2024年5月8日发(作者：hd4000能玩什么游戏)

乳铁蛋白调节肠道菌群功能研究

杨雪珍; 戴亚妮; 徐凤莲; 于添; 李浩杰; 林树茂; 张辉华; 刘燊

【期刊名称】《《家畜生态学报》》

【年(卷),期】2019(040)011

【总页数】5页(P34-38)

【关键词】人乳铁蛋白; 牛乳铁蛋白; 人体推荐量; 肠道菌群

【作 者】杨雪珍; 戴亚妮; 徐凤莲; 于添; 李浩杰; 林树茂; 张辉华; 刘燊

【作者单位】佛山科学技术学院 广东佛山528000; 无锡科捷诺生物科技有限责任

公司 江苏无锡214145

【正文语种】中 文

【中图分类】S811.5

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)，又称乳转铁蛋白(lactotransferrin，LTF)，分子量约

为78 kDa，含690个氨基酸残基[1]，属于铁结合蛋白家族成员，是一类非血红

素铁结合的糖基化蛋白[2]。乳铁蛋白存在于多种组织及其分泌液中，如动物乳汁、

血液、泪液、粘液等，具有多种多样的生物学功能，不但参与铁的转运[3]，而且

具有广谱抗菌[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、调节免疫系统等生理功能[7]，在功能

营养食品和医疗保健方面展现出广阔的应用前景[8]。

目前，市场上供应的主要为牛乳铁蛋白(Bovine Lactoferrin，bLF)，但其在牛乳

中含量低，约在0.03～0.26 g/L之间[9-10]，且是作为乳制品加工的副产物而纯

化获得，满足不了市场需求。因此，人们一直尝试利用基因工程方法生产活性更高、

免疫原性更低的人乳铁蛋白(Human Lactoferrin，hLF)。迄今，已有多种表达系

统共存[11-13]，但采用动物生物反应器表达技术则更具竞争力[14-15]。

2008年，研究人员利用体细胞克隆和细菌人工染色体表达载体，获得人乳铁蛋白

转基因奶牛，表达量达到3.4 g/L，理化性质及生物功能分析表明，重组人乳铁蛋

白与天然人乳铁蛋白的氨基酸序列，二级结构一致，具有相似的抑菌活性，消化稳

定性，铁离子结合和释放活力[15]，以及相似的糖基化修饰[16]，且能够促进成骨

细胞的增殖分化[17]。营养学评价表明人乳铁蛋白乳粉蛋白功效和其它组相比并无

较大区别[18]。亚慢性毒性研究表明未发现人乳铁蛋白奶粉对实验动物有亚慢性毒

性[19]。较长期喂养研究表明，饲喂人乳铁蛋白全乳粉不会出现安全问题，且可以

提高实验动物机体铁的营养状况[20]。

本研究通过保健食品调节肠道菌群功能的动物试验，进一步比较了人乳铁蛋白与牛

乳铁蛋白在调节肠道菌群功能方面的异同，以探索其在改善肠胃道功能方面的产品

开发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 SPF级昆明种雌性小鼠120 只，体质量(20.0±2.0)g，购自上海思

瑞达生物科技有限公司(许可证号：SCXK(沪)2005-0008)。

1.1.2 主要仪器与试剂 SPX-II生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)、YQX-I型

