2023年7月17日发(作者：)

２１６４ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２白花蛇舌草通过抑制ＣＸＣＲ３的表达调控非小细胞５４９凋亡的机制研究肺癌细胞Ａ胡同晨１，果　然２，魏晓琼１，彭华利１，周　洋１，杨　帆１（１．乐山市人民医院胸心外科，四川乐山６１４０００；２．内蒙古自治区人民医院肿瘤外科，内蒙古呼和浩特０１００１０）摘要：目的　探讨白花蛇舌草引起非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡的潜在机制。方法　使用白花蛇舌草处理非小细胞肺癌５４９后，检测其凋亡水平。通过ＲＮＡｓｅｑ检测白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后的ｍｉＲＮＡ差异。通过细胞ＡｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓ过表达差异ｍｉＲＮＡ，检测非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平。通过ｍｉＲＤＢ和荧光素酶报告系统分析ｍｉＲＮＡ的靶向底物。结果　白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）；ｈｓａｍｉＲ２１１０、ｈｓａｍｉＲ１２９０、ｈｓａｍｉＲ３１４４５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ａ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６８５７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７８０ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４４８７、ｈｓａｍｉＲ６７６３５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４９７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７７０５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４５０ａ２３ｐ、ｈｓａｍｉＲ１９５５ｐ、ｈａｓｍｉＲ４４３、ｈｓａｍｉＲ４７４９５ｐ的表达量升高（Ｐ＜０．０５）。过表达ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜）；敲低ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５）。此外，白花蛇舌草和ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ０．０５同时处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平无显著变化（Ｐ＞０．０５）。ｍｉＲＤＢ在线分析和荧ｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的非编码区（Ｐ＜０．０５）。过表达ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的光素酶报告实验发现ｍ凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５）；敲低ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）。同时，白花蛇舌草处理后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的蛋白水平和ｍＲＮＡ水平均下降（Ｐ＜０．０５）。同时敲低ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５）；同时过表达ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５）；将白花蛇舌草处理Ａ５４９细胞并过表达ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５）。结论　白花蛇舌草通过促进ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ的表达后，ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３ｍＲＮＡ的非编码区，随后促进了非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡。关键词：白花蛇舌草；　非小细胞肺癌；　Ａ５４９；　凋亡；　ＣＸＣＲ３；　ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ中图分类号：Ｒ７３４．２　　文献标识码：ＡＡＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａｂｙＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＸＣＲ３ｉｎＲｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＡｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＮｏｎｓｍａｌｌＣｅｌｌＬｕｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｌｌＡ５４９１２１１１１ＨＵＴｏｎｇｃｈｅｎ，ＧＵＯＲａｎ，ＷＥＩＸｉａｏｑｉｏｎｇ，ＰＥＮＧＨｕａｌｉ，ＺＨＯＵＹａｎｇ，ＹＡＮＧＦａｎ（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｈｏｒａｃｉｃａｎｄＨｅａｒｔＳｕｒｇｅｒｙ，ＬｅｓｈａｎＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｅｓｈａｎ６１４０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｔｏｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９．ＭｅｔｈｏｄｓＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｏｎｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＴｈｅｍｉＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＮＡｓｅｑ．ＢｙｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｉＲＮＡ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｆｍｉＲＮＡｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｍｉＲＤＢａｎｄａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｓｕｌｔｓＡｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｒｅｐｏｒｔｅｒｓｙｓｔｅｍ．ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｈｓａｍｉＲ２１１０，ｈｓａｍｉＲ１２９０，ｈｓａｍｉＲ３１４４５ｐ，ｈｓａｍｉＲ１５ａ５ｐ，ｈｓａｍｉＲ６８５７５ｐ，ｈｓａｍｉＲ６７８０ｂ５ｐ，ｈｓａｍｉＲ４４８７，ｈｓａｍｉＲ６７６３５ｐ，ｈｓａｍｉＲ４９７５ｐ，ｈｓａｍｉＲ６７７０５ｐ，ｈｓａｍｉＲ１５ｂ５ｐ，４５０ａ２３ｐ，ｈｓａｍｉＲ１９５５ｐ，ｈａｓｍｉＲ４４３，ａｎｄｈｓａｍｉＲ４７４９５ｐａｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．１２．０３１收稿日期：２０２０７３１；修回日期：２０２０１０１４基金项目：四川省科技计划项目（编号：２０１４ｚｃ００３８）通讯作者：果然。标记免疫分析与临床　２０２０年１２月第２７卷第１２期２１６５０．０５）．ＢｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｉＲ４５０ａ２３ｐ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎｍｉＲ４５０ａ２３ｐ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＡ５４９ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａａｎｄｍｉＲ４５０ａ２３ｐｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ（Ｐ＞０．０５）．ｍｉＲＤＢｏｎｌｉｎｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈａｔｍｉＲ４５０ａ２３ｐｔａｒｇｅｔｅｄｔｈｅｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＣＸＣＲ３（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ３，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎＣＸＣＲ３，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ａｌｓｏ，ａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌａｎｄｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＣＸＣＲ３ｉｎＡ５４９ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＢｙｋｎｏｃｋｉｎｇｄｏｗｎｍｉＲ４５０ａ２３ｐａｎｄＣＸＣＲ３ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＞０．０５）．ＢｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ４５０ａ２３ｐ３，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９ｄｉｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＞０．０５）．ＡｆｔｅｒａｎｄＣＸＣＲｔｒｅａｔｉｎｇＡ５４９ｃｅｌｌｓｗｉｔｈＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ３，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｏｆＡ５４９（Ｐ＞０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｆｔｅｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ４５０ａ２３ｐ，ＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｗｉｌｌｔａｒｇｅｔｔｈｅｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＣＸＣＲ３ｍＲＮＡ，ａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａ；　Ｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ；　Ａ５４９；　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；　ＣＸＣＲ３；　ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ　　肺癌可分为小细胞肺癌（ＳＣＬＣ）和非小细胞肺１］ＮＳＣＬＣ）。