2023年7月17日发(作者：)

化工学院 药物工程 刘华祥 20607073

基因载体系统

刘华祥

20607073

人类基因组计划取得超乎想象的飞速进展，促使人们对基因治疗的前景充满信心。要成功地实施基因治疗，必须具备三个关键因素：针对性的治疗基因；基因递送系统；基因表达调节系统。目前基因治疗实验的基本步骤为：在某些实验中，从病人的血液或骨髓中取出细胞，并在加速繁殖的实验条件下生长。然后，把需要的基因借助于不起作用的病毒嵌进细胞，选择出获得成功改变的细胞再加速繁殖，再回到病人的体内；另一种情况，脂质体（脂肪颗粒）或不起作用的病毒可被用于把基因直接输进病人体内细胞。

基因治疗的一个主要目标是用一种缺陷基因的健康复制去提供给细胞。基因治疗对治疗人类多种疾病有潜在的优势，并产生很低的副作用。虽然对作为疾病治疗手段的基因治疗充满巨大的希望，但开发高效临床医疗方案的进展仍然缓慢，问题在于安全和有效的基因输送系统的开发及基因表达的长效和稳定性，在这方面还有很长的路要走。

基因治疗是一种在对疾病治疗产生巨大影响之前，仍需几年才能达到的强有力的新技术。目前还存在几个主要的问题，包括在病毒和非病毒中微弱的输送系统，基因被输送后微弱的基因表达等。人类疾病中转基因和基因表达低效的的原因是我们仍未掌握应如何构思载体的方法，比如，哪一种细胞类型适合什么类型调节序列，如何克服体内免疫对抗，如何按我们的要求去制造载体等等。

1 病毒载体

虽然病毒载体系统具有潜在的高效性，但对将来作参考选择的非病毒基因输送系统提出两种建议：安全，制造方便。能设计出全部合成基因输送系统以避免产生结合病毒的危险，或由生物活性病毒颗粒工程化的其它毒素效应。还有，生产产品不应该比想象中的细菌那种组织细胞培养更复杂，QA/QC步骤应简单化。

基因治疗的关键在于基因载体递送系统。目前,广泛使用的基因递送系统可分为病毒与非病毒基因递送系统。病毒基因递送系统的转染及表达效率高,但存在潜在的野生型感染、致癌性、免疫原性等毒副作用,且受病毒自身体积的限制,装载目的基因的容量常有一定限制[1]。

病毒可进入寄主DNA ,但大多数野生型病毒对机体都有致病性,需改造才可用于人体。将病毒基因中与致病相关的基因去除,而保留其携带基因进入人体的功能,再组装成理想的外源基因,这种病毒即可成为病毒载体(viral vector)[2]。

理论上各种类型的病毒均可被改造成病毒载体,但由于人们对许多病毒的认识不够等限制,近20 年来,仅有少数几种病毒被成功地改造为基因转移载体(gene transfer vector) ,并应用于临床。

1.1 逆转录病毒(retrovirus ,RV)载体

逆转录病毒是一种RNA病毒,基因组大小在8～11kb 之间。逆转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞,然后在自身基因组编码的反转录酶的作用下,以基因组RNA为模板反转录出双链DNA。双链DNA 能够随机整合到寄主细胞的染色体上,随着寄主细胞的复制而复制[2]。

逆转录病毒是应用最早,研究相当热门的病毒载体,目前仍被广泛应用。体内有效的基因治疗需要有足够高的感染率( > 107 cfu/ml) ,大部分逆转录病毒载体都很难达到,因此逆转录病毒载体更适用于体外转染[3]。

逆转录病毒载体的最大优点是能够将携带的外来基因整合进入细胞的基因化工学院 药物工程 刘华祥 20607073

组中，永不丢失。缺点是该载体偕同基因只能被整合入正在分裂的细胞的基因组中，且基因载体整入细胞基因组的过程是随机的，可以整入细胞基因组的任何一个位点，如果整入一个重要的细胞基因，将引起该基因的破坏。

1.2 腺病毒(adenovirus ,Ad)载体

Ad 为一DNA 双链无包膜病毒,基因组长约36kb ,由非结构基因E1(E1A、E1B) 、E2A、E2B、E3、E4 组成,和编码结构蛋白的基因L1-L5 等组成。Ad 载体的构建一般采用同源重组,现在最常用的是缺失了整个E1A 和部分E1B 基因的Ad2及Ad5型载体。E1区的缺失造成了病毒复制缺陷,同时为外源基因的插入提供了空间。此为第一代腺病毒载体,治疗的疾病包括肿瘤、遗传病、心血管病等。腺病毒载体解决了对于那些不正在处于分裂的细胞，逆转录病毒载体不能有效地整入的问题；Ad载体还能够高效率地携带基因进入细胞，携带的基因在细胞中有良好的表达，治疗作用明显[2]。

