2024年4月16日发(作者：)

2021

年

6

月

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

June

2021

第

41

卷第

6

期

Vol.41

No.6

文章编号

：

1001-6325(2021)06-0811-07

研究论文

hnRNPA3

通过影响

mRNA

出核调控

hESCs

多能性

杨嘉宾

，

陈仲扬

，

周凡琦

，

余

*

,马艳妮

佳

(中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系

医学分子生物学国家重点实验室北京

100005)

摘要

：

目的探究

RNA

结合蛋白异质核核糖核蛋白

A3(hnRNPA3)

在人胚胎干细胞

(hESCs)

多能性维持中的生物

学功能

，

揭示其在

RNA

运输过程中的新机制。

方法在

hESC

中通过核孔复合物免疫共沉淀及细胞核质分离检测

hnRNPA3

与核孔互作情况及定位;抑制

hnRNPA3

内源表达后进行克隆形成及碱性磷酸酶染色实验

,qPCR

检测多

能性/分化标志基因的表达变化

，

利用

RNA

荧光原位杂交技术检测对

polyA+

RNA

及

OCT4

mRNA

核质分布的影

响;预测

hnRNPA3

与已知出核相关蛋白结合情况

。

结果

hnRNPA3

定位在细胞核且与核孔互作

，

抑制

hnRNPA3

的

内源表达后显著抑制了

hESCs

的克隆形成能力

(P<0.

05)

并导致细胞分化标志基因表达水平升高

(P<0.

001),

同时

显著抑制了

polyA

+

RNA

及

OCT4

mRNA

的出核

(P<0.

001)

o

蛋白质互作网络预测出

hnRNPA3

与约

1/3

的已知出

核相关蛋白结合

。

结论

hnRNP

A3

通过影响

mRNA

出核调控

hESCs

多能性

。

关键词

：

人胚胎干细胞

；

异质核核糖核蛋白

A3

；

多能性与自我更新;

mRNA

运输

中图分类号:

R34

文献标志码:

A

hnRNP

A3

regulates

hESCs

pluripotency

through

modulating

mRNA

export

YANG

Jia-bin,

CHEN

Zhong-yang,

ZHOU

Fan-qi,

YU

Jia

*

,

MA

Yan-ni

*

(

State

Key

Laboratory

of

Medical

Molecular

Biology

,

Department

of

Biochemistry

and

Molecular

Biology

,

Institute

of

Basic

Medicine

Sciences

CAMS,

School

of

Basic

Medicine

PUMC

,

Beijing

100005,

China)

Abstract

:

Objective

To

explore

the

biological

function

of

RNA

binding

protein

heterogeneous

nuclear

ribonucleo

­

protein

A3

(

hnRNP

A3

)

in

the

maintenance

of

pluripotency

of

human

embryonic

stem

cells

(

hESCs

)

and

to

reveal

its

new

mechanism

in

RNA

transport.

Methods

The

interaction

of

hnRNP

A3

with

nuclear

pore

and

localization

were

examined

by

immunoprecipitation

of

nuclear

pore

complex

and

cytoplasmic

separation

in

hESCs.

After

inhibi

­

ting

the

endogenous

expression

of

hnRNP

A3

，

the

expression

of

the

pluripotency/differentiation

marker

genes

was

detected

by

qPCR,

and

the

effect

on

the

nucleoplasmic

distribution

of

poly

A

+

RNA

and

OCT4

mRNA

was

tested

by

RNA

fluorescence

in

situ

hybridization

to

predict

the

binding

of

hnRNP

A3

to

known

RNA

export

associated

proteins.

Results

hnRNP

A3

was

localized

in

the

nucleus

and

interacted

with

the

nuclear

pore

・

Inhibiting

the

endogenous

ex

­

pression

of

hnRNP

A3

significantly

inhibited

the

cloning-formation

ability

of

hESC(P<0.

05)

and

resulted

in

the

in

­

crease

of

the

expression

of

cell

differentiation

markers

(P<

0

・

001)

and

significantly

inhibited

the

export

of

poly

A

+

RNA

as

well

as

OCT4

mRNA(P<0.

