2024年4月11日发(作者：)

实用医院临床杂志２０１０年９月第７卷第５期　

１７　

免疫组化、明胶酶谱、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ检测涎腺肿瘤中　

基质金属蛋白酶ＭＭＰ一２、ＭＭＰ．９表达的比较与评价　

田鲲　，彭敏　，陈宇２，耿－７２　

（１．四川省医学科学院・四川省人民医院口腔科，四川成都６１００７２；２．四川大学华西口腔医学院病理科，四川成都６１００４１）　

【摘要】　目的　评价免疫组化、明胶酶谱、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测涎腺良恶性肿瘤中基质金属蛋白酶ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９表　

达的优点与局限性。方法分别运用免疫组化、明胶酶谱、Ｗｅｓｔｅｎ　ｂｌｒｏｔ对３４例涎腺良恶性肿瘤进行ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９定　

位、半定量、定量检测和活性酶含量的分析，比较各方法检测结果的差异。结果免疫组化方法能定位、半定量检测出基　

质金属蛋白酶在良恶性肿瘤间的差异；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ能定量说明基质金属蛋白酶在良恶性肿瘤间的差异；明胶酶谱法能　

检测出ＭＭＰ一２、ＭＭＰ－９酶原和活性酶在良恶性肿瘤间的差异。结论　免疫组化、Ｗｅｓｔｅｎ　ｒｂｌｏｔ、明胶酶谱三种方法结合，　

既发挥免疫组化细胞定位的优势，又克服了免疫组化法非精确定量的弱点，并打破其不能辨别酶原与活性酶的局限性，　

更加客观准确反映各型肿瘤组织中ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９的实际表达。　

【关键词】　免疫组化；明胶酶谱；Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ；涎腺肿瘤；基质金属蛋白酶　

【中图分类号】Ｒ７３９．８７　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２－６１７０（２０１０）０５－００１７－０５　

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰＩ２　ａｎｄ　Ｍ［ＭＰ＿９　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。ｇｅｌａｔｉｎ　ｚｙ－　

ｍｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｓａｌｉｖａｒｙ　ｇｌａｎｄ　ｔｕｍｏｒｓ　ＴＩＡＮ　Ｋｕｎ’，ＰＥＮＧ　Ｍｉｎ　，ＣＨＥＮ　Ｙｕ　，　

ＧＥＮＧ　Ｎｉｎｇ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉ－　

ｔａｌ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００７２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｏｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｙ。ｇＳｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　

Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００４１。Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｍｅｒｉｔｓ　ａｎｄ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｇｅｌａｔｉｎ　ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　

ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－２　ａｎｄ　ＭＭＰ－９　ｉｎ　ｓａｌｉｖａｒｙ　ｇｌａｎｄ　ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ—　

ｉｓｔｒｙ，Ｇｅｌａｔｉｎ　ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　８　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ａｎｄ　２６　ｂｅｎｉｇｎ　ｓａｌｉｖａｒｙ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｓ　ｔｏ　ｃａｒｒｙ　ｏｕｔ　ｌｏ—　

ｅａｌｉｚａｔｉｏｎ。ｓｅｍｉ—ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ＭＭＰ－２　ａｎｄ　ＭＭＰ－９．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｍ—　

ｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｌｏｃａｔｅ　ａｎｄ　ｓｅｍｉ—ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｉｎ　ｂｅｎｉｎ　ｇ

ａｎｄ　ｍａｌｉｎａｎｔｇ　ｔｕｍｏｒｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｃｏｕｌｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｓｃｒｉｂｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｉｎ　ｂｅｎｉｇｎ　ａｎｄ　

ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｔｕｍｏｒｓ．Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ　ｃｏｕｌｄ　ｄｅｔｅｃｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｚｙｍｏｇｅｎ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｏｆ　ＭＭＰ－２　ａｎｄ　ＭＭＰ－９　ｉｎ　ｂｅｎｉｇｎ　ａｎｄ　

ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，Ｇｅｌｒａｔｉｎ　ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｃａｎ　ｎｏｔ　

ｏｎｌｙ　ｐｌａｙ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｌｏｎｅ－ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｏｖｅｒｃｏｍｅ　ｔｈｅ　ｗｅａｋｎｅｓｓｅｓ　ｏｆ　ｉｎｅｘａｃｔ　ｑｕａｎ—　