其不足是载体本身的基因所编码的几种病毒蛋白是免疫性较强的抗原(非己蛋白分子)，人体对这些病毒抗原发起程度不同的免疫反应，反应程度因人而异。在反应强烈的人体中，不仅可破坏载体所携带的基因的表达，撤消治疗作用，而且可导致较严重的病症，甚至死亡。在宾西法尼亚大学基因疗法试验中不幸死去的Jesse Gelsinger就是因为腺病毒载体引起的免疫反应。另外，其载体和所带基因在细胞中不是永远地存留，治疗作用可维持几个星期到几个月甚至更长的时间[2]。

1.3 腺相关病毒(adeno-associated virus ,AAV)载体

AAV属微小病毒科,是目前已知动物病毒载体中最简单的线状单链DNA病毒,基因组大小在4.7～6kb 之间,无包膜,病毒体为20面体。AAV是天然复制缺陷型病毒,需要腺病毒或单纯疱疹病毒辅助感染。目前广泛应用的腺相关病毒载体主要基于Ⅱ型腺相关病毒(AAV2) ,AAV2基因组有4680个核苷酸,含有3个启动子P5、P19、P40 ,2个开放式阅读框(open reading frame ,ORF) rep 、cap 和位于基因组两端的末端反向重复序列ITR[2]。

AAV是一个较小的感染人的病毒，感染后不致病，人体的免疫系统对它基本上置之不理，其被公认为是最安全的病毒载体,在基因治疗和疫苗研究中受到广泛重视重组病毒载体(rAAV)已用于肝脏、肺、脑、肌肉、视网膜及血液系统多种器官的遗传性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病的研究。目前在美国以rAAV2作为载体采用基因治疗的两种疾病(血友病B和囊性纤维化) ,已进入早期的临床试验阶段[4]。

AAV在基因疗法中的优点是: 基因表达效率高，AAV在人类不致病，不引起严重的免疫反应，能够将治疗基因传递给正在分裂的细胞也可传递给没有正在分裂的细胞。载体连同治疗基因整合进入细胞的基因组中，因此治疗基因较稳定，治疗效果可维持几个月到几年的时间。

不足之处是AAV本来就较小，不适合于携带较长的基因。AAV的合成繁殖需要腺病毒的蛋白质，腺病毒蛋白质的表达增加了整个基因疗法工程的复杂程度。另外，AAV整入细胞基因组不如逆转录病毒那样永久。

此外,还有慢病毒(lentivirus ,LV) 载体，单纯疱疹病毒(herpes simplex

virus ,HSV) 载体，痘苗病毒(vaccinia virus ,VV) 载体，杆状病毒(baculo virus)

载体，杂合病毒载体(hybird or chinmeric vectors)等病毒载体开发成功。 化工学院 药物工程 刘华祥 20607073

2 非病毒载体

非病毒载体依赖细胞机制将DNA导入细胞进而转移至细胞核。目前较常用的非病毒载体有脂质体、阳离子高聚物、裸露DNA 直接注射、电脉冲导入系统等。

相对于病毒基因递送系统,非病毒基因递送系统的转染效率多数较低,但具有明显的安全性及装载基因的容量可调控性。非病毒基因递送系统是未来的发展方向,是现在基因治疗的热点研究内容。

2.1 脂质体载体

脂质体DNA复合物是非病毒载体中应用最广泛的载体, 具有制备简单; 磷脂成分无毒、无免疫原性, 可被细胞生物膜利用; 可单独或联合其他载体使用; 容量较大; 可抵御核酸酶的降解; 延缓基因的释放等优点。目前应用的转基因脂质体分阳性、中性、阴性以及pH 敏感等类型，其他新型用于基因治疗的脂质体仍在不断地被合成[5]。

其中阳离子脂质体在培养细胞的基因转染中具有较好的效果，由于阳离子脂质体结构一般包括疏水基团和氨基基团, 可以增加分子中氨基基团的数目及氨基基团与疏水基团之间的距离, 从而有利于增加DNA 的释放能力。

