2024年4月22日发(作者：诺基亚220 4g)

454

TianjinMedJ,May2023,Vol.51No.5

细胞与分子生物学

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs后细胞矿化的实验研究

宁寅宽，刘林志

△

，陈贤平

摘要：目的探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化后细胞矿

化的能力。方法密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs，流式细胞仪检测细胞表面标记。将BMSCs分为

空白对照组（未转染）、Lv-EGFP组［转染仅携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的慢病毒］和Lv-BMP2/EGFP组（转染

携带BMP2和EGFP基因的慢病毒）。免疫组织化学染色、RT-PCR、Westernblot检测BMP2蛋白和基因表达情况；SP

法检测Ⅰ型胶原蛋白表达；茜素红染色法检测矿化结节形成；于转染第7、14、21天检测细胞碱性磷酸酶（ALP）水平；

通过扫描电镜和能谱分析进一步观测矿化结节表面微观形貌及其主要元素构成。结果流式细胞仪检测显示第

5代BMSCs的细胞表面CD44、CD29表达呈阳性，CD45表达呈阴性；免疫组织化学染色、RT-PCR、Westernblot显示

Lv-BMP2/EGFP组较Lv-EGFP组及空白对照组能高效表达BMP2目的蛋白和基因，转染第7、14、21天ALP水平较其

余2组升高，Ⅰ型胶原染色及茜素红染色均呈阳性，扫描电镜下见矿化结节散布于成骨方向分化的细胞中，细胞叠加

生长，基质分泌旺盛，能谱分析显示其表面为钙、磷沉积物，其钙磷比值为1.52±0.13，发生了细胞矿化。结论BMP2

重组慢病毒转染兔BMSCs能成功诱导其向成骨方向分化并发生细胞矿化。

关键词：骨形态发生蛋白质2；慢病毒载体属；转染；间充质干细胞；生物矿化；基因治疗

中图分类号：R394.2文献标志码：ADOI：10.11958/20221496

NINGYinkuan,LIULinzhi

△

,CHENXianping

DepartmentofVascularSurgery,ShaoyangCentralHospital,Shaoyang422000,China

△

CorrespondingAuthorE-mail:

Abstract:ObjectiveToinvestigatethecellmineralizationabilityofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcells

(BMSCs)transfesThe5thgenerationrabbit

BMSCswereobtainedbydensitygradientcentrifugationandadherentculture,andcellsurfacemarkersweredetectedby

eredividedintotheblankcontrolgroup(untransfected),theLv-EGFPgroup(transfectedlentivirus

withoutBMP2gene)andtheLv-BMP2/EGFPgroup[transfectedlentiviruscarryingBMP2andenhancedgreenfluorescent

基金项目：广西自然科学基金资助项目（2014GXNSFAA118263）

作者单位：邵阳市中心医院血管外科（邮编422000）

作者简介：宁寅宽（1986），男，主治医师，主要从事生物材料、血管与骨组织工程、生物矿化方面研究。E-mail：

△

Experimentalstudyonthemineralizationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsafter

transfectionwithBMP2recombinantlentivirus

通信作者E-mail：

disease［J］.FrontPharmacol，2021，12：：10.3389/

fphar.2021.642900.

［17］SONGQ，PENGS，einprotectsagainstMPP

+

/MPTP

-

inducedneurotoxicitybyamelioratingoxidativestressinSH-SY5Y

cellsandmousemodelofParkinson'sdisease［J］.Neurotoxicology，

2021，87：：10.1016/.2021.10.003.

［18］FAKHRIS，IRANPANAHA，GRAVANDIMM，l

productsattenuatePI3K/Akt/mTORsignalingpathway：Apromising

strategyinregulatingneurodegeneration［J］.Phytomedicine，2021，

91：：10.1016/.2021.153664.

