2023年7月17日发(作者：)

SELDI蛋白质芯片技术

传统蛋白质研究的方法如色谱分离纯化技术、二维电泳、质谱等方法因操作过程繁锁、耗时冗长、重复性差、检测样本量小等缺点而不适合对蛋白质开展大规模的筛选研究，蛋白质组学研究迫切需要一种高通量、快速、全自动化的用于对批苗蛋白质进行快速研究的仪器。

SELDI蛋白质芯片技术，又称为表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface-enhanced

laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。自2002年日本科学家田中耕一因发明该技术而荣获诺贝尔化学奖后。该技术发展十分迅速，目前已经广泛应用于生物技术、药学、基因学、临床诊断、生物信息等诸多领域。其在临床实验诊断学中的主要工作原理是利用蛋白质芯片(proteinchip)和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪对体液中各种蛋白质．包括疾病早期最微小基因表达产物如低分子量蛋白质、多肽等。进行动态、全景的分析。获得待检标本中各种蛋白的含量及其分子量等信息，绘制成蛋白质指纹图谱。再通过计算机软件将正常人、亚健康状态人群、良性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照。比较分析差异。就能快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。目前发现通过SELDI蛋白质芯片技术所获得的生物标记物．大多是特异性肿瘤微环境所产生的低分子量的蛋白质，通过对多种肿瘤的检测表明。其敏感性和特异性均优于传统的肿瘤标记物．对某些肿瘤的敏感性已达到100％。特异性也超过95％。因而该技术能在肿瘤早期诊断中具有很重要的临床应用价值。

1 SELDI-TOF-MS系统的组成

1.1蛋白质芯片 又称蛋白质微阵列(protein mieroarray)。把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片或硅片等载体上。蛋白质与载体表面结合。同时仍保留蛋白质的理化性质和生物活性，可以高效地大规模获取生物体中蛋白质的信息。蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点：芯片阵列的构建、样品的制备、芯片上的生物分子反应、芯片信号检测及分析。制备蛋白质芯片时由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式。因此对芯片的表面修饰至关重要。要保证被点在芯片上的蛋白质不失活而又能牢固的固定在芯片上。SELDI蛋白质芯片的制备比普通的蛋白质芯片更复杂，首先制备生物原始样品，把制备好的蛋白质经过亲和作用结合到芯片的化学 或生物位点上，再洗去非特异结合的蛋白质和缓冲液中的杂质以消除干扰，待芯片干燥后，每个位点上加能量吸收分子(energy absorb molecule，EAM)，使之与蛋白质结合为混合晶体．以促进蛋白质在SELDI-TOF-MS检测中解吸附和离子化。根据定位于芯片表面的物质性质不同，芯片分为化学型和生物型两类：化学型芯片是基于经典的层析原理，通过疏水力、静电力、共价键等结合样本中的蛋白质；生物型芯片则是把生物活性分子结合到芯片表面，利用抗原和抗体、受体和配体、酶和底物、蛋白质和DNA之间的相互作用捕获样本中的蛋白质，用以研究这些蛋白质分子之间的相互作用。

1.2表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪,即SELDI-TOF-MS系统的芯片阅读器，芯片上蛋白与EAM形成的晶体，在特异激光照射下，晶体发生解离，带电粒子通过电场时被加速。检测仪记录飞行时间，粒子的质量越小，相对所带电荷越多，质荷比(m/z)越小，飞行时间越短，被最先检测到，反之粒子的质量越大。相对所带电荷越少，质荷比(m/z)越大，飞行时间越长，则被后检测到。测到的信号由高速模拟数字转化器转换并记录，被测蛋白就以一系列峰值的形式呈现。这些特异性波峰构成了该疾病特有的指纹图谱，指纹图谱的横轴表示蛋白类型，纵轴为蛋白的丰度，单个蛋白在图谱上的 位置取决于飞行时间。

1.3软件控制分析系统 主要有Ciphergen software 3.1和Biomarker Pattern Software等，软件控制分析系统可以使整个过程变得自动化、简便化。其主要功能包括：数据库的建立、内部信息及外部信息的校准、数据处理和分析。通过对已知两组或多组数据进行差异性分析，从而寻找出数据中有鉴别意义的质谱图。

2 SELDI-TOF-MS技术的特点 目前常用于蛋白质鉴定的质谱技术还有电子喷雾电离质谱测量技术(electrospray

ionization-mass spectrometry，ESI-MS)、基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱技术(matrix

assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)等。ESI-MS可精确地测出蛋白质的分子量，目前也已经成功地用于蛋白质等生物大分子测定、肽图测定、蛋白质和多糖序列以及翻译后修饰的分析。近几年来出现的ESI-MS/MS串联质谱技术还可测定修饰的氨基酸，该技术有很高的准确度，但灵敏度稍低。并且系统复杂、操作要求较高，通常只用于MALDI-TOF-MS不能鉴定的复杂样品。而不作为常规和高通量分析四。MALDI-TOF-MS技术又称为多肽质量指纹分析 (peptide mass finger printing)，具有操作简便、分析速度快、敏感度高等优点，但是该技术只能鉴定数据库中已知序列的蛋白质。且要求样品纯度尽可能地高．样品中的脂质、碳水化合物等都会影响蛋白质的有效离子化。从而对测定结果产生较大的影响。

SELDI-TOF-MS技术是由MALDI-TOF-MS改进而成，其实行的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱，将芯片技术和质谱技术相结合，分析过程中不破坏蛋白质，整合了蛋白质样品处理、生物分子反应、检测分析过程于一体，实现了高效、快速、高通量的检测．在蛋白质鉴定技术中有其独特的优点。该技术可以在不需对生物样本纯化的前提下直接检测其中的含有的蛋白质：样品用量少。具有很高的特异性和敏感性。可以检测出低丰度、小分子量的蛋白质；分析速度快，高通量便于自动化，可以同时发现多个生物标记物；可测定疏水蛋白质特别的膜蛋白；此外也不需要特殊的实验室，有利于技术的推广。

