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HPLC法研究根皮素的稳定性

张瑞涛;徐媛;王庆伟

【摘 要】目的 研究根皮素在不同条件下的稳定性.方法 采用经典恒温法考察根皮

素在不同pH值水溶液中的稳定性以及抗氧剂、强酸、强碱、强光、强氧化和高温

条件下对其稳定性的影响,并研究根皮素在常温条件下,在不同溶剂和pH值缓冲液

中的最大溶解度,用反相高效液相色谱法测定其含量.结果 根皮素在碱性、中性和强

氧化性条件下不稳定,在酸性环境、强光、高温条件下稳定.不同的抗氧化剂对其稳

定性具有一定的保护作用.结论 根皮素在酸性环境下比较稳定,在溶液0.1 mol·L-1

HCl,pH值3.0,pH值4.0,水,pH值5.0,pH值6.0,30mL·L-1H2O2,pH值7.0缓冲

液中稳定性依次降低,对于根皮素及其相关产品的研发具有重要意义,在实际应用中

应加以考虑.%Objective To study the stability of phloretin under different

conditions .Methods The classical isothermal method was used to study

the stability of phloretin in different pH buffer solutions ,and the effects of

antioxidants ,acids ,alkalis ,light ,strong oxidation and high temperature on

the stability of phloretin were studied .HPLC method was used to

determine the solubility of phloretin in different solvents .Results Phloretin

was unstable in alkaline and strong oxidizing conditions while was stable in

acid and high temperature .Conclusion Phloretin have different stability in

diverse conditions ,this should be considered on practical ap-

plication .Phloretin is stable in the acidic environment .The stability of

phloretin decreased in turn at the solution of 0 .1 mol · L -1

HCl ,pH3 .0 ,pH4 .0 ,water ,pH5 .0 ,pH6 .0 ,30 mL · L -1 H2 O2 and

pH7 .0 .This is of great significance for the development of phloretin and

its related products ,and this should be considered on practical

application .

【期刊名称】《西北药学杂志》

【年(卷),期】2018(033)001

【总页数】4页(P80-83)

【关键词】根皮素;稳定性;HPLC法;pH

【作 者】张瑞涛;徐媛;王庆伟

【作者单位】第四军医大学唐都医院药剂科,西安 710038;第四军医大学唐都医院

药剂科,西安 710038;第四军医大学唐都医院药剂科,西安 710038

【正文语种】中 文

【中图分类】R927.11

根皮素是一种被称为维生素P的类黄酮化合物[1-2],是植物次生代谢产物,化学结构

为3-(4-羟基苯基)-1-(2,4,6-三羟基苯基)-1-丙酮,包含4个酚羟基,独特的化学结构

决定了其强大的抗氧化活性[3-5]。根皮素主要存在于苹果、梨和金橘等水果果皮

中[6-9]。现代药理学研究表明,根皮素具有多种生物学活性,对骨质疏松症具有预防

和治疗作用,对心血管硬化、高脂血症、肥胖症和阿尔茨海默疾病也有影响[10-16]。

根皮素的不稳定性会影响根皮素的研究、生产和推广应用,这也是根皮素相关制剂

在加工和使用过程中一个急需解决的难题。本研究建立了一种简单、灵敏、快速的

测定根皮素含量的HPLC法[17-18],系统研究了溶剂、温度、pH值和光照对根皮

素稳定性的影响,为研制稳定的根皮素相关制剂提供强有力的理论依据[19-20]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司,VWD紫外检测器)；

CP225D型电子分析天平(德国Sartarius有限公司)；HH-1型恒温水浴箱(北京科

伟有限公司)；TGL20M型高速冷冻离心机(湖南湘仪有限公司)；UMV-1型多管漩

涡混合器振荡器(北京优晟联合科技有限公司)；KH5200DV型超声仪(浙江昆山禾

创超声仪器有限公司)；Milli-Q Advantage A10型超纯水机(美国密理博有限公

司)。

1.2 试药 根皮素(第四军医大学药物化学教研室提供,质量分数>99%)；磷酸(天津

科密欧化学试剂开发中心)；磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸(西安

市长安精细化工厂)；氢氧化钠(天津恒兴化学试剂制造有限公司)；甲醇、乙腈(色

谱纯,美国Tedia公司提供)。

2 方法与结果

2.1 根皮素HPLC测定方法的建立

2.1.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm,5 μm)；

流动相：乙腈-水(45∶55)；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量20 μL;流

速：1 mL·min-1。 色谱图见图1。

图1 HPLC图

1.根皮素。

Fig.1 HPLC chromatograms

tin.