厌氧培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)、BX61 显微镜(日本Olympus公司)、

SW-CJ-2F型超净工作台(苏州市苏净安泰仪器有限公司)、电子天平(瑞士梅特勒托

利多有限公司)。重组人乳铁蛋白(无锡科捷诺生物科技有限责任公司，20150925)，

牛乳铁蛋白(美国，Sigma，LKT L0209)，酪蛋白(武汉万荣科技发展有限公司，

20150708)。

1.2 方法

1.2.1 试验动物喂养及分组 SPF级昆明种雌性小白鼠购入后喂养5 d适应实验环境。

SPF级动物房内单笼饲养，室温20～22 ℃，相对湿度(46～51)% RH。

试验参照中华人民共和国卫生部颁发的《保健食品检验与评价技术规范—调节肠

道菌群功能检测方法》(2003年版)进行，设置人体推荐量的0倍对照组，以及5

倍、10倍、30倍的低、中、高等剂量实验组(表1)。

表1 试验分组及灌胃剂量Table 1 Experimental grouping and intragastric

dose分组Group人体推荐量(倍数)Recommendedamount剂量

/(g/kgobw)Dose对照组Thecontrol00.000低剂量组Lowdosegroup50.125中

剂量组Mediumdosegroup100.250高剂量组Highdosegroup300.750

1.2.2 肠道菌群检验方法 分别称取不同剂量的样品，用纯净水配制成40 mL的样

液，分别供低、中、高三个剂量组动物灌胃使用，每日给予受试物灌胃，给样量根

据每周体重增减调整，连续灌胃14 d。对照组灌服纯净水。在给予受试物之前和

末次给予受试物后24 h，每组无菌采集其中10只小鼠粪便。置已称重的装有玻

璃珠的干燥灭菌小试验管中，再称重，计算出小鼠粪便重量，以灭菌稀释液稀释

10倍，制成均匀悬液，再依次进行10倍系列稀释，选择合适的稀释度，分别吸

取0.1 mL 的菌体稀释液并用各自选择性培养基进行浇注并培养。培养基按《保健

食品检验与评价技术规范--调节肠道菌群功能检测方法》提供的配方进行(表2)。

培养后，计算每克湿便中的菌数，取对数后进行统计处理。比较实验前后自身及组

间双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的变化情况。

1.3 数据处理和统计分析

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析和多重比较分析(Duncan法)，以

P<0.05作为显著性差异，P<0.01作为极显著性差异的判定标准，结果均采用

“平均值±标准差”表示。

表2 菌落计数所用培养基与培养条件Table 2 Culture medium used for colony

counting and its culture conditions菌种Strain培养基Medium培养条件

Cultureconditions温度/℃Temperature时间/hTime条件Conditions双歧杆菌

BifidobacteriaBBL3772厌氧乳杆菌LactobacilliLBS3748有氧肠杆菌

EnterococciEMB3724有氧肠球菌Enterobacteriaceae叠氮钠-结晶紫-七叶苷

3724有氧产气荚膜梭菌ClostridiumTSC3748厌氧

1.4 判定标准

比较试验前后自身及组间双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的变

化情况，试验组试验前后自身比较差异有显著性，或试验后试验组与对照组组间比

较差异有显著性，符合以下任一项，可以判定该受试样品动物试验结果为阳性。

2 结 果

2.1 不同蛋白对小鼠体重的影响

由表3可见，与0倍人体推荐量相比，饲喂5、10、30倍剂量的hLF、bLF、酪

蛋白对小鼠体重的增长无显著性差异。

表3 同蛋白对小鼠体重的影响Table 3 Effect of Different protein on body

weight in mice分组Group剂量(倍数)Dose(times)初始体重/gInitialweight最

终体重/gFinalweight019.96±0.3331.91±0.94人乳铁蛋白

519.97±0.3031.78±1.42hLF1019.96±0.5131.70±2.073019.95±0.4631.66±2.2

8019.99±0.4231.65±1.53牛乳铁蛋白

519.93±0.3631.27±1.47bLF1019.99±0.3731.85±1.873019.75±0.7631.70±1.0

9020.78±0.3030.85±0.67酪蛋白

520.13±0.3630.34±0.62Casein1020.26±0.4230.59±1.313020.12±0.3830.66

±0.86

2.2 不同蛋白对小鼠肠道菌群的影响

由表4可以发现，与0倍人体推荐量相比，饲喂10、30倍剂量的hLF显著增加

了小鼠肠道内容物双歧杆菌的数量(P<0.05)； 饲喂30倍剂量的hLF显著增加了

小鼠肠道内容物乳杆菌的数量(P<0.05)。对于肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌等，