3 蛋白芯片在蛋白质组学研究领域的应用

蛋白质组技术包括蛋白质分离技术和鉴定技术。目前，蛋白分离的核心技术是二维电泳，经过蛋白样品的变性，等电聚焦分离，固定pH梯度胶条上泳动，梯度胶条上将出现不同的蛋白质条带，此条带再置于含十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)的聚丙烯凝胶上，根据分子量大小而分离，银染后通常每块胶可显示1 000～3 000个蛋白质点。分离后的蛋白质条带须经特殊的软件和蛋白质组数据库进行分析鉴定。通过差减处理，可展示出不同来源的蛋白质样本间的差异。对感兴趣的蛋白质可根据其等电点和分子质量及其它辅助技术加以确认，这些技术也包括高敏感性的质谱技术。

在基础医学领域，国内外学者利用蛋白芯片技术对相关蛋白质的研究取得了许多突破性的进展。Viard等采用疏水蛋白芯片，利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片仪分离并鉴定了HIV-1融合蛋白，并认为这种方法可用于分析自然折叠的、聚合的、完整的膜蛋白国内学者高燕等 利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术，采用金属离子螯合型芯片成功地实现了对组织中金属硫蛋白的快速分离、纯化和检测。在蛋白质和DNA、RNA相互作用方面，Forde等报道，用DNA覆盖芯片表面，制成生物芯片，以捕获与之有特异性结合能力的蛋白质，并由此建立了一种用于筛查结合到启动DNA序列的转录因子的方法：Tenenbaum等也介绍了用SEI DI纯化和鉴定内源性mRNA-蛋白质复合体的方法。

4 SELDI蛋白质芯片技术的优势及目前存在的问题

4.1 SELDI蛋白质芯片在蛋白质组学研究中的能力、优势 (1)SELDI化学表面芯片可直接用粗生物样品如血清、尿、体液进行分析。(2)所需样本量小，一般只需1~2 ml天然样本。(3)鉴定所获得的信息量大，可直观显示样品中各种蛋白质的相对分子量、含量、等电点、糖基化位点、磷酸化位点等信息，并可发现低丰度、小分子量的蛋白质。(4)可自动化操作，具有高通量的验证能力，大大加快了工作量，提高了工作效率。(5)在同一系统中集分离、 纯化、鉴定、检测和数据分析为一体，从而使整个检测，鉴定过程变得简单易行。

4.2 SELDI蛋白质芯片技术目前存在的问题

目前，SELDI蛋白质芯片还有许多不够完备之处。在实际操作中，不同研究者对同一研究对象所得质谱峰的鉴别常常不一致，再加上质谱本身是一种定性技术，顶峰高度和分子丰度之间的关系往往不呈线形关系，而是非常复杂的，因此难以将二者简单地等同起来。而且，不同研究者对同一疾病的最佳样品的准备也有差异，而样品的不同准备和处理常常影响结果的鉴定。另外，由于操作的高度精密性以及众多的影响因素，使得不同实验室之间的数据不容易重复，从而使得进一步确认变得困难。在以后的发展中，应逐步克服这些不足之处，比如加大芯片摄取蛋白质的数目和种类，尽可能多的捕获蛋白质组信息，实现高通量；进一步简化操作过程，设计试剂盒，切实做到快速准确；规范操作程序及实验环境，尽量使其具有好的重复性等，使之真正成为一项对临床及科研有意义的技术方法。

5 SELDI-TOF-MS技术的发展前景

蛋白芯片技术最近几年的发展极为迅速，该技术是当前临床蛋白质组学研究中比较理想的一种技术平台，由于该技术不完全依赖于蛋白质的构象，从而优于那些源于抗原抗体相互作用的普通蛋白质芯片。它的发展将会为蛋白质组学的研究提供更强有力的工具，但也存在一些问题，如目标蛋白的纯化、试验的标准化和数据报告的规范化、大量数据的处理和分析软件的开发、高度集成化样品的制备及检测仪器的研制和开发、检测灵敏度的提高等，这些问题不仅在某些程度上限制了蛋白芯片技术的发展，还会直接影响该技术临床应用的进程。目前，各芯片技术开发商正针对上述问题加强相关技术研发。通过创立了早期检测研究网络(early detection research network，EDRN)，美国国家癌症研究所在生物标记物研究中发挥了领导作用。这一网络将学术界和生产部门的专家联合起来，以加速生物标记物的研究和论证。它为蛋白质组学加快已发现的蛋白标记物转化为临床早期诊断工具和风险评估提供了公共

平台。

目前，蛋白质芯片技术的发展倾向于加大芯片摄取蛋白的数目和种类；简化操作过程；应用计算机技术对蛋白质芯片进行数模化处理，减少手工图谱处理带来的烦琐程序等。此外，SELDI-TOF-MS技术仅能给出蛋白质的分子量，而在蛋白质的序列、构象等方面还无法给出描述，还需要和双向凝胶电泳(two-dimensional gel dectrophoresis)、酵母双杂交(yeast

two-hybird)、生物信息技术结合使用。随着该技术的迅猛发展，蛋白质芯片技术必将在大规模研究蛋白质性质、蛋白质之间相互作用及肿瘤标志物方面更加特异、快捷、自动化，从而推动疾病尤其是肿瘤的早期诊断、药物筛选、个性化药物的研发和应用等领域发生重大革新。

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