2023年8月3日发(作者：)

以对羟基苯甲酸甲酯为内标用HPLC

作者:孟玲，王永庆，李娜，贾楠，陈玲

【摘要】 目的 建立用内标法测定人血浆中氟康唑浓度的HPLC-UV方法。方法 以对羟基苯甲酸甲酯为内标，血浆用氨水碱化后，用乙酸乙酯提取，测定血浆中氟康唑的浓度。结果 血浆中杂质不干扰样品峰和内标峰，、、μg/ml的回收率分别为%，%及%；批内精密度均小于8%(高、中、低浓度分别为%，%及%)，批间精密度均小于10%(高、中、低浓度分别为%，%及%)，最低检测限为μg/ml，线性范围为～μg/ml；血浆中氟康唑冻融是稳定的；精密度也符合要求。结论 该方法稳定且精密度好，准确可靠，适用于氟康唑血浆浓度测定。

【关键词】 氟康唑；对羟基苯甲酸甲酯；高效液相色谱-紫外；内标

Determinationthehumanplasmacontentoffluconazoleusingthemethylparahy-droxybenzoateasainternalstandardbyHPLC-UVmethod

【Abstract】 Objective Toestabls Theplasmawasalkalifiedbyammoniumhydroxide，andfluconazolewasextractedbyaceticether； andmethylparahydroxybenzoatewasuseda1 / 6 concens Thechromatographicpeakryrateof、、μg/mlwas%，%and%，ioninorbetweenbatchwaslessthan%and%，detectablelimitwasμg/mlandlinearrangewas～μg/sion Themethodwasreliableandstable，itwassuitablefordeterminationtheconcentrationoffluconazoleinplasma.

【Keywords】 fluconazole；methylparahydroxybenzoate；HPLC-UV；internalstandard

氟康唑是新型抗真菌药物，由于其穿透力强，分布容积大，血清消除半衰期长，故具有长效特点，可用于多种组织器官深部真菌感染的治疗，具有一定的临床价值。文献报道的检测方法有微生物法、GC法和高效液相法。高效液相法是常用的血浆氟康唑的检测方法，有外标法和内标法，常用内标有非那西丁［1］、美托洛尔［2］、氨苯蝶啶［3］和MHD［4］。本文采用HPLC-UV法，以对羟基苯甲酸甲酯为内标，测定氟康唑血药浓度。

1 实验材料

2 / 6 试验药品 氟康唑标准品：中国药品生物制品检定所提供，用超纯水配制成相当于/ml贮备液。临用时稀释至相应的浓度。对羟基苯甲酸甲酯(内标)江苏省药品检验所提供，用甲醇配制成相当于μg/ml贮备液。

试剂 乙腈，FisherCompany，Inc，USA；其余试剂均为市售分析纯。

仪器 导津高效液相色谱仪；Milli-QGradientA10超纯水器。

2 血浆中氟康唑的HPLC法测定

色谱条件 流动相由/LKH2PO4(磷酸调pH=)和乙腈组成，流速ml/min；色谱柱为AlltimaC18μm250mm×；柱温箱温度30℃；检测波长261nm。

血浆样品的提取与分离 精密吸取血浆置15ml玻璃离心管中，加入10μl对羟基苯甲酸甲酯，涡漩混匀30s，加入200μl氨水，振荡混匀30s，加入5ml乙酸乙酯，振荡3min，3500rpm离心10min，取有机层挥干，残渣用100μl流动相溶解，15000rpm离心10min，取上清液20μl进样分析。

方法的专属性 在本试验条件下，氟康唑和对羟基苯甲酸甲酯有较大的色谱峰和较好的分离度，血浆中杂质不干扰样品峰和内标峰，基线噪音小，氟康唑和对羟基苯甲酸甲酯的保留时间分别约为和(见图1)。

3 / 6 图1 氟康唑色谱图

A.空白人血浆；B.标准品；C.人空白血浆+标准品；1.氟康唑2.对羟基苯甲酸甲酯

血浆中氟康唑标准工作曲线制备及其最低检测浓度测定 取空白血浆，加不同量的标准品，使其浓度分别为、、、、和μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品和内标峰面积，计算样品/内标峰面积比值R样品/内标，利用样品浓度C对比值R样品/内标作直线回归，得回归方程：

R样品/内标=，r=，(Ｐ

图2 血浆中氟康唑工作曲线

回收率测定 按标准曲线测定方法配制，，μg/ml的3种不同浓度的血浆样本各5份。按“血浆样品的提取与分离”项下进行测定，记录样品和内标色谱峰面积，计算比值。另用水代替血浆同样方法配制相应浓度的氟康唑溶液进样测定，以此为标准，将两组峰面积比值进行比较计算氟康唑的回收率，高、中、低浓度的回收率分别为：%，%及%。

方法的精密度试验 按标准曲线测定方法配制，，μg/ml的3种不同浓度的血浆样本，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，进行色谱分析测定。每个分析批3个浓度各配制5份，连续测定3个分析批，分别计算批内和批间精密度，高、中、低浓度的批内精密度分别为：%，%及%；4 / 6 高、中、低浓度的批间精密度分别为：%，%及%。

稳定性试验 按标准曲线测定方法配置，，μg/ml的３种不同浓度的血浆样本各10ml。各浓度取1ml按“血浆样品的提取与分离”项下操作，处理后立即测定，另取1ml常温放置8h后按血浆样品处理方法处理后测定，剩余血浆冷冻贮藏，并分别于第3、6、10天取出血浆解冻，各取1ml按血浆样品处理方法处理后测定，计算平均值和精密度，高、中、低浓度的血样稳定性精密度分别为：%，%及%。表明稳定性良好。

将第0天处理好的稳定性样品放置于冰箱冷藏室，分别于第2、4、6、8h测定该份样品，考察其样品放置的稳定性。高、中、低浓度的样品放置稳定性精密度分别为：%，%及%。样品在8h内稳定。

准确度试验 按标准曲线测定方法配制，，μg/ml的3种不同浓度的血浆样本，重复测定5次，计算其平均值和精密度，高、中、低浓度的准确度的变异系数分别为：%，%及%。表明准确度较好。

3 讨论

本研究建立的HPLC-UV法采用对羟基苯甲酸甲酯作内标，先用氨水碱化血浆，然后用乙酸乙酯提取。所得氟康唑和内标对羟基苯甲酸甲酯色谱峰形对称且无肩峰，采用峰面积比对浓度回归，相关性较好。自动进样器的应用减少了人为误5 / 6 差，明显提高了效率和精确度。

本方法稳定性好，特异性高，信/噪比>3，无杂质干扰。方法稳定且精密度良好(误差【参考文献】

1 王蔚青，张宏文，刘广余，等.氟康唑胶囊剂的人体生物利用度及生物等效性研究.抗感染药学，XX，1(3)：110-114.

2 王雪丁，黄丽慧，曾桂雄，等. 氟康唑胶囊的人体药代动力学及其生物利用度比较. 中国临床药理学杂志，2002，18：207-210.

3 王小林，季颖，江志强，等.氟康唑胶囊的人体生物等效性评价.中国临床药学杂志，XX，12(5)：280-283.

4 邱相君，李艳，徐鹏，等.两种氟康唑胶囊的人体生物等效性研究.医药导报，XX，24(11)：984-986.

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