001).

The

protein

interaction

network

predicted

that

hnRNP

A3

may

bind

to

收稿日期

：

2020-01-20

修回日期

：

2021-03-31

基金项目

：

国家自然科学基金

(81970101)

*

通信作者

(

corresponding

author

)

:

j-yu@

；

yanni_ma@

812

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

2021.41(6)

about

one-third

of

the

known

RNA

export

associated

proteins.

Conclusions

hnRNPA3

regulates

hESC

pluripotency

by

impacting

on

mRNA

export.

Key

words

:

human

embryonic

stem

cells

；

hnRNPA3

；

pluripotency

and

self-renewal

；

mRNA

transport

人胚胎

干细胞

（

human

embryonic

stem

cells

,

hESCs

）

是研究早期胚胎发育的细胞模型

。

hESCs

从囊胚期的内细胞团分离而来

，

在体外可无限增殖

并可分化成各种不同类型的体细胞⑴

，

因而具有极

其重要的研究和临床应用价值

。

hESCs

中基因表达

调控在多层次之间存在复杂相互作用

,

其自我更新

调控机制在转录水平得到了广泛而复杂的描述⑵

，

但是缺乏对

RNA

运输等转录后水平的了解

。

真核生物在进化上区别于原核生物的特点之一

是有核膜包被的细胞核

，

因此

mRNA

运输是调节哺

乳动物基因表达途径中潜在的重要节点

。

多种生物

过程包括

DNA

修复

、

基因表达

、

应激反应

、

细胞增

殖

、

细胞存活和造血细胞分化都可以通过

mRNA

的

选择性出核来调控⑶

。

在经典的

mRNA

运输途径

中

,mRNA

加工完成后会募集出核相关蛋白,形成具

有出核能力的

mRNP

,

与核孔蛋白进行对接

，

交换信

息后通过核孔进入到细胞质中

，

进一步运输到翻译

机器上进行翻译,在这个过程中

，

核孔作为看门人发

挥着重要作用⑷

。

RNA

结合蛋白异质核核糖核蛋白

A3

（

heteroge

­

neous

nuclear

ribonucleoprotein

A3,hnRNPA3

）

在调节

RNA

的胞质运输方面发挥着非常重要的作用⑸

。

本

研究旨在探究

hnRNPA3

在

hESCs

维持自我更新中的

生物学功能

，

探讨其在

RNA

运输过程中的新机制

。

1

材料与方法

1.1

材料

1.

1.1

细胞

：

hESCs

为

H1

细胞系

（

中国医学科学

院血液学研究所赠送

）

。

1. 1.

2

主要试剂:

Matrigel

（

Coming

公司

）

；

mTESRl

、

ReLeSR

和

Accutase

（

Stem

Cell

公司

）

；

NPC

抗体

（

Abeam

公司

）

；

protein

A

磁珠

、

核质分离试剂盒

（

Thermo

Fisher

Scientificals

公司

）

；

RT-qPCR

试剂

（

TaKaRa

公司

）

；

构建质粒所需的内切酶

（

NEB

公

司

）

；

Mouse

IgG

抗体

、

AP

染色试剂盒

（

Millipore

公

司

）

；

Trizol

、

M-MLV

反转录试剂盒

（

Invitrogen

公司

）

；

NPC

抗体

（

Abeam

公司

）

;抗

Nup62

抗体

、

抗

Nup88

抗

体

、

抗

HSP90

抗体

、

抗

fibrillin

抗体

、

抗

tubulin

抗体

、

抗

-laminB

抗体和抗

hnRNPA3

抗体

（

Proteintech

公

司

）

，

山羊抗兔

、

山羊抗小鼠二抗

（

上海碧云天生物有

限公司

）

；多能分化基因

qPCR

引物

（

天一辉远测序公

司

）

；

FISH

试剂盒:

RNAscope®

Fluorescent

Multiplex

Kit

、

polyA+

RNA

探针

、

OCT4

mRNA

探针

（

ACD

公司

）

o

1.2

方法

1.