［19］BULL，LIUYQ，SHENY，rotectionofexendin-4by

enhancedautophagyinaParkinsonianratmodelofα-

synucleinopathy［J］.Neurotherapeutics，2021，18（2）：962-978.

doi：10.1007/s13311-021-01018-5.

［20］YAND，MAZ，LIUC，xineBamelioratesHMGB1-

dependentautophagydysfunctionduringmanganeseexposurein

SH-SY5Yhumanneuroblastomacells［J］.FoodChemToxicol，

2019，124：：10.1016/.2018.12.027.

［21］GIACOPPOS，BRAMANTIP，ringof

inflammasomebyimpairedautophagyinresponsetoacute

experimentalParkinson'sdisease：involvementofthePI3K/Akt/

mTORpathway［J］.Neuroreport，2017，28（15）：：

10.1097/WNR.0871.

［22］WANGSJ，WANGQ，MAJ，ofmoxibustiononmTOR-

mediatedautophagyinrotenone-inducedParkinson'sdisease

modelrats［J］.NeuralRegenRes，2018，13（1）：：

10.4103/1673-5374.224380.

［23］ENOGIERUAB，HAYLETTW，HISSDC，tionof

AKT/AMPKsignaling，autophagyandmitigationofapoptosisin

Rutin-pretreatedSH-SY5YcellsexposedtoMPP［J］.MetabBrain

Dis，2021，36（2）：：10.1007/s11011-020-00641-z.

［24］ZHOUJ，ZHAOY，LIZ，-103a-3pregulatesmitophagyin

Parkinson'sdiseasethroughParkin/Ambra1signaling［J］.Pharmacol

Res，2020，160：：10.1016/.2020.105197.

（2022-09-29收稿2022-11-21修回）

（本文编辑李国琪）

天津医药2023年5月第51卷第5期

protein(EGFP)gene].Immunohistochemicalstaining,RT-PCRandWesternblotassaywereusedtodetecttheexpressionof

ressionoftypeⅠinredstainingwasusedto

nephosphatase(ALP)levelsweredetectedat7,14and21daysafter

facemorphologyandmainelementcompositionofmineralizednoduleswerefurtherobservedby

sFlowcytometryshowedthattheexpressionsofCD44

andCD29onthesurfaceofBMSCsofthe5thgenerationwerepositive,whiletheexpressionofCD45wasnegative.

Immunohistochemicalstaining,RT-PCRandWesternblotassayshowedthattheLv-BMP2/EGFPgroupcouldefficiently

expressBMP2targetproteinandgenecomparedwiththeLv-EGFPgroupandtheblankcontrolgroup,andthelevelofALP

washigherintheLv-BMP2/EGFPgroupthanthatoftheothertwogroupsonthe7th,14thand21stdaysaftertransfection,

andtypeⅠcanningelectronmicroscope,mineralizednodes

werescatteredinosteoblastdifferentiatedcells,cellsgrewsuperposition,spectrum

analysisshowedthatthesurfaceofcellswascalciumandphosphorusdeposits,andtheratioofcalciumtophosphoruswas

1.52±sionAftertransfectingrabbitBMSCswithBMP2recombinant

lentivirus,rabbitBMSCscanbesuccessfullyinducedtodifferentiateintoosteogenicdirectionandmineralizationinvitro.

Keywords:bonemorphogeneticprotein2;lentivirus;transfection;mesenchymalstemcells;biomineralization;genetic