肺癌的发病率和死亡率极高［。癌（ＮＳＣＬＣ占肺癌总病例的８０％，是男性癌症相关死亡２］的主要原因，也是女性癌症相关死亡的重要原因［。在美国，每年约有２２万例肺癌新病例，其中１５万例死于肺癌。肺癌的主要原因是直接吸烟或继发性吸３］烟［。此外，空气污染、汽车尾气排放等因素也可导致肺癌发生。肺癌常伴有慢性支气管炎、肺心病、肺４］结核等疾病，且早期症状难以发现［。此外，肿瘤转移和血管因子介导的耐药较为常见，对肺癌的治疗５］效果不理想［。ＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａＷｉｌｌｄ，命名为“白花蛇舌草”，在传统中药中因其温和的有效性和低毒６］。其性，已被广泛应用于治疗各种疾病，包括癌症［含有苯丙类、蒽醌类、甾体、黄酮类、多糖等多种生物７］活性成分［。研究发现，白花蛇舌草能够在体外和８］体内抑制肺癌细胞增殖，并促进其凋亡［。目前，白９］。花蛇舌草已经在临床上辅助治疗非小细胞肺癌［然而，白花蛇舌草促进肺癌细胞凋亡的机制尚未十分明了。基于此，本研究使用非小细胞肺癌细胞Ａ５４９为研究对象，旨在探讨白花蛇舌草引起非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡的机制。ｈｓａｍｉＲ１５ａ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６８５７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７８０ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４４８７、ｈｓａｍｉＲ６７６３５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４９７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７７０５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４５０ａ２３ｐ、ｈｓａｍｉＲ１９５５ｐ、ｈａｓｍｉＲ４４３、ｈｓａｍｉＲ４７４９５ｐ、ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｍｉｍｉｃｓ、ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ均ｉＣＸＣＲ３由吉凯基因合成。由北京睿博兴科合成。ｓＣＲ试剂盒购自上海兢蔚生物科技有限公荧光定量Ｐ司（货号：ＢＬ７０５Ａ）。人肺腺癌细胞株Ａ５４９购自北京ＫＧ００７Ｇ）。ＣＸＣＲ３过表安鑫康科技有限公司（货号：达质粒通过非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的ｃＤＮＡ克隆至ｐＣＤＮＡ３．１表达载体上。反转录试剂盒购自昆明皇宝商贸有限公司（货号：２１８１６１）。ＧＡＰＤＨ抗体购自北京博奥派克生物科技有限公司（货号：ＭＯ２５０３８）。双荧光素酶报告基因试剂盒购自武汉纯度生物科技有ＣＤＬＧ４９９７）。ＣＸＣＲ３抗体购自昆明皇限公司（货号：宝商贸有限公司（货号：ＧＴＸ５１５３２）。二抗购自北京海Ｙ２０１１）。科鸿创生物科技有限公司（货号：　　２　方法　　２．１　细胞培养与转染　人肺腺癌细胞株Ａ５４９在含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中培养，３７℃，５％培养箱。使用体积分数１％的白花蛇舌草水提物ＣＯ２处理Ａ５４９细胞。按照脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转ｓａｍｉＲ２１１０、ｈｓａｍｉＲ１２９０、ｈｓａｍｉＲ３１４４５ｐ、染ｈｈｓａｍｉＲ１５ａ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６８５７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７８０ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４４８７、ｈｓａｍｉＲ６７６３５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４９７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７７０５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４５０ａ２３ｐ、ｈｓａｍｉＲ１９５５ｐ、ｈａｓｍｉＲ４４３、ｈｓａｍｉＲ４７４９５ｐ、ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｍｉｍｉｃｓ、ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ３０ｈ后，进行后续实验。将白花蛇舌草水提物做一系列５４９细胞。除图１外，其余所浓度梯度稀释后处理Ａ材料和方法　　１　材料　　白花蛇舌草水提物（ＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔ，ＨＤＷＥ）：３０ｇ白花蛇舌草加蒸馏水３Ｌ温火煎煮６０ｍｉｎ，加热沸腾３０ｍｉｎ，离心取上清液浓缩为３００ｍＬ，０．２２ｍ过滤除菌。ＴＲＩｚｏｌ试剂购自四川爱奇生物μ科技有限公司（货号：１５５９６０２６）。ｐｓｉＣＨＥＣＫ２质粒购自广州佰汇生物科技有限公司（货号：Ｐ０１９７）。ｈｓａｍｉＲ２１１０、ｈｓａｍｉＲ１２９０、ｈｓａｍｉＲ３１４４５ｐ、２１６６有实验白花蛇舌草水提物的使用浓度均为２００ｇ／ｍＬ。μ　　２．２　ＲＮＡ抽取与实时荧光定量ＰＣＲ　按照ＲＮＡ提取试剂盒的说明，使用Ｔｒｉｚｏｌ法提取对数生长期细胞样本的总ＲＮＡ。根据反转录试剂盒的指令ＤＮＡ。