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 磷酸盐缓冲液 取磷酸16.6 mL，加水至1 000 mL使溶解,作为A液；取磷

酸氢二钠71.63 g,加水至1 000 mL使溶解,作为B液；取A、B不同体积,混合,精

确配制成pH值分别为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的系列溶液。

2.1.2.2 对照品溶液 精密称取根皮素对照品10 mg,加甲醇制成质量浓度为1

mg·mL-1的溶液,即得。

2.1.3 线性关系考察 精密称取根皮素10 mg,置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀

释至刻度,摇匀,作为储备液；取储备液适量,分别稀释成质量浓度为100,50,25,10,2

和1 μg·mL-1的系列溶液。按照2.1.1项下色谱条件,进样20 μL,以峰面积为纵坐

标y、根皮素质量浓度为横坐标x进行线性回归,得回归方程

y=74.680x+10.087,r=0.999 2,结果表明,根皮素质量浓度在1～100 μg·mL-1范

围内线性关系良好。

2.1.4 精密度实验 精密吸取根皮素对照品溶液,连续进样6次,每次20 μL,按照2.1.1

项下色谱条件进行测定,测得RSD值为1.06%,结果表明，仪器精密度良好。

2.2 根皮素影响因素的考察 对根皮素进行强酸(1 mol·L-1 HCl)、强碱(1 mol·L-1

NaOH)、强光、强氧化(30 mL·L-1 H2O2)、高温(100 ℃)破坏,初步结果表明,根皮

素在强酸、强光、高温环境下较稳定,在强碱、强氧化条件下不稳定,尤其在强碱下

根皮素迅速降解。

2.2.1 室温下根皮素在不同溶液中的稳定性实验 取pH 值分别为

3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的缓冲液及水、0.1 mol·L-1 HCl、30 mL·L-1 H2O2

各100 mL,分别加入根皮素4 mg,超声处理15 min,振荡摇匀,以3 000 r·min-1离

心10 min,取上清,过滤,分别在0,1,2,4,6,8,12和24 h取样,微孔滤膜滤过,取续滤液,

按照2.1.1项下色谱条件测定峰面积,用标准曲线回归方程计算溶液中根皮素含量,

以质量浓度C(μg·mL-1)对时间t作图。见图2。

图2 根皮素在室温下的质量浓度变化曲线

Fig.2 The concentration curve of phloretin at room temperature

2.2.2 35,55和75 ℃下根皮素在不同pH值缓冲液及水中的稳定性实验 实验结果

表明,根皮素在碱性条件下降解速度较快,因此实验只考察pH值为

3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的缓冲液及水、0.1 mol·L-1 HCl和30 mL·L-1H2O2中的不同

温度的稳定性,取pH值为3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的缓冲液及水、0.1 mol·L-1 HCl

和30 mL·L-1H2O2各100 mL,分别加入根皮素4 mg,超声处理15 min,振荡摇匀,

以3 000 r·min-1离心10 min,取上清液置于EP管中,进行HPLC测定,作为0 h点,

其余分别置于35,55和75 ℃的恒温水浴中,分别在0,1,2,4,6,8,12和24 h取样,微

孔滤膜滤过,取续滤液,按照2.1.1项下色谱条件测定峰面积,用标准曲线回归方程计

算溶液中根皮素含量,以药物残留百分比的自然对数对时间t作图。见图3～5。

由图3～5可知,根皮素的降解曲线基本符合一级动力学方程。按照一级动力学方程,

求出不同温度和pH值下的根皮素的降解反应速度常数K值,见表1。

图3 根皮素在35 ℃不同pH值缓冲液中的降解曲线

A.0.1 mol·L-1HCl；3.0；4.0；d.H2O；5.0；6.0；g.30

mL·L-1H2O2；7.0。

Fig.3 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 35 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；3.0；4.0；d.H2O；5.0；6.0；g.30

mL·L-1H2O2；7.0.