therapy

置荧光显微镜（日本Olympus公司），场发射扫描电镜（荷兰飞

目前在组织工程研究领域，骨髓间充质干细胞

利浦公司），X射线能谱分析仪（英国牛津公司），BMP2重组

（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）是比较理想的

慢病毒构建和鉴定（上海吉凯基因化学技术有限公司）。

种子细胞之一，骨形态发生蛋白（bonemorphogenic

1.2方法

proteins，BMP）已被证实能调控BMSCs向成骨方向

1.2.1兔BMSCs的获取及鉴定清洁级雄性6月龄新西兰

分化，BMP2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最

大白兔1只，体质量1.2kg，购自桂林医学院动物实验中心，

［1-2］

强的BMP。天然BMP2在体内无法实现缓释，不

实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2013-0001，按照实验动

能持续诱导BMSCs的成骨分化，如何获得持续、高

物伦理学标准执行。采用密度梯度离心及贴壁培养法获取

［3］

效及稳定表达的内源性BMP2是目前研究的热点。

第5代兔BMSCs，无菌条件下穿刺兔双侧股骨干骺端，获取骨

髓约5mL，离心后弃上清液（1500r/min，5min），用比重为

细胞矿化与普通的地质矿化的最大区别是无机相结

1.073g/mL的percoll分离（2500r/min，20min）兔BMSCs，取

晶严格受生物体分泌的有机质控制，骨骼中的羟基

52

界面处细胞层，离心后洗涤，以2×10个/cm的密度接种于

磷灰石形成作为细胞矿化最普遍的表现形式，亦受

2

25cm

塑料培养瓶，72h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以

到广泛关注

［4-5］

。既往学者们缺乏对BMSCs生物矿

后每1d更换细胞培养液1次。细胞生长到80%汇合时1∶2

化现象的深入研究。本研究通过将BMP2重组慢病

传代培养，传至第5代进行后续实验研究。取第5代细胞制

毒载体导入兔BMSCs，观察BMP2重组慢病毒转染

成细胞悬液，按操作说明分别标记CD44/CD45、CD29-

细胞向成骨方向分化后细胞矿化的能力，初步尝试

PerCP，流式细胞仪上机检测，实验重复3次。

使用扫描电镜能谱分析技术研究BMSCs生物矿化

1.2.2兔BMSCs的分组及转染实验分为3组：空白对照组

现象，为干细胞基因治疗和临床转化提供理论

（未转染）；Lv-EGFP组［阴性对照组，转染仅携带增强绿色荧

光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）基因的慢病

依据。

455

1材料与方法

1.1试剂与仪器低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（美国

HyClone公司）；流式一抗小鼠抗兔CD44、CD45、CD29（美国

Antigenix公司），同型对照小鼠抗兔IgG1（eBioscien公司），流

式二抗PerCP标记（Jackson公司）；BMP2单克隆抗体（美国

Bioworld公司），山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶标记、DAB

显色试剂盒、二抗FITC标记IgG（北京中杉金桥公司），Ⅰ型

胶原单克隆抗体（武汉博士德），茜素红（美国Sigma）；碱性磷

酸酶（ALP）测试盒（南京建成生物工程研究所），总RNA提取

试剂盒（北京天根生化科技有限公司），HiFi-MMLV逆转录

cDNA合成试剂盒（上海英俊生物技术有限公司），2×EsTaq

MasterMixPCR试剂盒（北京康为世纪生物技术公司），DNA

Marker、2×TapPCRMix（北京艾德莱生物科技有限公司），倒

毒）；Lv-BMP2/EGFP组（实验组，转染携带BMP2和EGFP基

因的慢病毒）。第5代兔BMSCs以5×10

4

个/孔接种于6孔板，

细胞培养汇合至80%左右，根据前期实验数据以感染复数

（MOI=100）转染细胞，转染24h后换液，48h后在倒置荧光显

微镜下观察细胞形态并计算细胞转染效率（绿色荧光蛋白细

胞数/视野内细胞总数×100%），实验重复3次。

1.2.3免疫组织化学染色检测BMP2表达分别随机取转染

72h后细胞，胰酶消化细胞爬片，浸入40g/L多聚甲醛，按SP