ｔｉｔａｔｉｖｅ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｏｎ　ｄｉｓｃｅｒｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ，ＳＯ　ａｓ　ｔｏ　ｒｅｆｌｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｃｔｕａｌ　

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－２　ａｎｄ　ＭＭＰ－９　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｍｏｒｅ　ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ．　

【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｇｅｌａｔｉｎ　ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ；Ｓａｌｉｖａｒｙ　ｇｌａｎｄ　ｔｕｍｏｒ；Ｍａｔｉｒｘ　ｍｅｔｌａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　

基质金属蛋白酶一ＭＭＰ’２、ＭＭＰ－９是主要降解基　

虑实验设备、技术手段、经费预算等多方面因素，最常用　

底膜上ＩＶ型胶原的基质金属蛋白酶类，与恶性肿瘤浸　

的还是免疫组化、免疫荧光、胶原底物降解、明胶酶谱几　

ｅｒｎ　

润转移的关系尤为密切…。近年来，对ＭＭＰ一２、ＭＭＰ－９　

种方法。本研究分别采用免疫组化、明胶酶谱、Ｗｅｓｔ

ｂｌｏｔ三种方法检测ＭＭＰ一２、ＭＭＰ－９的活性，评价三种方　

的研究较为深入和广泛，研究方法也分门别类。就蛋白　

２、ＭＭＰ－９表达的优点与局限性，为更加客　

水平而言，主要实验手段有免疫组织化学、免疫荧光、酶　

法检测ＭＭＰ－

２、ＭＭＰ－９的实际　

联免疫吸收检测、胶原底物降解检测、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ印　

观准确的反映各型肿瘤组织中ＭＭＰ－

　

迹、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印迹、明胶酶谱法等等¨　Ｊ。各种方法　

表达，探讨出一种经济、快速、准确的检测手段。

侧重点不尽相同，其中免疫组织化学和免疫荧光重点在　

１材料与方法　

蛋白的组织定位和半定量，酶联免疫吸收检测、胶原底　

１．１材料选择四川省医学科学院・四川省人民医院　

物降解检测、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ印迹、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印迹几种　口腔颌面外科及四川大学华西口腔医学院颌面外科涎　

方法在严格控制实验条件的前提下可以做到蛋白定量　

腺肿瘤患者手术切除新鲜组织，其中良性肿瘤２６例　

检测，而明胶酶谱则能够区分酶原和活化酶。若综合考　（基底细胞腺瘤３例、肌上皮瘤３例、多形性腺瘤２０　

ｌ８　

实用医院临床杂志２０１０年９月第７卷第５期　

例），恶性８例（黏液表皮样癌、腺样囊性癌各２例，腺　ＮａＣ１　０．８７％，Ｔｗｅｅｎ－２０　０．００１％ｗ／ｖ）中充分振荡清洗，　

泡细胞癌、恶性肌上皮瘤各１例，低分化腺癌２例）。排　

分别滴加一、二、三抗（抗体来源同免疫组化法），一抗　

除复发涎腺肿瘤和术前曾接受抗肿瘤治疗的患者。　

１．２方法　

终浓度为１　ｇ／ｍｌ，二、三抗稀释比例为１：６０００，ＤＡＢ　

显色。　

１．２．１免疫组化ｓＰ法单克隆抗体ＭＭＰ一２、ＭＭＰ－９，　

１．３结果判断　

１．３．１免疫组化参考Ｎａｇｅｌｌ５　Ｊ的方法并加以改良进　

ｓＰ试剂盒购自ＺＹＭＥＤ公司（１：１００）。３％Ｈ　０：封闭　

无阳性细胞为阴性，记为０；染色阳性细胞数＜　

内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，１０％正常羊血　

行计分，

清孵育，滴加一抗，４℃冰箱中过夜，ＰＢＳ缓冲液　

１０％记为１分；１０％～５０％记为２分；＞５０％记为３分。　

（Ｎａ２ＨＰＯ４　８．１　ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４　１．５　ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＣ１　１３７　

