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｎｌｏｇｙｏｆｓｅｖｅｒｅ

ｓｅｐｓｉｓ．Ａｍ

ＪＣｒｉｔＣａｒｅ，２００３，１２（６）：５１８・２４．

浙江大学博士学位论文综述

２．３神经系统

神经系统对机体免疫的调节作用越来越受到重视，在脓毒症发生发展中居重

要地位。病原微生物侵入机体后后，神经系统将机体炎症信息迅速传递到中枢神

经，从而通过调节内分泌、免疫系统等影响脓毒症的病理过程。除了下丘脑一垂

体一肾上腺（ＨＰＡ）轴及交感神经系统（ＳＮＳ）在神经内分泌调节中居中枢地位，

近年来的研究还发现：神经系统通过迷走神经能够显著、快速地抑制促炎介质如

ＴＮＦ．０ｃ的释放，减轻全身性炎症反应，这一生理机制称作“胆碱能抗炎通路”

（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃａｎｔｉ．ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｐａｔｈｗａｙ，ＣＡＰ）［３６－３８１（图２）。这一抗炎通路表明免

疫系统和神经内分泌系统间存在复杂的调节网络，形成神经免疫调节机制，保护

机体对各种刺激做出适应性防御反应，以维持机体自身内环境的稳定［３７，３８］。这为

脓毒症的防治提供了新思路，利用脓毒症的神经调节机制来探讨其防治策略是一

个较新的研究领域，目前尚处于探索阶段。Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ等研究【３９】动物脓毒症发现，

电刺激迷走神经能降低促炎介质如ＴＮＦ．仅，ＩＬ．６，ＩＬ．１Ｄ和高迁移率族蛋白Ｂ．１

（ＨＭＧＢ．１）水平，减少动物致死率；而切断迷走神经将导致实验动物对炎症刺激

更加敏感【４０１。除了本身的生理意义外，迷走神经可能与多种药物的抗炎效应有关，

如很多非类固醇类抗炎药物、黑皮质素肽（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ

ｐｅｐｔｉｄｅｓ）。

从分子水平来看，迷走神经抗炎效应都基于副交感神经系统主要的神经递质

——乙酰胆碱（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＡＣｈ）的作用。乙酰胆碱作为迷走神经递质，同时也