免疫组织化学染色法操作，DAB显色，封固，在倒置显微镜

观察。

1.2.4RT-PCR检测BMP2基因的表达转染后72h提取

3×10

6

个细胞总RNA，根据RNA提取试剂盒操作步骤，通过

凝胶电泳进行质量检测，使用分光光度计进行纯度浓度测

定。按照MMLV逆转录cDNA合成试剂盒说明书合成第1条

456

TianjinMedJ,May2023,Vol.51No.5

链cDNA。设计引物：GAPDH引物（正义链5'-CCAGAA⁃

CATCCCTGCCTC-3'，反义链5'-TAGCCAAATTCGTTGT⁃

CATACCA-3'），BMP2引物（正义链5'-ACTACCAGAAAC⁃

GAGTGGGAA-3'，反义链5'-GCATCTGTTCGGAAAACCT-

3'）。按照2×TaqPCRMasterMix试剂盒说明书进行PCR扩

增。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，调电泳仪各参数进

行电泳（U：220V；I：140mA；T：30min），电泳结束，凝胶成像

系统分析目的基因与对应内参光密度比值确定基因相对表

达量，相对表达量=目的基因条带OD值/对应内参照基因条

带OD值。反应条件：95℃预变性10min，94℃变性30s，

60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃终延伸

5min。测量结果重复3次。

1.2.5Westernblot检测BMP2蛋白表达转染后48h，根据

实验分组分别取2×10

6

个细胞，裂解液提取细胞总蛋白，按

BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白含量。取30µg上样，

10%SDS-PAGE电泳后转模，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加

一抗BMP2单克隆抗体室温下摇床震荡孵育1h，与辣根过

氧化物酶标记二抗孵育1h进行抗体杂交，ECL发光孵育

1min，曝光5min，暗室内压片，显影定影，凝胶成像仪对蛋白

印迹进行成像，以内参光密度值为标准，计算每组蛋白相对

表达量，测量结果重复3次。

1.2.6兔BMSCs的成骨分化检测6孔板内预先放置消毒好

的塑料盖玻片，按实验分组，以1×10

5

个/孔接种6孔板进行塑

料细胞爬片培养。分别于第14、21天，随机取爬片，按试剂盒

说明书，行SP法检测Ⅰ型胶原蛋白表达、茜素红染色检测矿

化结节形成。分别于第7、14、21天，各组随机取3孔，按ALP

试剂盒说明操作，实验重复3次，计算ALP含量。

1.2.7扫描电镜和能谱分析观测矿化结节表面微观形貌及

其元素构成第21天随机取实验组塑料细胞爬片，固定后梯

度丙酮逐级脱水，临界点干燥，表面进行喷镀，在Quanta200

FEG场发射环境行扫描电镜观察和主要元素能谱分析。X射

线能谱分析仪测定微区主要元素（碳、氮、氧、钙、硫、磷）的质

量百分比和原子个数百分比，测定结果重复3次。计算钙磷

比（Ca/P）=钙元素质量百分比∶磷元素质量百分比，并打印出

300

250

200

150

100

50

0

250

200

C

o

u

n

t

150

100

50

P2

P3

400

350

300

250

200

150

100

50

0

P2

能谱分析图。

1.3统计学方法采用SPSS25.0软件进行数据分析。计量

资料以

x±s

表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间多

重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1BMSCs细胞表面标志物表达特征流式细胞

仪分析显示第5代兔BMSCs的CD44、CD29表达呈

阳性，CD45表达呈阴性，CD44、CD29、CD45阳性细

胞分别占92.20%±1.12%，76.30%±0.78%，0.26%±

0.11%，BMSCs的细胞表面标志物符合BMSCs的特

征，见图1。

2.2BMSCs转染后细胞形态转染48h后，Lv-

BMP2/EGFP组、Lv-EGFP组细胞在倒置荧光显微镜

下观察到荧光，目的基因BMP2和EGFP报告基因成

功修饰入细胞基因组，转染效率分别为95.32%±

1.05%和95.18%±0.82%。空白对照组未观察到荧

光。各组BMSCs细胞生长呈长梭形，形态均一，单

个细胞轮廓较清楚，胞浆丰富，核仁明显，细胞呈涡