2.

1

体外培养

hESCs

:

将

matrigel

铺至

6

孔板

4

七过夜后接种

H1

克隆

。

使用

mTeSR

叫培养

，

观

察密度

°

4

~

6

d

传代

1

次:

DPBS

（

Dulbecco

5

s

Phos-

phate-Buffered

Saline

）

清洗细胞

，

加入

1

mL

ReLeSR

室温静置

1

min

后吸净

。

将细胞放至

37

七孵箱中

6~8

min

o

加入

3

mL

mTESRl

将克隆重悬,传代至

6

孔板中进行培养

。

1.

2.

2

免疫共沉淀

（

co-immunoprecipitation

,

Co-IP

）

检测:收集新鲜的细胞

6X10

6

个

，

用

ImL

含有蛋白

酶抑制剂的裂解液冰上裂解

30

min,

4

°C

16

000

x

g

离心

15

min,

取

40

|1L

裂解液作为

input

备用

，

分成

两管裂解液分别加入

5

|ig

NPC

抗体和鼠

IgG

抗体,

4

°C

旋转孵育过夜

。

将

100

|1L

蛋白

A

磁珠分别加

入到两管裂解液中

,4

玄旋转孵育

4~6

h

o

用磁力

架吸附磁珠并清洗

3

次

，

加

SDS

上样缓冲液

50

|iL

煮沸洗脱蛋白

。

1.2.3

分离细胞核和细胞质:使用核质分离试剂

盒

，按照细胞体积加入适量预冷

Cytoplasmic

Extraction

Reagent

I

（

CER

I

）

重悬细胞

，

涡旋振荡

15

s,

冰上孵育

10

min,

加入预冷

Cytoplasmic

Extrac

­

tion

Reagent

H

（

CER

U

）

涡旋振荡

5

s,

冰上孵育

1

min,

涡旋振荡

5

s

后

16

000

Xg

离心

5

min,

立即转

移上清至干净的管中

，

此为细胞质成分

。

向剩余沉

淀部分中加入适量预冷

Nuclear

Extraction

Reagent

（

NER

）

，

涡旋振荡

15

s

后冰上孵育

40

min

且每

10

min

振荡混匀

15

s,16

000xg

离心

10

min,

转移上

清至新管中

，

此为细胞核成分

。

1.

2.

4

Western

blot

检测蛋白表达:提取蛋白后进

行

SDS-PAGE

电泳

，

湿转法转到

PVDF

膜上

,5%

脱

脂牛奶室温封闭

1

h,

—

抗

4

弋孵育过夜

。

TBST

洗

杨嘉宾

hnRNP

A3

通过影响

mRNA

出核调控

hESCs

多能性

813

涤后加入二抗室温孵育

40

min,TBST

洗膜后用化学

发光法显影

。

1.2.5

shRNA

载体的构建:通过

shRNA

干扰片段

在线设计网站

http

:

//maidesigner

.

Thermofisher,

com/

maiexpress/

以及

hnRNP

A3

的序列

，

设计

1

条

shRNA

并在两端连接相应的酶切位点黏性末端

，

序列由天

一辉远生物技术有限公司合成

。

合成的片段退火,

退火得到的片段与

pLKO.

1

载体连接

。

1.

2.

6

克隆形成能力检测及碱性磷酸酶

（

alkaline

phosphatase

,

AP

）

染色

：

6

孔板每孔

5

x

10

3

个单细

胞

，

培养

5~7

d,

进行碱性磷酸酶染色

，

用

4%

多聚

甲醛固定细胞

2

min

后

，

PBS

洗

1

次

，

试剂按照

FRV

:

Naphthol

:

water

=2

：

1

：

1

配置好后加入细

胞中

，

室温避光放置

15

min,

去掉染色试剂加

PBS

洗

1

次后镜下观察

。

1.

2.

7

实时荧光定量

PCR

（

RT-qPCR

）

检测

RNA

：

Trizol

法提取细胞总

RNA,

测定

RNA

样品的浓度和

纯度

。

M-MLV

合成

cDNA

第一链

，

每个样品实验设

置

3

个复孔

，

检测总体积为

20

让

。

程序如下

：

94

七

10

s,

58

弋

10

s,

72

弋

20

s,

共

40

个循环

。

RT-qPCR

用到的引物见表

1

。

表

］

RT-qPCR

引物

Table

1

Primer

sequences

for

RT-qPCR

target

gene

primer

sequence

（

5

’

-3

，

）

P-actin

F

:

AGAGCTACGAGCTGCCTGAC

R

:

AGCACTGTGTTGGCGTACAG

OCT4

F

:

CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTA

R

：

TTACAGAACCACACTCGGACCAC

SOX2

F

：

CCACTTTAGAGGCACAGACTAT

R

：

CACGAAGCACCTGCAATAAG

NANOG

F

：

GAAATACCTCAGCCTCCAGCAGAT

R

：

CCTGCGTCACACCATTGCTATTC

GATA1

F

：

ACCAACTGCCAGACGACCAC

R

：

CGAGTCTGAATACCATCCTTCCGC

HAND1F

：

CTGGCTCTTTCTCTCTTGTCCCTC

R

：

CCTGCGTCTGGTTCTCTTTCTCA

GATA2

F

：

GACGACAACCACCACC1TATGG

R

：

GCTCTTCTTGGAdTGlTGGACAT

BRACHYURY

F

：

ACAAAGAGATGATGGAGGAACCCG

R

：

GGTAGGTGGGCTGGCATTGT

GATA3

F

:

TGGTGGTGGTGGTCTGACAHTTCG

R

:

ATCAAGCCCAAGCGAAGGCTGTC

1.

2.

8

RNA

荧光原位杂交

（

fluorescence

in

situ

hy

­

bridization,

FISH

）

技术:前

1

d

将细胞铺到腔室盖玻

片上过夜

。用

PBS

洗

1

次后加

4%

的多聚甲醛固定

30

min,PBS

洗

2

次,梯度脱水后用蛋白酶

A

通透

10

min,

加

RNA

探针

40

咒孵育

2

h,

依次加入扩大

信号试剂

AMP1

、

AMP2

、

AMP3

、

AMP4

孵育,用含有

DAPI

的封片剂封片

，

次日用

Leica

显微镜

DM6B

拍

照

，

使用

Cellprofiler

软件进行荧光信号统计

。

1.2.9

蛋白质互作网络预测网站

：

https

：

//

string-db.

org/

0

1.3

统计学分析

运用

GraphPad

Prism

软件进行统计学分析

，

计

量资料均用均值土标准差

（

历土

s

）

表示

,

两组间比较用

t

检验,所有实验重复

3

次以上

。

2

结果

2.

1

抑制内源

hnRNPA3

的表达降低了

hESCs

自

我更新能力

在

hESCs

细胞中构建一条位点特异的

shRNA

能显著抑制

hnRNPA3

蛋白表达

（

图

1A

）

，

可用于后

续功能实验

。

抑制

hnRNP

A3

的表达导致

hESCs

细

胞克隆变小

（

图

IB

）

,

hESCs

克隆形成能力降低

（

P<

0.

05

）（

图

1C

）

，

并且在分子水平上促进了分化标志

基因的表达

（

P<0.

001

）

，

但多能性标志基因

RNA

水

平未发生明显的变化

（

图

1D

）

。

2.2

hnRNPA3

定位在细胞核中并与核孔复合物互作

分离

hESCs

细胞核与细胞质后,可见细胞质标

志蛋白

HSP90

和

tubulin

蛋白主要定位在细胞质

中

，

细胞核标志蛋白

fibrillin

和

tubulin

主要定位在

细胞核中,在核质分离成功的情况下,

RNA

结合蛋

白

hnRNP

A3

主要定位在细胞核中

（

图

2A

）

。

由于

hnRNP

A3

在过去报道中参与胞质

RNA

转运⑼

，

选

择核孔复合物进行

Co-IP,

在核孔主要组分

NUP88

、

NUP62

⑸高度富集的情况下,

hnRNPA3

与核孔复合

物发生特异性结合

（

图

2B

）

。

2.