能与巨噬细胞、内皮细胞、树突状细胞及淋巴细胞［４０，４１１上表达的乙酰胆碱受体结

合。乙酰胆碱受体主要表达在免疫细胞以及衍生于骨髓的细胞（淋巴样和髓样细

胞），分为毒蕈碱（Ｇ蛋白偶联受体）或烟碱（配体门控离子通道）受体。毒蕈碱

受体仅轻微抑制巨噬细胞的活化，而胆碱能受体激动剂尼古丁与烟碱受体结合能

有效地抑制巨噬细胞释放促炎介质，甚至比Ａｃｈ本身更有效【柏１。烟碱乙酰胆碱受体

（ｎＡＣｈＲ）是０ｃ．和Ｄ．亚基组成的五聚体，属于配体门控离子通道蛋白。ｎＡＣｈＲ亚基

０【７，ｐ２和仅４的转录物表达在多种炎症细胞上，包括来自多种组织的巨噬细胞【４１１。目

前多数研究结果支持０【７ｎＡＣｈＲ在调控巨噬细胞活化中起关键作用，也是迷走神经

抗炎效应的关键成分［３８，４０，４２，４３１。激活０【７ｎＡＣｈＲ可以有效减少多种促炎介质的释放，

甜

新Ⅱ大学博ｉ学位论文

对垒身和局部炎症均具有明显的抑制作用，是神经系统与免疫系统相互作用从而

调节全身性炎症反应的一个重要生理机制。应用Ⅱ７烟碱乙酰胆碱受体激动荆

ＧＴＳ－２Ｉ能抑制促炎介质的释放并且提高脓毒症小鼠的生存率ｍ，４５Ｊ，而缺乏ａ７烟碱

乙酰胆碱受体则降低迷走神经抑制肿瘤坏死因子释放的功能…。

圈２病原微生物入机体后的炎症反应和胆碱抗炎通路：病原微生物入侵机体

后，刺激巨噬细胞释放大量炎症介质（如１ＮＦ，ＩＬ—１），但过多的炎症介质释

放导致垒身性炎症反应和脓毒症。图中桔黄色的指控制ＴＮＦ释放的药物。而迷

走神经刺激和应用Ⅱ７烟碱胆碱受体激动荆尼古丁能抻制炎症反应。图片来自

ＬｉｂｅｒｔＣ

Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ａ

ｎｅｒｖｏｌＩｓ

ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，２３，４２１（６９２１）：３２８—９

浙江大学博上学位论文综述

目前胆碱能抗炎通路的确切机制尚未完全解开，但各种研究结果都认为：神

经系统的胆碱能抗炎通路与免疫细胞活化所密切相关的两种细胞内信号通路——

酪氨酸激酶／活化转录因子Ｊａｋ／ＳＴＡＴ３和核因子ＮＦ．ｒｄ３通路有关。Ｒｉｏｕｘ和Ｃａｓｔｏｎｇｕａｙ

等研究【钢发现，激活的ｔｘ７

ｎＡＣｈＲｌｉＥ抑制ＩＫＢ的降解和ｐ６５的核转位，这解释了胆碱

能激动剂在单核细胞、巨噬细胞以及内皮细胞的抗炎效应。Ｄｅ

Ｊｏｎｇｅ等研究【４７】发现

０【７

ｎＡＣｈＲ台Ｅ激活本身细胞内催化区，导致酪氨酸激酶Ｊａｋ聚集和磷酸化、继而活化

转录因子ＳＴＡＴ３。他们还发现刺激迷走神经能成功抑制小鼠肠道炎症反应，但对巨

噬细胞（ＬｙｓＭ．ＳＴＡＴ３ｆｌ／ｆ１）上缺失ＳＴＡＴ３的小鼠却无能为力，迷走神经的抗炎效应

也离不开Ｊ削ｓｎ盯３信号。但Ｍｕｒｒａｙ等研究１４８】认为ｓｎ虹３信号在这抗炎作用中起间

接作用，它没有直接抑制ＴＮＦ，ＩＬ．６和ｉＮＯＳ等促炎介质的转录能力，有可能０ｃ７

ｎｎＣｈＲ的活化干扰了经Ｊａｋ／Ｓ卫虹信号的其他信号途径和转录因子［４９，５０ｌ。除了ＮＦ．ｒｄ３

和Ｊａｋ／ＳＴＡＴ信号途径外，有研究报道胆碱能激动剂也调控了其他信号通路如细胞

外信号调节激酶（ＥＲＫ；ｐ４４／ｐ４２

ＭＡＰＫ）［５Ｌ５２］。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等研究‘５３１显示尼古丁能

上调人单核细胞环氧合酶（ＣＯＸ）．２表达，诱导ＰＧＥ２产生，ＰＧＥ２增加了环磷腺

苷水平和激活蛋白激酶（ＰＫＡ）。研究还显示ＣＯＸ．２和ＰＫＡ抑制剂能阻断尼古丁

对黏附分子和促炎因子的抑制作用，表明尼古丁可能经内源性的ＰＧＥ２产物起抗

炎效应【５３１。总的来说，ｔｘ７ｎＡＣｈＲ的活化与免疫细胞的众多信号途径相关，在胆碱

能抗炎效应中共同起作用。

２．４基因多态性

脓毒症是由环境因素（病原微生物）和遗传因素共同作用的多基因病。脓毒

症患者的临床表现呈现多样性，包括实验室生化指标差异很大。脓毒症的临床表

现多样性与环境因素、疾病的过程等固然有关，但遗传因素对脓毒症的发生、发

展起了重大作用。德国的Ｆｒａｎｋ

Ｓｔｕｂｅｒ教授在国际上首次报道了个体肿瘤坏死因子

基因多态性与脓毒症易感性、转归的相关性研究一划时代的成果，从此，掀起了

从分子遗传学水平上研究炎症介质基因多态性在脓毒症发病机制、防治作用的热

潮。今天有关该领域的研究报道已达数百篇，不难理解机体对致病微生物入侵后

是否产生免疫应答、应答的强弱及炎症介质释放方式（Ｔｈｌ抑或Ｔｈ２为主）一定程

ｆ；６

浙江大学博士学位论文

综述

度上受到遗传控制的，基因多态性将影响个体细胞因子产生水平、免疫应答反应

强度、全身性炎症反应、脓毒症发生发展。

基因多态性与脓毒症的关系研究设计中涉及到遗传学方法。连锁分析（１ｉｎｋａｇｅ

ａｎａｌｙｓｉｓ）和关联分析（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）是遗传病学中被大家所熟悉的方法。