最后，按照ｑＲＴＰＣＲ试剂盒说合成第一链ｃＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、明书检测ＥＩＧＦ２、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９、ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ的表－ＣｔΔΔ达水平。通过２计算上述基因的相对表达水平。　　２．３　免疫印迹　收集每组细胞并在冰上裂解２５ｍｉｎ。以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。将上清液置于ＥＰ管中，并加入５×ＳＤＳ加载缓冲液并煮沸１０ｍｉｎ。ＶＤＦ膜上。电泳后，用膜转移仪将蛋白质转移到Ｐ将膜用５％脱脂奶粉封闭２ｈ。洗涤膜后，加入ＧＡＰＤＨ和ＣＸＣＲ３抗体并在４℃下温育过夜。然后，在４℃下加入二抗２ｈ。加入发光液体并曝光。　　２．４　ＲＮＡＳｅｑ　分别用白花蛇舌草和ＰＢＳ处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，抽取非小细胞肺癌细５４９的ＲＮＡ。ＲＮＡ样品被送到北京基因组研究胞Ａ所（中国深圳）进行商业性ＲＮＡＳｅｑ服务和数据分ＯＡＰａｌｉｇｎｅｒ／ＳＯＡＰ２不匹配，将干净的读析。使用Ｓ段映射到ｈｕｍａｎ数据库。计算每个基因的纯净读数，然后将其标准化为每百万分之一读数（ｋｂＫＭ），ｏｇ２比率该读数将读数与基因表达水平相关。利用ｌ来确定基因调控。选择ｌｏｇ２比率为－１或ｌｏｇ２比率为１的免疫基因进行进一步分析。设置两个重复。　　２．５ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色　经过不同处理后，收集在６孔板上生长的漂浮非小细胞肺癌Ａ５４９细胞和胰ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２ＰＢＳ洗涤。然后将蛋白酶分离的细胞，并用冷的１×细胞沉淀物用结合缓冲液重悬，并根据试剂盒方案用ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色。荧光显微镜观察。将实验组中凋亡细胞的百分比与对照转染组进行比较。所有样品一式三份测量。　　２．６　荧光素酶报告实验　收集各组Ａ５４９细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册ｓｉＣＨＥＣＫ２载体表达萤火虫和肾细胞荧光素操作。ｐ酶活性。构建荧光素酶报告载体ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ＣＸＣＲ３３′ＵＴＲＷＴ和ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ＣＸＣＲ３３′ＵＴＲＭＵＴ。４ｈ后测定荧光强度。肾素荧光素酶发光强度转染２与萤火虫荧光素酶发光强度的比值显示ｍｉＲ４５０ａ与ＣＸＣＲ３的结合力。２３ｐ　　３　统计学处理　　所有实验数据采用ＳＰＳＳ２１．０软件进行分析。测量数据以均数±标准差表示，组间数据采用单因ＮＫｑ检验。素方差分析进行比较。两两比较采用ＳＰ＜０．０５被认为差异具有统计学意义。结　　果　　１　白花蛇舌草促进非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡　　使用白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，荧光显微镜发现Ａｎｎｅｘｉｎ阳性的早期凋亡细胞和ＰＩ阳性的晚期凋亡细胞的水平均上升（Ｐ＜０．０５），见图１Ａ。使用不同浓度的白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，Ａ５４９的凋亡水平呈时间依赖Ｂ和图１Ｃ。性和浓度依赖性上升，见图１图１　白花蛇舌草促进非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡标记免疫分析与临床　２０２０年１２月第２７卷第１２期２１６７　　２　白花蛇舌草操控ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ调控非小５４９的凋亡细胞肺癌细胞Ａ　　白花蛇舌草处理非小细胞肺癌Ａ５４９细胞后，通ｓａｍｉＲ２１１０、ｈｓａｍｉＲ１２９０、过高通量测序发现ｈｈｓａｍｉＲ３１４４５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ａ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６８５７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７８０ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４４８７、ｈｓａｍｉＲ６７６３５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４９７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７７０５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４５０ａ２３ｐ、ｈｓａｍｉＲ１９５５ｐ、ｈａｓｍｉＲ４４３、ｈｓａｍｉＲ４７４９５ｐ的表达量升高（Ｐ＜０．０５），见图２。通过ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓ过表达上述ｍｉＲＮＡ后，发现过表达ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５），使用ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ敲低ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５），见图３和图４Ａ。