不同剂量的hLF饲喂后，无显著性差异。饲喂10、30倍剂量的bLF显著增加了

小鼠肠道内容物双歧杆菌的数量(P<0.05)； 饲喂30倍剂量的bLF显著增加了小

鼠肠道内容物乳杆菌的数量(P<0.05)。对于肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌等，

不同剂量的bLF饲喂后，无显著性差异。不同剂量的酪蛋白饲喂后，双歧杆菌、

乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌等，均为无显著性差异。

表4 人乳铁蛋白对小鼠肠道菌群的影响菌落对数值Table 4 Effect of hLF on

intestinal flora in mice log cfu/g肠道菌群Intestinalflora剂量(倍

数)Dose(times)人乳铁蛋白hLF试验前Beforetesting试验后Aftertesting牛乳

铁蛋白bLF试验前Beforetesting试验后Aftertesting酪蛋白Casein试验前

Beforetesting试验后

Aftertesting010.18±0.01910.16±0.01310.20±0.00710.22±0.00610.09±0.004

10.18±0.008双歧杆菌

510.18±0.01010.24±0.02010.19±0.00610.25±0.00810.10±0.00710.25±0.01

0Bifidobacteria1010.17a±0.01010.68b±0.03010.19a±0.01010.66b±0.01510.

13±0.01010.25±0.0083010.22a±0.01910.88b±0.01010.29a±0.01010.90b±0.

01010.13±0.00210.27±0.00808.95±0.0108.97±0.0138.95±0.0108.96±0.008

8.93±0.0138.96±0.010乳杆菌

58.92±0.0159.11±0.0108.94±0.0168.99±0.0108.88±0.0088.94±0.006Lactob

acillus109.00±0.01010.08±0.0189.01a±0.0109.12b±0.0108.89±0.0068.98±0

.008308.99a±0.01010.18b±0.0539.04a±0.0910.13b±0.0128.96±0.0059.00±

0.01206.79±0.0106.88±0.0116.80±0.0106.94±0.0116.73±0.0126.93±0.007

肠杆菌

56.81±0.0107.02±0.0136.80±0.0147.04±0.0066.81±0.0106.97±0.010Entero

cocci106.81±0.0107.16±0.0116.79±0.0107.15±0.0106.79±0.0116.99±0.024

306.85±0.0217.24±0.0126.88±0.0117.21±0.0156.87±0.0117.00±0.00805.95

±0.0196.13±0.0115.96±0.0136.12±0.0055.94±0.0136.04±0.006肠球菌

56.00±0.0136.21±0.0076.00±0.0116.16±0.0075.98±0.0066.04±0.005Entero

bacteriaceae106.01±0.0266.15±0.0106.01±0.0126.11±0.0146.02±0.0106.03

±0.006306.06±0.0276.13±0.0156.13±0.0086.11±0.0246.04±0.0056.06±0.01

002.95±0.0053.02±0.0072.99±0.0043.03±0.0052.95±0.0052.98±0.008产气

荚膜梭菌

52.97±0.0123.06±0.0212.98±0.0103.07±0.0162.96±0.0043.00±0.006Clostri

dium103.04±0.0103.06±0.0153.04±0.0063.07±0.0072.97±0.0052.94±0.008

303.00±0.0053.11±0.0083.06±0.0043.10±0.0042.98±0.0072.97±0.004

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Notes：Values with different lowercase superscripts in the samerow differ

tignificantly(P<0.05)，The same below.