连锁分析利用连锁的原理研究致病基因与参考位点（遗传标记）的关系。连锁分

析是基于家系研究的一种方法，利用遗传标记在家系中进行分型（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ），

再利用数学手段计算遗传标记在家系中是否与疾病产生共分离，是单基因遗传病

定位克隆方法的核心。根据孟德尔分离率，如果同一染色体上的位点不连锁，那

么遗传标记标将独立于致病基因而分离，与致病基因位于同一单倍体或不同单倍

体的机会各占一半，否则表明连锁的存在。利用连锁分析和定位克隆，明确了苯

丙酮尿症和镰刀形红细胞贫血病等单基因遗传病的基因突变位点。然而，大部分

疾病如糖尿病、动脉硬化症、脓毒症等是多基因遗传病，涉及到多个基因、不同

位点的变异，尤其是非孟德尔多基因变异（如脓毒症易感性问题）。连锁分析在这

类疾病中因为其假阳性高而不适用。该类多基因遗传病受家系分离方式缺乏、环

境因素多变的影响使其研究难度较大。对其研究目前主要有基于群体连锁不平衡

分析的高密度基因组筛选（ｈｉｇｈ．ｄｅｎｓｉｔｙ

ｇｅｎｏｍｅ

ｓｃａｎｓ）、关联分析。由于很少见到

一个家族中同时几个成员并发脓毒症的现象，故常用的家系研究方法不适用于脓

毒症发生发展的遗传学研究，关联分析被用于脓毒症发生发展的遗传学研究。目

前的脓毒症关联分析主要涉及两个方面：（１）脓毒症患者与相应的健康对照间的

遗传标志分布是否不一致，即脓毒症的易感遗传标志的寻找；（２）脓毒症患者中，

死亡组和存活组的遗传标志分布是否不一致，即脓毒症的预后遗传标志的寻找。

在关联分析研究设计中，选择哪些遗传标志、靶点去研究是十分重要的。目前对

肿瘤坏死因子、白介素．１和白介素．１０的基因多态性在脓毒症发生发展中的作用研

究较多、且认识较为深入，而针对凝血系统和神经系统的遗传学研究相对缺乏。

而且，对肿瘤坏死因子、白介素．１和白介素．１０等基因多态性研究均从单一炎症介

质来考虑脓毒症的发病机制。选取影响脓毒症发病的凝血系统、神经系统为研究

靶点，具有重要意义。

６７

浙江大学博士学位论文

３展望

迄今为止，对于脓毒症机体发病机制还没有充分阐明。尽管，国内外对脓毒

症的实验研究和临床研究十分重视，从器官、细胞、分子等不同层次观察研究各

种炎症介质、信号转导通路在ｓｅｐｓｉｓ和ＭＯＤＳ发病机制中的作用，探索研究其免疫

调节治疗。然而，既往抗炎症介质（如抗ＴＮＦ单抗、重组白介素．１受体拮抗剂、重

组ＩＬ．１０等）干预治疗的临床研究相继失败、有的甚至显示有害作用，这一点说明

了仅仅对脓毒症进行抗炎治疗是不够的。作为机体天然免疫系统对脓毒症的反应，

促炎和抑炎反应不能完全囊括脓毒症的所有特点，也不能充分阐明其根本发病机

制。病原微生物侵入机体后，不仅仅激活了炎症和抗炎反应，还迅速引起神经内

分泌系统变化，同时体内免疫、凝血等系统都会发生相应改变，共同参与脓毒症

时机体在血流动力学、营养代谢、免疫应答上的整体应激调整。因此，整体看待

脓毒症发病机制更有意义，而凝血系统、神经系统在脓毒症发病机制中的进一步

认识为我们提供新的契机。并且，随着人类基因组计划中人类基因组高分辨率遗

传图、染色体各种物理图谱的接近尾声与国际“人类基因组单体型图计划”的实施，

利用人类基因组图谱寻找与脓毒症相关的遗传变异、预警指标并指导其个体化防

治将是医学发展的方向。

浙江大学博士学位论文

综述

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ｓｅｐｓｉｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇ

ｃａｒｅ

Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｗａｌｅｓ，ａｎｄ

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

Ｉｒｅｌａｎｄ．

Ｃｒｉｔ

Ｃａｒｅ

Ｍｅｄ，２００３，３

１：２３３２－２３３８．

［８］

Ｖｉｎｃｅｎｔ

ＪＬ，Ｓａｋｒ

Ｙ

Ｓｐｒｕｎｇ

ＣＬ，ｅｔ

ａ１．Ｓｅｐｓｉｓ

ｉｎ

Ｅｕｒｏｐｅａｎ

ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ

ｃａｒｅ

ｕｎｉｔｓ：

ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＳＯＡＰ

ｓｔｕｄｙ．Ｃｒｉｔ

Ｃａｒｅ

Ｍｅｄ，２００６，３４（２）：３４４—３５３．

【９】

Ｓａｎｄｓ

ＫＥ，Ｂａｔｅｓ

ＤＷｊ

Ｌａｎｋｅｎ

ＰＮ，ｅｔ

ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ

ｏｆ

ｓｅｐｓｉｓ

ｓｙｎｄｒｏｍｅ

ｉｎ８

ａｃａｄｅｍｉｃｍｅｄｉｃａｌ

ｃｅｎｔｅｒｓ．ＪＡＭＡ．１

９９７；２７８（３）：２３４－２４０．

［１０】

Ｗｉｃｈｍａｎｎ

ＭＷ，Ｉｎｔｈｏｒｎ

Ｄ，ＡｎｄｒｅｓｓＨＪ，ｅｔ

ａ１．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄ

ｍｏｒｔａｌｉｔｙ

ｏｆ

ｓｅｖｅｒｅ

６９

浙江大学博上学位论文

ｓｅｐｓｉｓ

ｉｎ

ｓｕｒｇｉｃａｌ

ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ

ｃａｒｅ

ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ｔｈｅ

ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆ

ｐａｔｉｅｎｔｇｅｎｄｅｒ

ｏｎ

ｄｉｓｅａｓｅ

ｐｒｏｃｅｓｓ

ａｎｄ

ｏｍｃｏｍｅ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ

Ｃａｒｅ

Ｍｅｄ，２０００，２６（２）：１

６７－１７２．

［１

１】Ａｄｒｉｅ

Ｃ，ＡｌｂｅｒｔｉＣ，Ｃｈａｉｘ－ＣｏｕｔｕｒｉｅｒＣ，ｅｔ

ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ

ａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃ

ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ

ｓｅｖｅｒｅ

ｓｅｐｓｉｓ

ｉｎ

Ｆｒａｎｃｅ：ａｇｅ，ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｔｅ，ａｎｄ

ｐｌａｃｅ

ｏｆ

ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ

ｃａｒｅ

ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｏｒｕｎｉｔ）ａｓ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ

ｏｆ

ｗｏｒｋｌｏａｄ

ａｎｄｃｏｓｔ。ＪＣｒｉｔ

Ｃａｒｅ，２００５，２０（１）：４６－５８．

［１２】Ｓｉｌｖａ

Ｅ，Ｐｅｄｒｏ

Ｍｄｅ

Ａ，Ｓｏｇａｙａｒ

ＡＣ，ｅｔ

ａ１．Ｂｒａｚｉｌｉａｎ

Ｓｅｐｓｉｓ

Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ

Ｓｔｕｄｙ

（ＢＡＳＥＳｓｔｕｄｙ）．ＣｒｉｔＣａｒｅ，２００４，８（４）：Ｒ２５

１－Ｒ２６０．

【１

３】Ａｎｇｕｓ

ＤＣ，Ｌｉｎｄｅ—Ｚｗｉｒｂｌｅ

ＷＴ，Ｌｉｄｉｃｋｅｒ

Ｊ，ｅｔ

ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ

ｏｆ

ｓｅｖｅｒｅ

ｓｅｐｓｉｓ

ｉｎ

ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ

Ｃｒｉｔ

Ｃａｒｅ

Ｓｔａｔｅｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆ

ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｏｍｃｏｍｅ，ａｎｄ

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ

ｃｏｓｔｓ

ｏｆ

ｃａｒｅ．

Ｍｅｄ，２００１，２９（７）：１３０３—１３１０．

［１４】Ａｌｂｅｒｔｉ

Ｃ，Ｂｒｕｎ—ＢｕｉｓｓｏｎＣ，ＢｕｒｃｈａｒｄｉＨ，ｅｔ

ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ

ｏｆ

ｓｅｐｓｉｓ

ａｎｄ

ａｎ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＩＣＵ

ｐａｔｉｅｎｔｓ

ｆｒｏｍ

ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ

ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ

ｃｏｈｏｒｔ

ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ

Ｃａｒｅ

Ｍｅｄ．２００２；２８（２）：１０８－１２１．

【１５】Ｇｕｉｄｅｔ

Ｂ，Ａｅｇｅｒｔｅｒ

Ｐ，Ｇａｕｚｉｔ

Ｒ

ｅｔ

ａ１．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄ

ｉｍｐａｃｔ

ｏｆ

ｏｒｇａｎｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ

ｓｅｐｓｉｓ．Ｃｈｅｓｔ，２００５，１

２７（３）：９４２—９５

１．

【１６】Ｈｏｆｆｍａｎｎ

ＪＡ，Ｋａｆａｔｏｓ

ＦＣ，Ｊａｎｅｗａｙ

ＣＡ，ｅｔ

ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ

ｉｎｉｎａｔｅ

ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４（５４１８）：１３１３－－１３１８．

【１

７】Ｕｌｌｏａ

Ｌ，Ｔｒａｃｅｙ

ＫＪ．Ｔｈｅ‘ｃｙｔｏｌｄｎｅ

ｐｒｏｆｉｌｅ’：ａ

ｃｏｄｅｆｏｒ

ｓｅｐｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ

Ｍｏｌ

Ｍｅｄ，

２００５，１

１（２）：５６－６３．

ＲＳ，Ｋａｒｌ

ＩＥ．Ｔｈｅ

ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ

【１

８】Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ

ａｎｄ

ｔｒｅａｔｍｅｎｔ

ｏｆ

ｓｅｐｓｉｓ．ＮＥｎｇｌ

Ｊ

Ｍｅｄ，２００３，３４８（２）：１３８－１５０．

【１

９】Ｒｉｃｅ

ＴＷ，Ｂｅｒｎａｒｄ

ＧＲ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ

ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｔａｒｇｅｔｓ

ｆｏｒ

ｓｅｐｓｉｓ．Ａｎｎｕ

Ｒｅｖ

Ｍｅｄ，２００５，５６：２２５－２４８．

【２０】Ｇａｎｄｏ

Ｓ，Ｎａｎｚａｋｉ

Ｓ，Ｓａｓａｋｉ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ

ｔｈｅ

ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ

ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ

ｐｍｈｗａｙ

ｉｎ

ｐａｔｉｅｎｔｓ谢ｍ

ｓｅｖｅｒｅ

ｓｅｐｓｉｓ

ａｎｄ

ｓｅｐｔｉｃ

ｓｈｏｃｋ．ＣｒｉｔＣａｒｅ

Ｍｅｄ，１

９９８，

２６（１２）：２００５—２００９．

７０

浙江大学博十学位论文

综述

［２１】Ｅｓｍｏｎ

ＣＴ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ

ｂｅｔｗｅｅｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｒ

Ｊ

Ｈａｅｍａｔｏｌ，２００５，１

３

１（４）：４

１

７－４３０．

【２２】Ｅｓｍｏｎ

ＣＴ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ

ｂｅｔｗｅｅｎ

ｔｈｅｉｎｎａｔｅ

ｉｍｎｌｕｎｅ

ａｎｄ

ｂｌｏｏｄ

ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ

ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｒｅｎｄｓ

Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，２５（１０）：５３６－５４２．

【２３】Ｍｏｓｎｉｅｒ

ＬＯ，ＺｌｏｋｏｖｉｃＢＶ，Ｇｒｉｆｆｉｎ

ＪＨ．Ｔｈｅ

ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｐａｔｈｗａｙ．

Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９（８）：３１６１－３１７２．

【２４］Ｇｒｅｙ

ＳＴ，ＴｓｕｃｈｉｄａＡ，ＨａｕＨ，ｅｔ

ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ

ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ

ｅｆｆｅｃｔｓ

ｏｆ

ｔｈｅ

ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ

ｏｎ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｔｈｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ

ｏｆ

ｅｓｔｅｒ

Ｊ

ｈｕｍａｎ

ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ

ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ

ｔｏ

ＬＰＳ，

ＩＦＮ－ｇａｍｍａ，ｏｒ

ｐｈｏｒｂｏｌ

Ｉｍｍｕｎｏｌ，１

９９４，１

５３（３）：３６６４—３６７２．

【２５】ＨｉｒｏｓｅＫ，Ｏｋａｊｉｍａ

Ｋ，Ｔａｏｋａ

Ｙ

ｅｔ

ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｒａｔｓ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃｒｅｄｕｃｅｓｔｈｅ

ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．ｉｎｄｕｃｅｄ

ｓｐｉｎａｌ

ｃｏｒｄ

ｉｎｊｕｒｙ

ｉｎ

ａｃｔｉｖａｔｉｏｎＡｎｎ

ｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ

Ｓｕｒｇ，２０００，２３２（２）：２７２—２８０．

Ｋ，Ｕｃｈｉｂａ

【２６】ＭｕｒａｋａｍｉＫ，Ｏｋａｊｉｍａ

Ｍ，ｅｔ

ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｂｙ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｐｒｅｖｅｎｔｓ

ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ

ｐｕｌｍｏｎａｒｙ

ｖａｓｃｕｌａｒ

ｉｎｊ

ｕｒｙ

ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ

ｃｙｔｏｋｉｎｅ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｍ

Ｊ

Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７，２７２（２

【２７】Ｔａｙｌｏｒ

Ｐｔ

１）：Ｌ１９７一Ｌ２０２．

ＦＢ

Ｊｒ，Ｓｔｅａｍｓ—Ｋｕｒｏｓａｗａ

ＤＪ，ＫｕｒｏｓａｗａＳ，ｅｔ

ａ１．Ｔｈｅ

ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｒｅｃｅｐｔｏｒ

ａｉｄｓｉｎｈｏｓｔｄｅｆｅｎｓｅ

ａｇａｉｎｓｔ

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ

ｃｏｌｉ

ｓｅｐｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ，

２０００，９５（５）：１

６８０－１

６８６．

【２８】Ｗｈｉｔｅ

Ｂ，Ｓｃｈｍｉｄｔ

Ｍ，Ｍｕｒｐｈｙ

Ｃ，ｅｔ

ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｏｆ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｉｎｈｉｂｉｔｓ

ｋａｐｐａＢ

ｉｎ

ｔｈｅ

ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ

ｎｕｃｌｅａｒ

ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ

ｎｕｃｌｅａｒ

ｆａｃｔｏｒ

（ＮＦ—ｋａｐｐａＢ）ａｎｄ

ｔｕｍｏｕｒｎｅｃｒｏｓｉｓ

ｆａｃｔｏｒ

ａｌｐｈａ（ＴＮＦ—ａｌｐｈａ）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

Ｏ（１）：１

３０—１３４．ＴＨＰ－１

ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ

ｃｅｌｌｌｉｎｅ．ＢｒＪ

Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０００，１

１

［２９】Ｊｏｙｃｅ

ＤＥ，ＧｅｌｂｅｒｔＬ，ＣｉａｃｃｉａＡ，ｅｔ

ａ１．Ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ

ｏｆ

ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ

Ｃ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｄｅｆｉｎｅｓｎｅｗ

ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ

ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ

１１９９—１１２０３．

Ｃ

ａｎｄ

ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ

Ｂｉｏｌ

Ｃｈｅｍ，２００１，２７６（１４）：１

【３０】Ｅｓｍｏｎ

［３１】ｔｅｎ

ＣＴ．Ｔｈｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｈｅｓｔ，２００３，１２４（３Ｓｕｐｐｌ）：２６Ｓ－３２Ｓ．

Ｔ，ＬｅｖｉＭ，ｅｔ

ａ１．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｔｒｉｇｇｅｒｓ

ｏｆ

ｃｌｉｎｉｃａｌ

７１

Ｃａｔｅ

ＪＷ，ｖａｉｌ

ｄｅｒＰｏｌｌ

浙江大学博士学位论文

ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ

ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｒｏｍｂ

Ｈａｅｍｏｓｔ，１

９９７，７８（１）：４

１５－４１９．

［３２】Ｔｏｌｔｌ

ＬＪ，ＳｈｉｎＬＹ，Ｌｉａｗ

ＰＣ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｉｎ

ｓｅｐｓｉｓ

ａｎｄ

ｂｅｙｏｎｄ：ｕｐｄａｔｅ

２００６．

Ｆｒｏｎｔ

Ｂｉｏｓｃｉ，２００７，１２：１９６３—１９７２．

【３３］Ｂｒｕｎｋｈｏｒｓｔ

Ｆ＇ＳａｋｒＹ

ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ

Ｈａｇｅｌ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．ＰｒｏｔｅｉｎＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ

ｃｏｒｒｅｌａｔｅｗｉｔｈ

ｏｒｇａｎ

ａｎｄ

ｐｒｅｄｉｃｔ

ｏｕｔｃｏｍｅ

ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｏｆｔｈｅ

ｐｒｅｓｅｎｃｅ

ｏｆ

ｓｅｐｓｉｓ．

Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，１０７（１）：１５—２３．

［３４】Ｆｅｉｓｔｒｉｔｚｅｒ

Ｃ，ＳｔｕｒｎＤＨ，ＫａｎｅｉｄｅｒＮＣ，ｅｔ

ａ１．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ

ｒｅｃｅｐｔｏｒ

ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ

ｈｕｍａｎ

ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ

ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ

ｂｙｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃ．Ｊ

Ａｌｌｅｒｇｙ

Ｃｌｉｎ

Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，１１２（２）：３７５－３８１．

［３５】Ｂｅｒｎａｒｄ

Ｇ凡Ｖｉｎｃｅｎｔ几，Ｌａｔｅｒｒｅ

ＰＦ，ｅｔ

ａ１．Ｅｆｆｉｃａｃｙ

ａｎｄ

ｈｕｍａｎ

７０９．

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｃｆｏｒ

ｓｅｖｅｒｅ

ｓａｆｅｔｙ

ｏｆ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｓｅｐｓｉｓ．Ｎ

Ｅｎｇｌ

Ｊ

Ｍｅｄ，２００１，３４４（１０）：６９９—

［３６】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ

Ｊ．Ｔｈｅ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｒｅｆｌｅｘ・ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＪＩｎｔｅｒｎ

Ｍｅｄ，２００５，

２５７（２）：１２２—１２５．

【３７】Ｔｒａｃｅｙ

ＫＪ．Ｔｈｅ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｒｅｆｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４２０（６９１７）：８５３—８５９．

【３８］ＰａｖｌｏｖＶＡ，Ｗａｎｇ

ａ

Ｈ，Ｃｚｕｒａ

ｃＪ，ｅｔ

ａ１．Ｔｈｅ

ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ

ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｐａｔｈｗａｙ：

ｍｉｓｓｉｎｇ

ｌｉｎｋｉｎ

ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ

Ｍｅｄ，２００３，９（５—８）：１

２５—１３４．

ＬＶ，Ｉｖａｎｏｖａ

Ｓ，Ｚｈａｎｇ

［３９】Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ

Ｍ，ｅｔ

ａ１．Ｖａｇｕｓ

ｎｅｒｖｅ

ｓｔｉｍｕｌｍｉｏｎ

ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ

ｔｈｅ

ｓｙｓｔｅｍｉｃ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０５（６７８５）：４５８・４６２．

ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ７

ｓｕｂｕｎｉｔｉｓ

［４０】Ｗａｎｇ

ａｎ

Ｈ，Ｙｕ

Ｍ，Ｏｃｈａｎｉ

Ｍ，ｅｔ

ａ１．Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ

ｅｓｓｅｎｔｉａｌ

ｒｅｇｕｌａｔｏｒ

ｏｆｉｎｆｌａｍｍｍｉｏｎ．Ｎａｔｕｒ，２００３，４２１（６９２１）：３８４－３８８．

Ｋ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ

【４１】ＫａｗａｓｈｉｍａＫ，Ｆｕｊ

ｉｉ

Ｙｘ，ｅｔ

ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ

ｇｅｎｅｓ

ｉｎ

ｍｕｒｉｎｅ

ｅｎｃｏｄｉｎｇｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ

ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ

ｉｍｍｕｎｅ

ｃｅｌｌｓ．Ｌｉｆｅ

Ｓｃｉ，２００７，

８０（２４・２５）：２３

【４２】ｄｅ

Ｊｏｎｇｅ

１４－２３１９．

Ｌ．Ｔｈｅ

ａｌｐｈａ７

ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ

ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ

ａｓａ

ＷＪ，Ｕｌｌｏａ

ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｔａｒｇｅｔ

ｆｏｒ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｂｒ

Ｊ

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７，１５１（７）：９１５—９２９．

ｒｏｌｅｏｆ

［４３】Ｇａｌｌｏｗｉｔｓｃｈ－Ｐｕｅｒｔａ

Ｍ，Ｔｒａｃｅｙ

ＫＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ

７２

ｔｈｅ

ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