此外，使用白花蛇舌草和ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ同时处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平无显著变化（Ｐ＞０．０５），见图４Ｂ。图２　白花蛇舌草处理后非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中　　ｍｉＲＮＡ的表达水平注：Ｐ＜０．０５图３　ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃｓ处理后非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平注：Ｐ＜０．０５图４　白花蛇舌草操控ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ调控非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡　　３　ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３调控非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡　　通过ｍｉＲＤＢ在线分析，发现ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ潜在靶向ＥＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＣＸＣＲ３、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９。通过ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｍｉｍｉｃｓ过表达ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的表达量下降（Ｐ＜０．０５），而ＥＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；通过ｍｉＲ４５０ａ２３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ敲低ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的表达量上升（Ｐ＜０．０５），而ＥＬＫ１、ＺＮＦ６２９、ＣＥＰ１３５、ＡＲＧＦＸ、ＳＵＳＤ２、ＩＧＦ２、ＺＤＨＨＣ８、ＹＥＳ１、ＺＢＴＢ３９差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见图５Ａ。通过荧光素酶报告实验发现ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的非编码区（Ｐ＜０．０５），见图５Ｂ。通过ＣＸＣＲ３过表达质粒过表达ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌２１６８细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５），见图６Ａ和６Ｂ；通过ｓｉＣＸＣＲ３敲低ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５），见图６Ｃ和６Ｄ。同时，白花蛇舌草处理后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的蛋白水平和ｍＲＮＡ水平均下降（Ｐ＜０．０５），见７Ａ和７Ｂ。同时敲低ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２水平没有明显变化（Ｐ＞０．０５），见图８Ａ；同时过表达ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ和ＣＸＣＲ３后，发现非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平没有明显变化，见图８Ｂ；将白花蛇舌草处理Ａ５４９细胞并过表达ＣＸＣＲ３后，发现非５４９的凋亡水平没有明显变化小细胞肺癌细胞Ａ（Ｐ＞０．０５），见图８Ｃ。注：０．０５Ｐ＜图５　ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的３端非编码区注：０．０５Ｐ＜图７　白花蛇舌草抑制ＣＸＣＲ３的表达注：０．０５Ｐ＜图６　ＣＸＣＲ３抑制非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡标记免疫分析与临床　２０２０年１２月第２７卷第１２期２１６９注：０．０５Ｐ＜图８　ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３调控非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡讨　　论　　肺癌是世界癌症相关死亡的主要原因，对人类１０］健康保健系统具有重大的社会和经济影响［。与ｉＲＮＡ能够癌的一个有希望的靶点。目前发现，众多ｍ２０］调控细胞的凋亡水平［。ｍｉＲＮＡｓ是内源性的短链ＮＡ，可通过调控转录后调控蛋白的翻译合非编码小Ｒ其他亚型（小细胞肺癌）相比，ＮＳＣＬＣ约占肺癌的７５％～８５％。不幸的是，非小细胞肺癌常对放疗和化疗产生耐药，且常发生于手术切除太晚，导致５年１１］总生存率＜１５％［。尽管ＮＳＣＬＣ的早期发现和治成参与癌症的发生发展。白花蛇舌草处理的非小细胞肺癌Ａ５４９细胞后，ｈｓａｍｉＲ２１１０、ｈｓａｍｉＲ１２９０、ｈｓａｍｉＲ３１４４５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ａ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６８５７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７８０ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４４８７、ｈｓａｍｉＲ６７６３５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４９７５ｐ、ｈｓａｍｉＲ６７７０５ｐ、ｈｓａｍｉＲ１５ｂ５ｐ、ｈｓａｍｉＲ４５０ａ２３ｐ、ｈｓａｍｉＲ１９５５ｐ、ｈａｓｍｉＲ４４３、ｈｓａｍｉＲ４７４９５ｐ的表达量升高（Ｐ＜０．