图4 根皮素在55 ℃不同pH值溶液中的降解曲线

A.0.1 mol·L-1HCl；3.0；4.0；d.H2O；5.0；6.0；g.30

mL·L-1H2O2；7.0。

Fig.4 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 55 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；3.0；4.0；d.H2O；5.0；6.0；g.30

mL·L-1H2O2；7.0.

图5 根皮素在75 ℃不同pH值溶液中的降解曲线

A.0.1 mol·L-1HCl；3.0；4.0；d.H2O；5.0；6.0；g.30

mL·L-1H2O2；7.0。

Fig.5 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 75 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；3.0；4.0；d.H2O；5.0；6.0；g.30

mL·L-1 H2O2；7.0.

表1 降解反应速度常数K

Tab.1 The degradation constant K

温度

/℃H2OHClH2O2pH3.0pH4.0pH5.0pH6.0pH7.0350.0200.0030.0360.0150.01

60.0260.0310.072550.0490.0060.6250.0260.0380.0510.1571.463750.0890.01

82.2860.0610.0730.1051.3894.403

根据Arrhenius公式可以求出室温下的降解反应速度常数K,由其可求出降解10%

的时间,即有效期t0.9,求得相同pH值以及不同溶液下的直线方程,见表2。

2.2.3 室温25 ℃下根皮素在不同溶液中的最大溶解度 分别取各溶液10 mL,置于离

心管中,加足量的根皮素,然后超声15 min,振荡摇匀,以3 000 r·min-1离心10 min,

取上清液,滤膜过滤,进行HPLC测定,得色谱峰峰面积,以外标法计算各个溶液的质

量浓度,实验重复3遍,取平均值。见表3。

表2 根皮素水解Arrhenius方程和t0.9

Tab.2 The Arrhenius equation of phloretin hydrolysis and t0.9

项目Arrhenius方程rK(T=298)t0.9(h)H2OLnK=9.1456-

4011.7/T0.99680.0133007.900.1mol·L-1HClLnx=9.6078-

4773.2/T0.98640.00164664.0030mL·L-1H2O2Lnx=33.224-

11194/T0.98420.0130008.08pH3.0LnK=7.8756-

3737.9/T0.98740.00940011.20pH4.0LnK=9.1101-

4073.8/T0.99890.01000010.00pH5.0LnK=8.4499-

3733.1/T0.99840.0170006.22pH6.0LnK=29.344-

10146/T0.99280.00900011.60pH7.0LnK=33.708-

11112/T0.97440.0278003.78

表3 室温下不同溶剂根皮素的最大溶解度

Tab.3 Maximum solubility of phloretin in different solvents at room

temperature

溶剂最大溶解度/μg·mL-1H2O47.40.1mol·L-1HCl25.730mL·L-

1H2O225.3pH3.013.6pH4.016.5pH5.017.1pH6.022.2pH7.055.34

3 讨论

在影响因素考察实验中,根皮素在强氧化性条件下不稳定,在碱性条件下迅速降解,而

其对强酸、强光、高温较稳定。笔者研究了根皮素在pH值为3.0,4.0,5.0,6.0和

7.0的缓冲液及水、30 mL·L-1H2O2和0.1 mol·L-1 HCl 中的恒温加速实验以及

室温下根皮素在不同pH值缓冲液及水溶液、30 mL·L-1H2O2中的最大溶解度。

实验结果表明,根皮素在酸性环境下比较稳定,根皮素在溶液0.1 mol·L-

1HCl,pH3.0,pH4.0,水,pH5.0,pH6.0,30 mL·L-1 H2O2 ,pH 7.0缓冲液中的稳定性

依次降低,对于根皮素及其相关产品的研究具有重要意义。

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