2024年4月10日发(作者：)

免疫荧光染色质量影响因素分析

作者：宋瑞龙 周子彦 徐天祺 潘士锋 刘宗平

来源：《安徽农业科学》2019年第16期

摘要免疫荧光技术是标记免疫技术中应用最为广泛的一项技术，具有特异性强、灵敏度

高、速度快和便于观察等特点。影响免疫荧光染色质量的因素多种多样，从荧光染料、抗体、

样品前处理、染色过程等几个重要的方面入手，就如何提高免疫荧光染色质量，以获得一张高

分辨率的图片做了详细的介绍。该研究有利于提高免疫荧光染色质量，为生命科学研究提供了

有力帮助。

关键词免疫荧光染色技术;抗体;影响因素

中图分类号Q2-33文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）16-0124-03

doi：10.3969/.0517-6611.2019.16.036

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

InfluencingFactorsofQualityofImmunofluorescentStainingTechnology

SONGRuilong，ZHOUZiyan，XUTianqietal（CollegeofVeterinaryMedicine，

YangzhouUniversity/JiangsuCoinnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiou

sDiseasesandZoonoses，Yangzhou，Jiangsu225009）

AbstractAsoneofthemostwidelyusedimmunolabelingtechniques，

immunofluorescencehasseveraladvantagesincludinghighspecificity，highsensitivity，

r，

thequalityofimmunofluorescentstainingcouldbeaffectedbymultiplefactors，suchasfluorescentdyes，

antibodies，ngwiththosevitalfactors，

weintroducedhowtoimprovethequalityofimmunofluorescentstainingsoastoobtainahighresolutionimagei

udyimprovedthequalityofimmunofluorescentstainingandprovidedpowerfulhelpforlifescie

nceresearch.

KeywordsImmunofluorescentcellstainingtechnology;Antibody;Influencingfactor

免疫荧光染色技术是一种以免疫学为基础，结合生物化学技术和显微技术发展而来的蛋白

等分子检测技术。这种技术是Coons等在1941年首先建立的，尤其近三十幾年来，免疫标记

技术和检测技术有了长足的进步，其稳定性、灵敏性和特异性都有了飞速的发展。免疫荧光染

色技术作为一种科学研究的技术手段，已被广泛应用于细胞生物学、微生物学、寄生虫学、免

疫学等科学研究，以及临床诊断方面[1-5]。因此，提高免疫荧光染色质量尤为重要。

免疫荧光技术利用了抗原与抗体高度特异性结合的原理，将某种可测定的物质偶联到抗体

或者抗原上，通过检测标记物的有无和含量，对样品中待检抗原或抗体进行定性、定位和定量

检测。物质原子核外电子具有多个不同大小的能级，最低能级称为基态。当光子能量等于2个

不同能级的能量差时，低能级电子吸收光子能量后，跃迁至高能级的激发态。激发态极不稳

定，会向低能级状态跃迁，释放出不同能量的光子，这些光子能够通过荧光显微镜检测到，进

而对检测物质进行定性、定位、定量等检测[6]。荧光物质在持续受到激发光激发后，由于不

能够恢复到基态，从而导致荧光强度减弱或淬灭。免疫荧光染色技术包括试验准备阶段、染色

过程和样品拍摄，以下将从荧光染料、抗体、样品前处理、染色过程等方面阐述如何提高免疫

荧光染色的质量，以获得高清晰度的图片。

1试验准备

1.1免疫荧光染色方法的选择

免疫荧光染色技术分为直接法和间接法。直接法是将荧光标记物偶联在抗原/抗体上，直

接与相应的抗体/抗原反应;间接法是先用未标记的一抗与抗原充分反应后，再利用荧光标记的

二抗与已经结合在抗原上的一抗结合，达到检测抗原的目的[1]。直接法操作简单、特异性

高，非特异性染色少，便于相同宿主来源的不同蛋白的共定位，但是其灵敏性相对比间接法

低。间接法相对直接法操作复杂，特异性稍低，但灵敏度高，染色更加灵活，成本低。一般情

况下，间接法因上述特点应用更加广泛，而直接法主要应用于流式细胞术或者无法购买到不同

宿主来源的一抗时而进行的蛋白共定位检测试验中。

1.2抗体的选择

抗原通常包含多个抗原决定簇，抗体按是否由单一抗原决定簇刺激机体产生而分为单克隆

抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是经一种抗原决定簇刺激后的杂交瘤细胞，经HAT培养基筛

选，ELISA检测效价，得到阳性克隆株，注射到动物腹水中，收集纯化得到的抗体[7-8]。多克

隆抗体只需将具有多个抗原决定簇的抗原直接注射到动物体内进行几次免疫，ELISA测其效价

合格后，收集血液离心得到上清，纯化后得到多克隆抗体[9-11]。

单克隆抗体特异性高[12]，但因单克隆抗体由单一抗原决定簇抗原刺激得到，所以只能识

别一个抗原表位，灵敏度相对较低，且单克隆抗体的抗原表位一旦破坏，将直接影响其与抗原

的结合，导致免疫荧光染色的失败[8，13]。另外，单克隆抗体制备过程复杂，价格也相对较

高。而多克隆抗体制备过程简单，周期短，价格相对较低[14]。因多克隆抗体由多个抗原决定

簇刺激机体得到，所以其能识别多个抗原表位，相同条件下，灵敏度更高，对于表达量较低的