０５）。过表达ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）；敲低ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５）。此外，白ｉＲ４５０ａ２３ｐ同时处理非小细胞肺癌细花蛇舌草和ｍ胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平无显著变化（Ｐ＞０．０５）。因此，ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ是白花蛇舌草促进非小细胞肺癌细胞Ａ５４９凋亡的执行者。　　本研究通过ｍｉＲＤＢ在线分析和荧光素酶报告实验，发现ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３的非编码区（Ｐ＜０．０５）。趋化因子根据Ｎ端半胱氨酸残基的数目和间隔可分为４个科，分别是Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ和ＣＸ３Ｃ。ＣＸＣ趋化因子主２１］。目前发现的要通过与特定受体结合参与肿瘤进展［［２２］ＣＸＣ受体为ＣＸＣＲ１ＣＸＣＲ７。不同趋化因子及其受２３］体的亲和力也不同，它们产生的生物学效应也不同［。０年有所改善，但仍有部分患者病情快速疗在过去２复发和进展，总体预后较差。因此，迫切需要开发治疗肺癌的有效药物和新策略。　　近年来，中医药被认为是恶性肿瘤的替代治疗方法［１２］。众所周知，草药提取物或各种中药化合物［１３］具有抗癌特性，包括肺癌。白花蛇舌草在中国是一个著名的中国民间传统医药，广泛分布在东北亚地区。一些药理研究表明，白花蛇舌草具有多种生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、神经保护、免疫调１４］节、肝保护和抗诱变特性［。在临床应用中，白花蛇舌草被广泛用于对抗胰腺、肝脏、结肠、脑癌等肿瘤，以及改善化疗的不良反应［１５］。在本研究中，发现白花蛇舌草处理非小细胞肺癌细胞Ａ５４９后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜０．０５）。植物化学研究表明，其主要成分为环烯醚苷类、苯丙１６］。更有趣的类、蒽醌类、甾体类、黄酮类和多糖［是，有证据表明，该草本多糖具有抑制肿瘤细胞增殖的能力因素。　　凋亡在机体组织的稳态和发育中起着关键作１８］用［。细胞增殖失衡和细胞凋亡是导致肿瘤发生发１９］。增强肺癌细胞凋亡是最终治愈肺展的主要原因［［１７］ＣＸＣＲ３是一种７跨膜ｇ蛋白偶联受体，其Ｎ端区和Ｃ端区位于细胞膜的跨膜部分。细胞膜外的Ｎ端区２４］。可与细胞因子结合，产生一系列的细胞信号［ＣＸＣＲ３在多种癌症中表达，如乳腺癌、胃癌、前列腺２５］癌等［。过表达ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞。因此，在白花蛇舌草的水抽提物中的多５４９凋亡的主要糖可能是促进非小细胞肺癌细胞ＡＡ５４９的凋亡水平下降（Ｐ＜０．０５）；敲低ＣＸＣＲ３后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９的凋亡水平上升（Ｐ＜２１７００．０５）。同时，白花蛇舌草处理后，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９中ＣＸＣＲ３的蛋白水平和ｍＲＮＡ水平均下降（Ｐ＜０．０５）。因此，ＣＸＣＲ３是一个潜在的促癌因子。作为ＣＸＣＲ３的上游，体外合成的ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ在合适的呈递系统下可能有抑制非小细胞肺癌发生发展的作用。　　综上所述，白花蛇舌草通过促进ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ的表达后，ｍｉＲ４５０ａ２３ｐ靶向ＣＸＣＲ３ｍＲＮＡ的非５４９的编码区，随后促进了非小细胞肺癌细胞Ａ凋亡。ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｄｅｃ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１２［Ｊ］．ＰｈｙｔｏｔｈｅｒＲｅｓ，ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｇｅｆｉｔｉｎｉｂ２０２０，３４（２）：３８８４００．［１２］ＳＯＮＧＹ，ＷＡＮＧＨ，ＰＡＮＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｈｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｗｉｌｌｄａｃｔｉｎｇｏｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ：ａｎｅｔｗｏｒｋｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１９，９（１０）：５９１．［１３］ＨＵＡＮＧＸ，ＷＵＹ，ＺＨＡＮＧＸ，ｅｔａｌ．ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｉｖｅＩｒｄｏｉｄＧｌｙｃｏｓｉｄｅｓａｎｄｔｈｒｅｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｎＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａＷｉｌｄｂｙＵＰＬＣＵＶｗｉｔｈｕｌｔｒａｓｏｕｎｄａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｕｒｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔＡｎａｌｙ，２０１９，１５（７）：８０８８１８．