2.3 不同蛋白对双歧杆菌与乳杆菌的影响

由表5可见，与饲喂bLF组相比，饲喂5、10、30倍的hLF组小鼠肠道内容物双

歧杆菌数量均无显著性差异；而饲喂5、10、30倍的酪蛋白组则显著性地降低了

双歧杆菌数量(P<0.05)。与饲喂bLF组相比，饲喂10、30倍的hLF组小鼠肠道

内容物乳杆菌数量均无显著性差异；而饲喂10、30倍的酪蛋白组则显著性地降低

了乳杆菌数量(P<0.05)。

表5 饲喂不同的蛋白对小鼠肠道双歧杆菌和乳杆菌数量的影响(菌落对数值)Table

5 Effect of feeding different proteins on the number of Bifidobacteria and

Lactobacillus in mice log cfu/g剂量(倍数)Dose(times)双歧杆菌

Bifidobacteria51030乳杆菌

Lactobacillus51030bLF10.25a±0.00810.66a±0.01510.90a±0.0128.99±0.010

9.12a±0.01010.13a±0.012hLF10.24a±0.02010.68a±0.03010.88a±0.0108.99

±0.0109.12a±0.01010.13a±0.012酪蛋白

10.25b±0.01010.25b±0.00810.27b±0.0088.94±0.0068.98b±0.0089.00b±0.0

12

3 讨 论

虽然已有许多研究表明，乳铁蛋白可促进动物肠道中有益菌生长和抑制有害菌生长，

提高十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度/隐窝深度比值，提高动物生长性能等作用

[21-23]。然而，动物实验依然是经典而可靠的用于保健食品检验与评价的手段

[24]，至今尚未有转基因牛来源的重组人乳铁蛋白依据《保健食品检验与评价技术

规范》(2003年版)而开展调节肠道菌群功能研究的实验报告。

本试验以牛乳铁蛋白为阳性对照，以酪蛋白为阴性对照，主要目的是研究重组人乳

铁蛋白其对小鼠肠道菌群的调节功能，以及其与牛乳铁蛋白在调节肠道功能上的差

异，以推进重组人乳铁蛋白在保健产品的开发应用。结果表明，重组人乳铁蛋白与

牛乳铁蛋白具备几乎相同的调节肠道菌群功能，剂量水平为大于10倍人体推荐量，

主要表现在促进了双歧杆菌和乳杆菌的数量增加。由于目前市场上应用的主要为牛

乳铁蛋白，其提取成本高，价格昂贵，严重限制了乳铁蛋白保健品的开发应用。本

研究首次证明了在调节肠道菌群功能方面，重组人乳铁蛋白可以完全替代牛乳铁蛋

白，从而充分发挥其高表达量达(3.4 g/L)的技术优势。该研究将与重组人乳铁蛋白

的抗氧化活性研究[5]、作为化妆品新原料的安全性评价[25]、大鼠致畸试验[26]、

皮肤变态反应和皮肤光变态反应试验、急性经口毒性和90 d喂养试验、遗传毒理

试验研究等试验一起，形成系统的研究成果，推动重组人乳铁蛋白保健产品上市。

参考文献：

【相关文献】

[1] KANWAR J R, ROY K, PATEL Y, et al. Multifunctional iron bound lactoferrin and

nanomedicinal approaches to enhance its bioactive functions[J]. Molecules, 2015, 20(6):9

703-9 731.

[2] LAMBERT L A, PERRI H, MEEHAN T J. Evolution of duplications in the transferrin family

of proteins[J]. Comparative Biochemistry Physiology, 2005, 140(1):11-25.

[3] FERNANDEZ-MENENDEZ S, FERNANDEZ-SANCHEZ M L, ALVES PEIXOTO R R, et al. In

vivo study of the effect of lactoferrin on iron metabolism and bioavailability from different

iron chemical species for formula milk fortification[J]. Electrophoresis,2018,39(13),1 702-1

713.

[4] ORSI N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives[J].

Biometals, 2004, 17(3):189-196.

[5] 戴亚妮, 于添, 朱松, 等. 重组人乳铁蛋白抗氧化活性研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2017,

29(3):251-256.

[6] ZHANG Y, LIMA C F, RODRIGUES L R. Anticancer effects of lactoferrin: underlying

mechanisms and future trends in cancer therapy[J]. Nutrition reviews, 2014, 72(12):763-

773.

[7] BAVEYE S, ELASS E, MAZURIER J, et al. Lactoferrin: a multifunctional glycoprotein

involved in the modulation of the inflammatory process[J]. Clinical Chemistry Laboratory

Medicine, 1999, 37(3): 281-286.