2.2 壳聚糖载体

壳聚糖是一种新兴的转染试剂, 可以被降解并吸收而不在体内蓄积；对细胞不具毒性。壳聚糖是无毒、生物相容性好的多聚阳离子, 并且有较低的免疫原性。它是基因传递系统好的选择,因为它带有阳离子可以和带有阴离子的DNA有效的结合, 并且保护它免受核酸酶的降解。它有利于在准备期内不需采用超声波生物降解和加入有机溶剂,因此使配位过程中DNA可能受到的破坏最小化，而且装载DNA的壳聚糖微粒在储存时较为稳定, 所以用壳聚糖作为基因药物的载体具有重大意义[5]。

黄伟等[6]研究了基因壳聚糖纳米粒的性质和转染活性。其体外基因转染实验表明,纳米粒能够将质粒基因递送到细胞内,基因活性不受影响并表达产生绿色荧光蛋白,从而证明了壳聚糖纳米粒用作基因递送载体的可行性。

2.3 质粒载体[7]

质粒为高度亲水性的高分子胶体物质,表面带有负电荷,质粒的胶体及表面性质决定其在体内的分布,细胞摄取、细胞内的处理及核酸的易位过程。因质粒不能有效穿过膜及连续的内皮系统,在细胞外组织中的扩散也有限,因此基因传递系统将致力于修饰其胶体及表面性质以提高质粒在体内的转染效率及生物稳定性。

2.4 聚合物载体

聚合物可模仿病毒组分,有效地压缩DNA长链分子,提高其转染效率。多聚阳离子有很多形式, 例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、组蛋白、脱乙酰壳多糖、聚乙烯亚胺(PEI) 等。

非线形阳离子聚合物Polyamidoamine CascadeDendrimers可通过其末端氨基与DNA磷酸基团间的电性作用,与DNA 缩合形成具有特定胶体及表面性质的复合物。该类阳离子聚合物可与配位体、促核内体释放试剂或核酸定位信号键合,加速质粒的处理及表达过程。如将两亲多肽GALA与Dendrimers通过二硫键结合,GALA 在低pH 环境中可降低核内体膜的稳定性,促进质粒释放[8]。

3 小结

从目前来看,病毒载体系统在基因治疗中占有绝对优势,其作用不可替代。通过科学家的不懈努力,原有的病毒载体将不断得以改进,更多安全、高效的新病毒载体也会不断涌现。尽管非病毒载体转染效率目前较低, 但由于具有低毒、低免化工学院 药物工程 刘华祥 20607073

疫反应、靶向性高和易于组装等优点, 值得进一步研究和探讨。

现在,人们已开发出了多种靶向转移载体,以期解决基因治疗中基因转移的安全性和靶向性问题。但所使用的载体均有其局限性。目前,人们正在考虑将这些靶向性载体的优点集合在一起,构建一个更安全、更有效的载体。

同时，我们还应该注意到，以上基因载体递送系统不仅可以用于基因药物的输送，还可以把其开发成适合化学药物，甚至中药的载体递送系统。如非病毒载体——脂质体，就被成功开发成靶向给药系统的一种新剂型，它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。目前在药物靶向性给药系统中，脂质体是最成熟和最先进的药物载体之一，其已应用于许多细胞毒抗癌药物的靶向剂型的开发中，例如多柔比星（阿霉素）、紫杉醇和铂类抗癌药物[9]。

虽然目前基因治疗在有效性、可操作性和安全性等方面存在着不少问题，但我们有理由相信随着载体这一研究领域的不断深入，必将会产生突破性的进展，并带来具有深远意义的医疗革命。

参考文献

[1] 魏秀莉,吴伟,徐惠南.非病毒基因递送系统的靶向性研究.复旦学报(医学版),2005,32(3):368-370

[2] 张婵,邵艳军.基因治疗的病毒载体系统. 生物技术,2007,17(1):90-93

[3] 曹明媚. 基因治疗载体的研究进展[J].国外医学-肿瘤分册,2004 ,31(1):22-26

[4] 李晨.腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用[J].中国康复理论与实践,2006 ,12(1):51-52

[5] 刘娜,刘吉勇.基因治疗中载体的研究进展.山东医药,2005,45(5):74-75

[6] 黄伟,崔光华,贺俊峰,周旭,张强.壳聚糖纳米粒用作基因递送载体的初步研究.药学学报,2002,37(12):981-985

[7] 郭大东,陈文芳,宋磊.基因治疗中的靶向转移载体研究.医学综述,2002,8(2):75-76

[8] 翁伟宇,徐惠南,庄庆祺.非病毒介导基因治疗系统[J].国外医药-合成药生化药制剂分册,2000,21(2):72-75

[9] 余尧,刘伟平,高文桂,谌喜珠,刘洋.铂类抗癌药物脂质体的研究进展. 中国新药杂志 2007 16 (10):753-757