3

抑制内源

hnRNPA3

的表达减弱了

OCT4

mRNA

及

polyA

+

RNA

的出核能力

抑制

hnRNP

A3

的表达后检测

OCT4

mRNA

核

质分布发现,

WT

（

wide

type

）

hESCs

中

OCT4

mRNA

主要分布在细胞质中

,

当

hnRNP

A3

表达降低后其出

现了显著的核滞留

（

图

3A

）

。

为探究

hnRNP

A3

对

814

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

shNC

shhnRNPA3

2021.41(6)

control

shl

kn

shNC

shhnRNPAB

2

5(

2(

00

c

JuqLm

匚

•5o

A

Koo

工

50

o

c

110

SI

IN

c

sldmRNPA3

宰半

胡

总

dNU

■

nsiiNC

■shluiRNPAS

2.0

p

2

N

^

m

l

o

u

p

E

E

o

J

l

u

c

n

・

efl

s

QJ

J

l

d

x

u

9()

70

□

shNC

■

shhnRNPA3

A.

Western

blot

was

used

to

detect

the

knock

down

efficiency

of

hnRNPA3

protein

；

B.

cell

clone

morphology

was

observed

under

microscope

and

stained

with

alkaline

phosphatase

(

X

100)

；

C.

alkaline

phosphatase

staining

showed

the

formation

of

clones

and

made

statistics

,

*

P<0.

05

compared

with

shNC;

D.

expression

changes

of

pluripotent

marker

genes

(

0CT4,

SOX2,

Nanog,

GATA1)

,

T<0.

05,

*

T<0.

01,

**

T<0.

mRNA

出核的调控是否具有广谱性

，

抑制

hnRJNPA3

的表达后检测

polyA

+

RNA

核质分布发现,

WT

hESCs

中

polyA

+

RNA

核质均有分布

，

当

hnRNPA3

表达降低

后在核内有明显聚集

，

核质信号比增大

（

图

3B

）

。

2.4

hnRNPA3

与约

1/3

的已知出核相关蛋白质

结合

过去文献共报道

68

个出核相关蛋白质⑸

，从蛋

白质互作网站预测到

hnRNPA3

与其中近

1/3

（

20

个

）

数量的蛋白相互作用

（

图

4A

）

,

将其通过蛋白互

L

E

O

60

p

OJ

zylEU-cou

UAUTqxI

・

OCT4

SOX2

NANOG

GATA1

D

«

001

compared

with

shNC

group

图

1

hnRNPA3

对

hESCs

多能性维持的影响

Fig

1

Effect

of

hnRNPA3

on

the

maintenance

of

hESCs

pluripotency

,

w>3)

作网络进行展示

（

图

4B

）

，

其中包括

RNA

加帽蛋白

NCBP1

〔

C

、

NCBP2,

剪接相关蛋白

SRSF

家族⑺

，

核

孔蛋白

NUP98

[5]

、

hnRNPA3

还与已报道特异性调控

多能性

mRNA

出核的

THOC2

⑻

有互作关系

。

3

讨论

hESC

有一个复杂的基因表达程序

，

控制自我更

新和分化之间的微妙平衡

。

Oct4

是

hESCs

多能性

维持必不可少的基因

，

其表达的改变会导致

hESCs

命

杨嘉宾

hnRNPA3

通过影响

mRNA

出核调控

hESCs

多能性

cytoplasm

nucleus

ku

HSP90

815

tubulin

input

IgG

IP

ku

fibrillin

NUP88

lamin

B

NUP62

■W

G2

luiRNPA3

lmRNPA3

B

A.

cell

localization

of

marker

proteins

(

Hsp90

,

tubulin

,

fibrillin

and

tubulin

)

and

hnRNPA3

were

detected

by

Western

blot

；

B.

enrichment

of

nucleopare

NUP88/NUP62

and

the

interaction

between

hnRNPA3

and

nucleopare

complex

were

de

­

tected

by

Western

blot

图

2

RNA

结合蛋白

hnRNPA3

在

hESCs

中定位情况

Fig

2

Localization

of

RNA

binding

protein

hnRNPA3

in

hESCs

Od'4

DAPI

merge

20

屮

it

20

gm

20

gni

P

$

•

■

20

Jim

.20

円

n

ML

.

