2024年3月16日发(作者：一加8上市时间)

下调N-cadherin表达对裸鼠原位种植人肝癌细胞转移能力

的影响

纪桂宝;游建;黄志勇;占大钱;梁宾勇

【摘 要】目的 研究在裸鼠原位种植人肝癌模型中,下调N-cadherin表达对肝癌转

移能力的影响.方法 通过原位种植的方法,将极弱表达N-cadherin的LM3-N7细

胞与正常表达N-cadherin的LM3-E2细胞分别注射到两组BALB/c裸鼠的肝脏

内,6周后取裸鼠肺、肝内转移灶,通过苏木精-伊红(HE)染色观察肺、肝转移灶的情

况,分析N-cadherin表达的下调对肝癌细胞转移能力的影响.结果 解剖裸鼠,观察腹

水形成及转移灶发现,分别注射LM3-N7和LM3-E2细胞克隆的裸鼠腹水形成(腹

腔转移)、肝转移及肺内转移的发生率分别为46.2％(6/13)v s.0％(0/12),46.2％

(6/13)vs.41.7％(5/12),23.1％(3/13)vs.16.7％(2/12),统计学分析显示,在腹水形成

方面两组差异具有统计学意义(P=0.026),肺转移及肝内转移发生率的差异无统计学

意义(均P>0.05).结论 下调N-cadherin表达对裸鼠原位移植癌转移(主要是腹腔

转移)具有一定的促进作用,为N-cadherin在肝癌转移机制方面的下一步研究奠定

了一定理论基础.

【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2018(047)006

【总页数】4页(P733-736)

【关键词】肝癌;肿瘤转移;N-cadherin;裸鼠模型

【作 者】纪桂宝;游建;黄志勇;占大钱;梁宾勇

【作者单位】武汉市第四医院 ,华中科技大学同济医学院附属普爱医院肝胆胰外科 ,

武汉 430034;武汉市第四医院 ,华中科技大学同济医学院附属普爱医院肝胆胰外科 ,

武汉 430034;华中科技大学同济医学院附属同济医院肝胆外科 ,武汉 430030;华中

科技大学同济医学院附属同济医院肝胆外科 ,武汉 430030;华中科技大学同济医学

院附属同济医院肝胆外科 ,武汉 430030

【正文语种】中 文

【中图分类】R735.7

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌的发病率约占世界总发病率的

53%[1-2]，其死亡率为我国肿瘤死亡率的第2位，5年复发转移率高，预后差[3]。

近年来，关于侵袭转移分子水平的研究，如对钙粘连蛋白家族、TGF-β、HGF等

的研究突飞猛进[4]。为肝癌侵袭转移机制的研究提供了更多的线索。

钙粘连蛋白(cadherin)大多属于跨膜蛋白，在细胞内cadherin分子与β-catenin

相连，进而再与α-catenin相连，在WNT信号通路中发挥重要作用[5]。研究证

实，cadherin的表达升高或降低与许多肿瘤的形成及侵袭转移等生物学行为密切

相关[6]。但在人类许多肿瘤中，N-cadherin存在表达异常的情况，在某些肿瘤中

是促癌因子，而在另一些肿瘤中是抑癌因子[7-8]。近期有研究报道，N-cadherin

在肝癌中属于肿瘤促进因子[9-10]，而我们之前研究提示敲除肝癌细胞中的N-

cadherin后，其迁移及侵袭能力明显增强，因此认为N-cadherin是肿瘤抑制因

子[11]。为进一步明确N-cadherin在肝癌侵袭转移的作用，我们利用人肝癌裸鼠

模型[12]，观察其在肝癌侵袭转移中的作用，为后期的研究及可能的临床药物治疗

提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 HCC-LM3细胞(购于上海复旦大学肝癌研究所)及其克隆(由华中科技大

学同济医学院附属同济医院肝胆外科实验室提供)，保存于液氮中。共6个不同的

克隆，分别为极弱表达N-cadherin的LM3-N7，少量表达N-cadherin的LM3-

N2，转染空载体的对照LM3-E2、LM3-E3、LM3-N6及亲代细胞LM3。

1.1.2 动物 30只4～6周龄BALB/c雄性裸鼠，体重18～20 g，购于上海医学动

物研究中心，在华中科技大学同济医学院SPF级环境饲养约8周后用于实验。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏培养 于液氮中迅速取出以上5种LM3的克隆及亲代LM3细胞系，