旋状、放射状密集排列，见图2。

2.3BMP2免疫组织化学染色Lv-BMP2/EGFP组

BMSCs细胞胞浆呈阳性表达，可见棕黄色染色，而

Lv-EGFP组及空白对照组细胞呈阴性，见图3。

2.4BMP2mRNA表达情况Lv-BMP2/EGFP组、

Lv-EGFP组及空白对照组BMP2mRNA相对表达量

分别为0.474±0.008，0.126±0.027和0.095±0.007（n=

3，F=458.641，P＜0.01），Lv-BMP2/EGFP组BMP2

mRNA水平高于Lv-EGFP组及空白对照组（P＜

0.05），且基因条带结果符合扩增片段长度，见图4。

2.5BMP2蛋白表达情况Lv-BMP2/EGFP组、Lv-

EGFP组及空白对照组BMP2蛋白相对表达量分别

P3

300

250

200

150

100

50

0

300

250

200

150

100

50

0

P2

P3

C

o

u

n

t

C

o

u

n

t

C

o

u

n

t

P2

IgG（H+L）

10

2

10

3

10

4

PerCP-A

10

5

10

2

P2

10

3

10

4

PerCP-A

P3

10

5

10

2

10

3

10

4

PerCP-A

10

5

150

P3

C

o

u

n

t

100

50

C

o

u

n

t

P2

P3

BMSCs表型

0

10

2

10

3

10

4

PerCP-A

CD44

10

5

Fig.1

0

10

3

10

4

10

5

10

2

PerCP-A

CD29

ThecharacteristicsofcellsurfacemarkersinBMSCs

图1BMSCs细胞表面标志物表达特征

10

2

10

3

10

4

PerCP-A

CD45

10

5

天津医药2023年5月第51卷第5期

457

Lv-BMP2/EGFP组

Fig.2ThecellmorphologyofBMSCsunderfluorescencemicroscope(×100)

图2BMSCs在倒置荧光显微镜下细胞形态（×100）

Lv-EGFP组空白对照组

Lv-BMP2/EGFP组

Fig.3

图3

C

TheSPimmunochemicalstainingofBMP2expression(DABstanining,×200)

免疫组织化学染色SP法检测BMP2表达（DAB染色，×200）

Lv-EGFP组空白对照组

MAB

GAPDH（348bp）

BMP2（113bp）

M：Mark；A：空白对照组；B：Lv-EGFP组；C：Lv-BMP2/EGFP组。

图4

TheBMP2geneexpressioninBMSCsmeasuredbyRT-PCR

RT-PCR检测BMSCs中BMP2基因表达水平

Lv-BMP2/EGFP组

Fig.4

为0.751±0.057，0.272±0.013，0.305±0.007（n=3，F=

186.426，P＜0.01），Lv-BMP2/EGFP组BMP2蛋白表

达量高于Lv-EGFP组及空白对照组（P＜0.05），

见图5。

ABC

β-actin

BMP-2

Fig.6TheIcollagenimmunohistochemicalstainingofBMSCs(×100)

图6BMSCsⅠ型胶原免疫组织化学染色（×100）

Lv-EGFP组空白对照组

Fig.5

A：空白对照组；B：Lv-EGFP组；C：Lv-BMP2/EGFP组。

图5Westernblot检测BMP2蛋白表达

TheproteinexpressionofBMP2measuredbyWesternblotassay

Lv-BMP2/EGFP组

2.6BMSCs的成骨方向分化Lv-BMP2/EGFP组第

14天塑料细胞爬片在显微镜下观察显示细胞胞浆

出现棕黄色染色颗粒，Ⅰ型胶原SP法免疫组织化学

染色呈阳性表达。第21天茜素红染色呈现阳性，见

形貌各不相同的矿化结节，矿化结节染色后呈现红

色。而Lv-EGFP组及空白对照组Ⅰ型胶原染色和

茜素红矿化结节染色均呈现阴性。见图6、7。细胞

经转染第7、14、21天，Lv-BMP2/EGFP组ALP水平较

Lv-EGFP组及空白对照组升高，见表1。

Fig.7

Lv-EGFP组

图7

ThealizarinredSstainingofBMSCs(×50)