Jim

■

•

20

A

poly

A'

DAPI

merge

■

■

•

Sff

,Lim

20

pin

2

“

mn

a

.

■

•

•

■

•

了

-20 jun

■

•

•

・

•

■

20

|

liui

•

20

luii

A.

fluorescence

signals

of

107

cells

in

the

negative

control

group

and

100

cells

in

the

hnRNPA3

knockdown

group

(

X40)

,

tP<0.

001

compared

with

negative

control

group

；

B.

fluorescence

signals

of

170

cells

in

the

negative

control

group

and

221

cells

in

the

hnRJNPA3

knockdown

group

(

X40)

；

*

P<0.

001

compared

with

negative

control

group

图

3

hnRNPA3

对

mRNA

出核的影响

3

Effect

of

hnRNPA3

on

mRNA

export

(

x±s

,

n>3)

816

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

2021.41(6)

图

4

hnRNPA3

与出核调控因子的联系

Fig

4

A

association

between

hnRNPA3

and

the

RNA

export

foctors

运发生不可逆转的变化⑼

。

虽然转录可能在基因

mRNA

的出核来调节多能性

。

调控中起着开关的作用

，

但近期研究已经开始揭示

转录后调控机制在维持

hESCs

状态的重要性

，

如非

本研究也探讨了

hnRNPA3

调控

RNA

运输的新

机制

。

在经典的出核途径中,

mRNA

在细胞核中被

RNA

结合蛋白加工成熟后赋予出核能力

，

历经核质

编码

RNA

、

选择性剪接

、

聚腺苛酸化和

RNA

稳定

性

3

叭

因此可能除了转录外

，

还存在转录后模块

运输的重要通道核孔进入到细胞质中被翻译

。

RNA

结合蛋白

hnRNPA3

与

20

个已知报道的出核相关蛋

与转录协同作用

，

控制

hESCs

中的基因表达网络

。

本研究表明,

hnRNPA3

对

hESCs

自我更新能力

的维持有重要的作用

,

主要表现在两个方面:一方面

hnRNPA3

不影响多能性基因

mRNA

表达水平

，

而是

白互作

，

这些出核相关蛋白偶联了

RNA

加工和出核

过程

。

hnRNPA3

可能在

mRNA

的加工时或者加工

完成后募集到

mRNA

上

，

帮助募集一部分出核相关

蛋白来帮助加工进而赋予

mRNA

出核能力

，

当

mRNA

在出核相关蛋白的辅助下通过核孔时,

hnRNPA3

又可以和核孔互作调节核孔的开关或松

定位在细胞核中且与核孔复合物相互作用

,

调节多

能性基因

OCT4

mRNA

出核来维持

hESCs

多能性;

另一方面

hnRNPA3

通过抑制分化标志基因

mRNA

水平的表达来进一步维持

hESCs

多能性

。

然而不

能排除

hnRNPA3

通过其他方式调节多能性的可能

弛状态使得

mRNA

顺利运输到细胞质

。

之前的研

究表明

，

hnRNPA3

还调节细胞质中

mRNA

的运

性,比如从其广谱性调节

polyA+

RNA

出核的表现来

看

，

除了调节多能基因外

，

可能还通过调节其他

输

［

⑶

，

可见

hnRNPA3

在

mRNA

代谢过程中发挥了

重要的作用

。

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export

through

an

additional

cap-binding

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Oct-3/4

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diSerentiation

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export

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本刊封面及网页改版公告

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月第

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、

础

（

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善

X

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还

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21

础岳学斫究所北京协和医院

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年

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