表面喷洒75%乙醇消毒后置于37℃恒温水浴箱里，均匀摇晃，待完全成液态后，

1000 r/min离心5 min，表面再次喷洒75%乙醇消毒，移入超净台。取出上清，

加入1 mL含有10%胎牛血清的DMEM新鲜培养液，反复轻柔吹打3次，移入细

胞培养瓶，加入适量含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置入5% CO2，37℃

恒温细胞培养箱中培养，适时更换培养液。

1.2.2 细胞克隆蛋白提取及鉴定 取处于对数生长期的以上5种LM3的克隆及亲代

LM3细胞系，经去除培养液、裂解、吸取细胞裂解物、离心、加入5×溴酚蓝、加

热，-80℃冰箱中保存。细胞克隆蛋白鉴定采用免疫印迹法(操作参照Beyotime

P0012AC说明书)。

1.2.3 细胞培养及收集 取LM3-N7与LM3-E2克隆细胞，分别加入适量含有10%

胎牛血清的DMEM培养液，并适时更换培养液。待细胞处于对数生长期时，收集

细胞。

1.2.4 原位移植人肝癌细胞 常规超净台上消毒、麻醉裸鼠，常规消毒铺巾，选择腹

部正中切口，暴露肝左外叶，取定量的细胞悬液(含5×105个细胞)注射入肝左外

叶，关腹，术毕。

1.2.5 裸鼠标本采集及切片染色 原位移植术后6周(死亡5只)，处死裸鼠，解剖，

将肺、肝上转移灶、淋巴结等取出，置于5%甲醛中浸泡24 h，标本予以包埋，

切片，苏木精-伊红(HE)染色。

1.3 统计学分析

用SPSS 24.0统计分析软件分析数据，组间数据比较采用单因素方差分析，以

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞克隆的Western blot鉴定结果

复苏5种克隆细胞(LM3-N2、LM3-N6、LM3-N7、LM3-E2、LM3-E3)及原代

LM3细胞，经Western blot检测，6组细胞的N-cadherin表达结果如下：

LM3-E2、LM3-E3、LM3-N6表达与LM3相近，为正常表达；LM3-N2弱表达，

LM3-N7极弱表达，见图1。因此，选取极弱表达的LM3-N7及正常表达的

LM3-E2进入下一步的裸鼠原位移植实验。

图1 Western blot检测5种克隆细胞及原代LM3细胞中N-cadherin的表达

Fig.1 The N-cadherin expression of the five clones and primary LM3 cell

line

2.2 裸鼠原位移植实验结果

极弱表达N-cadherin的LM3-N7与正常表达N-cadherin的LM3-E2细胞系移

植裸鼠后在肝内转移、肺转移方面无差异，但在腹水形成方面有显著差异。

在腹水形成方面，LM3-N7组有6例产生腹水(6/13)，而LM3-E2组中未发现有

腹水形成，差异有统计学意义(P=0.026)，提示N-cadherin表达的下调可促进腹

水的形成。观察LM3-N7组动物，发现其腹部外观呈暗黑色，解剖后见暗红色血

性液体，量约2～3 mL，且腹膜不光滑，存在转移灶，如图2。在肝内转移方面，

LM3-N7、LM3-E2组中分别有46.2%(6/13)、41.7%(5/12)的动物发生肝内转移，

差异无统计学意义(P>0.05)。其大体观可见肝左叶巨大肿瘤，为种植形成，其余

肝叶可发现灰白色点状转移灶(图3A箭头示)；病理检查为肝癌转移灶(图3B内箭

头示，转移灶周围可见正常肝组织)。在肺转移方面，LM3-N7、LM3-E2组中分

别有23.1%(3/13)、16.7%(2/12)的动物发生肺转移，差异无统计学意义。图4可

见转移灶位于支气管旁，与周围正常肺组织区别明显，其中转移肝癌细胞数为

20～50个。

A：腹部外观；B：腹壁转移灶，箭头所示为转移灶图2 LM3-N7组动物腹部外观

及腹壁转移灶Fig.2 The abdominal appearance and metastasis sites of the

peritoneum(LM3-N7)