[8] WANG B, TIMILSENA YP, BLANCH E, et al. Lactoferrin: structure, function, denaturation

and digestion[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2017, 9:1-17.

[9] 孙国庆, 康小红, 刘卫星. 牛乳中乳铁蛋白含量变化规律的研究[J]. 食品研究与开发, 2010(5):

171-173.

[10] HYVONEN P, SUOJALA L, HAARANEN J, et al. Human and bovine lactoferrins in the

milk of recombinant human lactoferrin-transgenic dairy cows during

lactation[J].Biotechnology Jorunal, 2006, 1(4): 410-412.

[11] WARD P P, PIDDINGTON C S, CUNNINGHAM G A, et al. A system for production of

commercial quantities of human lactoferrin: a broad spectrum natural antibiotic[J].

Biotechnology (Nature Publishing Company), 1995, 13(5): 498-503.

[12] HUANG J, NANDI S, WU L, et al. Expression of natural antimicrobial human lysozyme

in rice grains[J]. Molecular Breeding, 2002, 10(1-2): 83-94.

[13] SALMON V, LEGRAND D, SLOMIANNY M C, et al. Production of human lactoferrin in

transgenic tobacco plants[J]. Protein Expression and purification, 1998, 13(1):127-135.

[14] VAN BERKEL P H, WELLING M M, GEERTS M, et al. Large scale production of

recombi4nant human lactoferrin in the milk of transgenic cows[J]. Nature Biotechnology,

2002, 20(5): 484-487.

[15] YANG P, WANG J, GONG G, et al. Cattle mammary bioreactor generated by a novel

procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human

lactoferrin[J]. PLoS One, 2008, 3(10): e3453.

[16] YU T, GUO C, WANG J, et al. Comprehensive characterization of the site-specific N-

glycosylation of wild-type and recombinant human lactoferrin expressed in the milk of

transgenic cloned cattle[J]. Glycobiology, 2011, 21(2): 206-224.

[17] LI Q, ZHAO J, HU W, et al. Effects of Recombinant Human Lactoferrin on Osteoblast

Growth and Bone Status in Piglets[J]. Animal Biotechnology,2018，29(2):90-99.

[18] 令狐丽琴，毛德倩，李敏，等. 含重组人乳铁蛋白乳粉蛋白质营养学评价[J]. 中国食品卫生杂

志, 2016(1): 11-15.

[19] 王静，周催，车会莲. 含转人乳铁蛋白奶粉对SD大鼠亚慢性毒性的研究[J]. 现代生物医学进展,

2010(15):2 809-2 813.

[20] 祁潇哲，王静，周催，等. 较长期喂养转人乳铁蛋白全乳粉对SD大鼠血清铁、铁蛋白含量的

影响[J]. 食品科学, 2010(23): 340-343.

[21] 李美君，方成堃，张凯，等. 饲粮中添加乳铁蛋白对早期断奶仔猪生长性能、肠道菌群及肠黏

膜形态的影响[J]. 动物营养学报,2012,24(1):111-116.

[22] HU W, ZHAO J, WANG J, et al. Transgenic milk containing recombinant human

lactoferrin modulates the intestinal flora in piglets[J]. Biochemistry and Cell Biology, 2012,

90(3): 485-496.

[23] COOPER C A, MAGA E A, MURRAY J D. Consumption of transgenic milk containing

the antimicrobials lactoferrin and lysozyme separately and in conjunction by 6-week-old

pigs improves intestinal and systemic health[J]. The Journal of Dairy Research, 2014,

81(1):30-37.

[24] PARIZA M W. Perspective on the safety and effectiveness of conjugated linoleic

acid[J]. The american journal of clinical nutrition, 2004, 79(6):1 132-1 136.

[25] 戴亚妮, 杨雪珍, 王建武, 等. 重组人乳铁蛋白作为化妆品新原料的安全性评价[J]. 中国卫生检验

杂志,2017(13):1 851-1 854.

[26] 于添, 刘燊, 王建武, 等. 重组人乳铁蛋白大鼠致畸试验[J]. 毒理学杂志,2017(3):247-250.