BMSCs茜素红染色（×50）

空白对照组

458

Tab.1

Tab.2

TianjinMedJ,May2023,Vol.51No.5

ComparisonofALPlevelsatdifferenttime

pointsbetweenthethreegroups

U/gprot，x±s）

表1各组不同时间点ALP水平比较

（n=9，

组别

空白对照组

Lv-EGFP组

F

Lv-BMP2/EGFP组

＊＊

Theelementalanalysisofthescannedareaonthe

surfaceofthemineralizednodule

表2矿化结节表面扫描区域元素分析

原子质量百分比（%）

0.41

0.95

2.19

0.23

0.18

0.45

4.42

1.52

原子个数百分比（%）

13.08

25.79

51.93

2.78

2.16

4.27

-

-

第7天

2.88±0.57

2.76±0.50

6.76±0.91

ab

98.659

＊＊

第14天

4.99±0.47

16.42±2.22

ab

222.143

＊＊

4.76±0.50

第21天

5.76±0.50

24.39±2.54

ab

452.715

＊＊

5.71±0.44

元素

CK

NK

OK

PK

SK

ab

P＜0.01；

与空白对照组比较，与Lv-EGFP组比较，P＜0.05。

2.7矿化结节观察和元素能谱分析在扫描电镜

下可见矿化结节相互连接成片状，细胞重叠生长，基

质分泌旺盛，矿化结节散布在重叠细胞中并稍凸出

于细胞层之上，形貌似含沙浆较多的水泥，结构呈现

疏松、粗糙特点，见图8。电镜扫描微区得出能谱分

析图谱，见图9，对应主要元素见表2。矿化结节微

区Ca/P为1.52±0.13。

CaK

Ca/P

总量

表中数据均为能谱仪分析后自动输出。

Fig.8Themicroscopicmorphologyofthemineralizednodulesurface

图8扫描电镜观察矿化结节表面微观形貌

observedbySEM

10µm

电子图像1

Fig.9Theenergyspectrumanalysisofthescannedareaonthe

图9

surfaceofthemineralizednodule

矿化结节表面扫描区域能谱分析图

3讨论

BMSC由于其能较稳定地保持干细胞生物学特

征，为多种病毒载体导入目的基因进行基因治疗奠

定了基础

［6］

。BMP2已被证实能单独诱导BMSCs向

成骨方向分化，但天然BMP2获取困难，价格昂贵，

且局部发挥生物作用有限，因此利用病毒载体导入

目的基因，持续稳定的表达功能蛋白是解决该问题

的有效方法

［7］

。现有研究发现，腺病毒载体系统在

导入目的基因后会因病毒载体导入时间的持续延

长，出现外源基因丢失的现象，从而降低了目的基因

［8］

表达效果。慢病毒载体系统弥补了该缺陷，在目

的基因表达持续时间上更具有优势。Milone等

［9-10］

研究发现慢病毒可高效感染分裂中的BMSCs，成功

把携带的目的基因导入细胞，使目的基因在细胞中

持续、稳定、高效表达，从而进行基因治疗。本课题

组前期研究也表明慢病毒载体系统介导的BMP2基

因相对于腺病毒载体系统，在表达持续时间上更具

有优越性

［11］

。本研究以慢病毒为载体系统，通过基

因转染技术，将携带BMP2基因和EGFP基因载体整

合进入BMSCs中，使其在细胞内能够持续稳定地表