A：肝脏肿瘤大体观；B：转移灶病理切片，HE染色，×200图3 LM3-N7组动物

肝脏肿瘤大体观及转移灶的病理检查Fig.3 Gross observation of giant tumor in

left lobe of liver and metastasis in the other lobe by pathological

examination

A：肺内转移灶，HE染色,×40；B：肺内转移灶，HE染色,×200；箭头所示为转

移灶图4 LM3-N7组动物肺内转移灶病理学检查Fig.4 Pathological

examination of lung metastasis in the rats of LM3-N7 group

3 讨论

目前肝癌治疗的治愈性措施包括外科切除及肝移植术，但复发、转移率高，5年生

存率低，预后差[2]。肝癌的临床治疗已经在多个领域取得一定进步，如影像学、

外科手术、局部肿瘤治疗及生物治疗。肝癌的外科切除和肝移植可视为潜在性的治

愈性措施[13]。然而，大部分患者由于血管侵犯或转移无法接受此类治疗措施。肿

瘤的转移被认为是一个复杂的、多阶段的过程，涉及到肿瘤血管形成，原发肿瘤细

胞脱落，肿瘤细胞突破肿瘤周围基底膜和细胞外基质从而穿破血管或淋巴管，最后

在远端器官形成新的病灶等方面[14]。

cadherin大多属于跨膜蛋白，在肝癌的转移中有重要作用，大量研究证实

cadherin的表达升高或降低与许多肿瘤的形成及侵袭转移等生物学性质有紧密联

系[6]。目前已知cadherin家族共有3个成员：E-cadherin、N-cadherin和P-

cadherin，其中N-cadherin被称为神经钙粘连蛋白。近期文献报道在某些人类

肿瘤中，N-cadherin表达上调或重新表达可促进肿瘤的发生，如直肠癌、膀胱癌、

胰腺癌、前列腺癌等[7-8]；在某些侵袭性的肿瘤中，N-cadherin被发现是下调的，

如乳腺癌，其表达降低与乳腺癌的转移复发相关[15]，而且在骨肉瘤中，高表达

N-cadherin后可以抑制其转移能力[16]。近期有文献报道，N-cadherin在肝癌

中表达升高，可促进肝癌的发生和侵袭转移[10]，但同时也有结论不一致的报道

[17]。我们前期的研究发现，N-cadherin在肝癌中表达缺失，其表达缺失与肿瘤

的分化、血管侵犯或转移相关。此外，N-cadherin表达缺失与肝癌患者术后无瘤

生存率相关。体外研究发现，敲低N-cadherin的表达可以减弱细胞间粘附作用和

增强细胞侵袭转移能力。这些结论表明N-cadherin的表达缺失在肿瘤的侵袭转移

中有重要作用[18]。为了明确N-cadherin在肝癌侵袭转移中的作用，我们利用肝

癌动物模型进行进一步的研究。

肝癌模型在研究肝癌生物学特征中具有重要作用[19]。上海复旦大学肝癌研究所先

后建立了多种人肝癌裸鼠模型及具有不同转移潜能的肝癌细胞系[12]。本实验应用

肝癌肺转移细胞系HCCLM3原位移植裸鼠，此细胞系兼具腹腔内转移、淋巴结转

移、肺转移倾向，为研究N-cadherin在肝癌侵袭转移中的作用提供了很好的动物

模型。

我们研究发现2种细胞克隆接种约3周后，极弱表达N-cadherin的LM3-N7组

动物开始出现腹水，后经解剖见暗红色血性液体，可能由于肝癌发生网膜与腹壁转

移形成许多微转移灶所致，提示敲低LM3细胞中N-cadherin的表达，可促进肝

癌细胞发生大网膜或腹膜的转移。该动物模型亦发生肺转移，在我们的实验中观察

到肺内的转移灶大都位于支气管旁，与刘虎等[12]研究结果一致。本研究中两组肝、

肺转移率的差异无统计学意义，其原因可能有：①LM3细胞经过RNA干扰，培养

传代次数多，其肺转移的倾向性可能下降。②建立该动物模型方法不同。我们采用

细胞直接注射法，虽然过程较简单，观察周期短，但细胞注射要求操作技术熟练，

否则造成肝内成瘤率较低，致肺转移率低；而瘤块嵌插法，周期长，但肝内及肺转

移率相对较高[12]。③肿瘤的转移是个多步骤，多因素的复杂过程[14，20-22]，

体外研究只能体现肝癌转移这一重要过程的某个阶段。因此敲低N-cadheirn表达

尚不足以影响肝癌的转移，可能需要其他分子或途径的参与，这有待进一步研究。

综上所述，N-cadherin的下调可以通过腹膜转移，进而促进肝癌细胞转移至腹膜

或网膜，形成腹水，而在促进肺转移、肝内转移方面作用不明显。本动物模型研究

从体内研究方面发现了N-cadherin对肝癌侵袭转移方面的影响，一定程度上证实

了前期体外实验的结论，这为N-cadherin的进一步研究、临床药物实验及以后的

临床应用提供了线索。

参 考 文 献

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