［１４］ＳＨＡＩＫＨＮＳ，ＴＨＡＬＫＡＲＩＡＢ，ＫＡＲＷＡＰＮ，ｅｔａｌ．Ｈｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａ：ＡｎｍｕｌｔｉｅｆｆｅｃｔｉｖｅＨｅｒｂ［Ｊ］．ＲｅｓＪＰｈａｒｍａｃｏｇｎＰｈｙｔｏｃｈｅｍ，２０１９，参考文献［１］李孝君，肖锋，肖茂良．参一胶囊联合安罗替尼治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究［Ｊ］．湖南师范大学学报（医学版），２０２０，１７（１）：８１８４．［２］ＣＨＥＮＬ，ＷＥＮＧＢ，ＬＩＨ，ｅｔａｌ．ＡｔｈｉｏｐｙｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｗｉｔｈｌｏｗｍｕｒｉｎｅｔｏｘｉｃｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｃｔｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈａＮＦκＢｍｅｄｉａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｏｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓｓｗｉｔｃｈ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０１９，２４（１２）：７４８２．［３］ＯＨＨＮ，ＬＥＥＭＨ，ＫＩＭＥ，ｅｔａｌ．ＬｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅＤｉｎｄｕｃｅｓＲＯＳｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｇｅｆｉｔｉｎｉｂｓｅｎｓｉｔｉｖｅｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｔｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＥＧＦＲａｎｄＭＥＴ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０２０，１０（２）：２９７．［４］ＴＯＮＧＱ，ＯＵＹＡＮＧＳ，ＣＨＥＮＲ，ｅｔａｌ．ＭＹＣＮｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨＥＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．ＡｍＪＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２０１９，９（９）：１９３８．［５］ＣＨＥＮＸ，ＷＵＱ，ＣＨＥＮＹ，ｅｔａｌ．ＤｉｏｓｍｅｔｉｎｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌｉｎｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｖｉａＮｒｆ２ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｒｉＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１９，１７６（１２）：２０７９２０９４．［６］ＬＩＨ，ＬＡＩＺ，ＹＡＮＧＨ，ｅｔａｌ．ＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａＷｉｌｌｄ．ｉｎｈｉｂｉｔｓＶＥＧＦＣｍｅｄｉａｔｅｄｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｖｉａｍｕｌｔｉｐｌｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌＲｅｐ，２０１９，４２（３）：１２２５１２３６．［７］ＬＩＵＪＦ．ＡｎｔｉｔｕｍｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＨｅｒｂａＨｅｄｙｏｔｉｄｉｓＤｉｆｆｕｓａｅ［Ｊ］．ＰｒｅｃｉｓＭｅｄＲｅｓ，２０２０，２（１）：１１１６．［８］ＬＩＮＬ，ＣＨＥＮＧＫ，ＨＥＺ，ｅｔａｌ．ＡｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａｉｎｔｅｒｒｕｐｔｓｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＡ５４９ｃｅｌｌｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＥＭＴｖｉａＥＧＦＲ／Ａｋｔ／ＥＲＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＢｉｏｌＭａｃｒｏｍｏｌ，２０１９，１２９（５）：７０６７１４．［９］兰建国．吴铁主任医师应用白花蛇舌草的临床经验［Ｊ］．中国中医药现代远程教育，２０１５，１３（１９）：３５３６．［１０］ＷＥＮＴＡＴ，ＲＹＣＨＬＯＷＳＫＩＭ，ＪＵＲＥＷＩＣＺＥ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＨｔｒＡ３ｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｍｏｔｅｓｄｒｕｇｉｎｄｕｃｅｄｄｅａｔｈｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔｈｅＸｌｉｎｋｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎ（ＸＩＡＰ）［Ｊ］．ＦＥＢＳＪ，２０１９，２８６（２２）：４５７９４５９６．［１１］ＯＨＨＮ，ＬＥＥＭＨ，ＫＩＭＥ，ｅｔａｌ．ＤｕａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＥＧＦＲａｎｄＭＥＴｂｙＥｃｈｉｎａｔｉｎｒｅｔａｒｄｓｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｌｕｎｇ１１（３）：１３７１４４．［１５］ＬＩＮＪ，ＣＨＥＮＹ，ＷＥＩＬ，ｅｔａｌ．ＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａＷｉｌｌｄｅｘｔｒａｃｔｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｖｉａａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｉｎｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ，２０１０，３７（５）：１３３１１３３８．［１６］ＬＩＵＺ，ＬＩＵＭ，ＬＩＵＭ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｈｙｌａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｆｒｏｍＨｅｄｙｏｔｉｓｄｉｆｆｕｓａＷＩＬＬＤｉｎｄｕｃｅｓＣａ２＋ｍｅｄｉａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＴｏｘｉｃｏｌＩｎＶｉｔｒｏ，２０１０，２４（１）：１４２１４７．［１７］ＬＩＮＪ，ＷＥＩＬ，ＸＵＷ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆＨｅｄｙｏｔｉｓＤｉｆｆｕｓａＷｉｌｌｄｅｘｔｒａｃｔｏｎｔｕｍｏｒａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＭｏｌＭｅｄＲｅｐ，２０１１，４（６）：１２８３１２８８．［１８］ＦＡＮＪ，ＲＥＮＤ，ＷＡＮＧＪ，ｅｔａｌ．ＢｒｕｃｅｉｎｅＤｉｎｄｕｃｅｓｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｖｉａｔｈｅＲＯＳ／ＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ，２０２０，１１（２）：１２６．［１９］ＦＡＮＪ，ＷＵＭ，ＷＡＮＧＪ，ｅｔａｌ．１，７Ｂｉｓ（４ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）１，４ｈｅｐｔａｄｉｅｎ３ｏｎｅｉｎｄｕｃｅｓｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｖｉａｔｈｅＰＩ３Ｋ／ＡｋｔａｎｄＥＲＫ１／２ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，２３４（５）：６３３６６３４９．［２０］ＣＵＩＦ，ＺＨＯＵＱ，ＸＩＡＯＫ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｍｉｃｒｏＲＮＡｈｓａｌｅｔ７ｇｐｒｏｍｏｔｅｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＨＯＸＢ１［Ｊ］．ＹｏｎｓｅｉＭｅｄＪ，２０２０，６１（３）：２１０２１７．［２１］ＭＡＢ，ＫＨＡＺＡＬＩＡ，ＳＨＡＯＨ，ｅｔａｌ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃＣＸＣＲ３ｉｓｏｆｏｒｍｓｉｍｐａｃｔｅａｃｈｏｔｈｅｒｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣｅｌｌＣｏｍｍｕｎＳｉｇｎａｌ，２０１９，１７（１）：１６４．［２２］ＧＵＯＫ，ＦＥＮＧＧ，ＹＡＮＱ，ｅｔａｌ．ＣＸＣＲ４ａｎｄＣＸＣＲ３ａｒｅｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ：ＤａｔａｂａｓｅｍｉｎｉｎｇｆｏｒＣＸＣＲｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓ［Ｊ］．ＭｏｌＭｅｄＲｅｐ，２０１９，２０（６）：４７９１４８０２．［２３］ＷＡＮＧＤ，ＹＵＷ，ＬＩＡＮＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈ１７ｃｅｌｌｓｉｎｈｉｂｉｔＣＤ８＋ＴｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＣＸＣＲ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｉａＩＬ１７Ａ／ＳＴＡＴ３ｉｎａｄｖａｎｃｅｄｓｔａｇｅｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＪＨｅｍａｔｏｌＯｎｃｏｌ，２０２０，１３（１）：６８．［２４］ＳＡＡＨＥＮＥＲＯ，ＷＡＮＧＪ，ＷＡＮＧＭＬ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｌｉｇａｎｄ４／ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ３Ｂｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈＨｉｓｔｏｃｈｅｍ，２０１９，９４（１）：５３５９．［２５］ＢＯＮＡＮＮＩＶ，ＡＮＴＯＮＡＮＧＥＬＩＦ，ＳＡＮＴＯＮＩＡ，ｅｔａｌ．ＴａｒｇｅｔｉｎｇｏｆＣＸＣＲ３ｉｍｐｒｏｖｅｓａｎｔｉｍｙｅｌｏｍａｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｄｏｐｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄａｃｔｉｖａｔｅｄｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＣａｎｃｅｒ，２０１９，７（１）：２９０．