达。EGFP作为一种示踪标记的报告基因，其成功表

达不仅示踪标记了携带BMP2基因细胞的准确位

置，还可直接体现出细胞的转染效率

［12］

。本研究通

过检测BMP2mRNA和蛋白的表达，证实了BMP2重

组慢病毒载体转染BMSCs并诱导细胞成骨方向分

化的可行性。

目前，病毒的转染和BMSCs成骨分化及其观察

的相关技术在国内外已较为成熟，现被普遍认可的

主要有ALP、Ⅰ型胶原蛋白、成骨特异性蛋白（骨形

态生发蛋白、骨桥蛋白等）、相关成骨分化调控因子

（骨钙素泌量、成骨转录因子等）为成骨早期的标志

物，而矿化结节形成可作为成骨晚期的标志物

［13-14］

。

本研究通过检测骨化标志性产物ALP、Ⅰ型胶原及矿

化结节验证BMSCs的成骨分化能力，但这些生物化

学检测方法只能间接反映细胞的成骨方向分化。因

此，本研究同时利用扫描电镜和能谱分析技术，直接

对细胞成骨分化晚期的矿化结节进行观察，对其钙、

天津医药2023年5月第51卷第5期

磷等元素含量进行测定，结果显示矿化结节微区Ca/P

为1.52±0.13，接近羟基磷灰石的钙磷比1.67，说明矿

化结节表面有钙、磷沉积物产生，可能为磷酸钙盐。而

硫、氮、氧、碳元素为有机物主要元素，可能为细胞基质

产生的细胞胶原成分及细胞蛋白复合物的有机成分。

BMSCs向成骨分化后的细胞矿化是其主导骨形

成的前提与基础

［4］

。在细胞矿化过程中，其最基本

的生物学特征是骨基质合成、分泌及成熟，而矿化结

节是成骨细胞分化的成熟标志，同时也是成骨细胞

行使成骨功能的主要形态学表现

［15］

。细胞矿化的表

现是细胞外基质的矿化及无机钙、磷盐的沉积，在整

个BMSCs矿化结节形成过程中，细胞和基质起着非

常重要的作用

［16］

。本研究在电镜下观察发现BMSCs

成骨分化晚期，细胞会重叠生长，分泌大量细胞基

质，矿化结节则凸出于细胞层之上，出现磷酸钙盐堆

积，结构呈现疏松、粗糙，说明BMSCs成骨分化后细

胞和细胞基质在细胞矿化过程中发挥重要作用。发

生细胞矿化的细胞通过大量分泌细胞基质，被自身

大量分泌的细胞基质包裹围绕，从而使局部细胞基

质浓缩集中成沉淀的磷酸钙盐离子，使磷酸钙盐离

子结晶导致矿化结节形成。其形成机制可能为矿化

后的BMSCs细胞内高表达ALP，从而促进细胞基质

的矿化，且其分泌的Ⅰ型胶原蛋白是构成矿化结节

的蛋白支架，Ⅰ型胶原蛋白支架与钙、磷无机盐亲

和，形成磷酸钙盐矿化结节。BMSCs发生细胞矿化

的分子调控机制可能是由于细胞矿化过程中编码细

胞外基质成熟的基因表达增加，而与细胞增殖相关

的基因表达下降，且与细胞内ALP活性、骨钙素合成

及细胞外基质促进羟基磷灰石沉积的基因表达相

关

［17］

。BMSCs成骨方向分化后的矿化过程实质上为

钙、磷无机盐在细胞基质内沉积的过程，整个矿化过

程始终伴随着钙、磷等元素的动态变化

［18］

。

综上所述，BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs后，

BMP2基因整合入细胞基因组中，高效表达BMP2功

能蛋白，诱导细胞向成骨方向分化并发生细胞矿化，

在细胞矿化过程中通过细胞基质对无机盐离子的浓

集、沉淀，最终形成无机磷酸钙盐的矿化结节，其钙

磷比值非常接近人和动脉骨骼中的主要无机磷酸钙

盐羟基磷灰石的成分比值，说明其存在一定联系，需

要后续深入研究。

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（2022-09-16收稿2022-11-18修回）

（本文编辑李志芸）