１．３．２明胶酶谱、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　４５０００００像素数码照　

件进行图像分析，记录积分光密度ＩＯＤ。　

据，采用Ｍａｎｎ—Ｗｈｉｔｎｅｙ检验和Ｌｏｇｉｓｔｉｅ回归分析。　

２结果　

０　

ｍｍｏ］／Ｌ，２．７　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　７．４）振荡清洗后分别滴加二、　

相机拍照，ｉｍａｇｅ　ｐｒｏ　ｐｌｕｓ　４．１０版本的专业图像分析软　

三抗，ＤＡＢ显色，苏木素复染，常规封片。　

１．２．２明胶酶谱法标本离体后一７０℃冰箱内保存。　

１．４统计学方法　以ＳＰＳＳ　１０．０统计学软件处理数　

ｉ・　常规匀浆、离心制备组织蛋白抽提液，提取上样于含　

０．１％明胶的７．５％聚丙烯酰胺凝胶进行ＳＤＳ．ＰＡＣＥ电　

泳，分子量Ｍａｒｋｅｒ采用低分子量蛋白标准品。电泳结　

２．１　免疫组化　阳性信号呈棕色细颗粒状，定位　舯　

束后将胶体置于洗脱液（２．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ．１００）中震荡洗　

瘤细胞胞浆内，镜下积分结果见表１。ＭＭＰ一２在全部　

涤；明胶缓冲液（５０　ｍＭ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，１００　ｍＭ／Ｌ　ＣａＣＩ２，２００　

３４例肿瘤中有不同程度表达（３４／３４），良性肿瘤中　

ｍＭ／Ｌ　ＮａＣ１，１　ｔｘＭ／Ｌ　ＺｎＣ１　）３７℃孵育ｌ８小时，此步骤　

ＭＭＰ－９呈阴性（肌上皮瘤１／３，基底细胞腺瘤２／３）。按　

为证实反应产物确为ＭＭＰ一２、ＭＭＰ－９，可分别在明胶缓　

前述标准计分后进行统计学分析，发现涎腺恶性肿瘤　

冲液中加入其非特异性抑制剂ＥＤＴＡ　２０　ｍｍｏ］／Ｌ、特异　

ＭＭＰ－２的表达强于良性肿瘤（Ｕ＝３．０００，Ｐ＝０．０１８）；　

性抑制剂苯甲基磺酰胺２０　ｍｍｏｌ／Ｌ，以明确所得条带的　

ＭＭＰ－９在恶性肿瘤中的表达（均值１．５５６）也高于良性　

性质，同法孵育。孵育结束后考马斯亮蓝溶液染色１小　

肿瘤（均值０．６６７），但二者间差异无统计学意义（Ｕ＝　

时，脱色约３０～４０分钟，得到蓝色背景上的透亮带　。　

２３．０００，Ｐ＝０．０６９）见图１。黏液表皮样癌中ＭＭＰｓ因　

１．２．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ同明胶酶谱法制备组织蛋白抽提　

肿瘤细胞种类不同而表达不同：表皮样细胞和中间细胞　

液，提取上样于８％聚丙烯酰胺凝胶进行还原性ＳＤＳ－　

表达较高（均值２），黏液细胞表达很少（均值１）；腺样　

ＰＡＧＥ电泳，半干式转膜（ＰＶＤＦ膜），５０　ｍＡ恒流３小　

囊性癌中ＭＭＰｓ在不同的组织结构区域其表达也不相　

时。封闭液（０．Ｏ１％正丁醇，０．０２％Ｔｗｅｅｎ，５％脱脂奶　

同：条索实性区域上皮细胞（均值２）表达强于腺管－筛　

粉，０．０２％叠氮钠ｗ／ｖ）封闭ＰＶＤＦ膜过夜，ＰＢＳ．Ｔ缓冲　

孔样区域（均值１．５）。　

液（Ｎａ２ＨＰＯ４‘１２Ｈ２０　０．７２５％，ＮａＨ２Ｐ０４・２Ｈ２０　Ｑ　０７４％，　

表１　各型肿瘤免疫组化染色计分结果　（分）　

２．２　明胶酶谱从上到下观察得到的蓝色背景凝胶　良性、恶性肿瘤间差异不明显（Ｕ＝２２．５００，Ｐ＝０．５２）。　

块，可以看到五条带：分子量９２　ＫＤａ的ＭＭＰ－９酶原；分　活性ＭＭＰ．２在所有样本都有一定表达，恶性肿瘤的表　

子量８３　ＫＤａ的活性ＭＭＰ－９；７２　ＫＤａ的ＭＭＰ一２酶原；　

达水平高于良性肿瘤（Ｕ＝９．５００，Ｐ＝０．０１１）。ＭＭＰ－９　

６４　ＫＤａ的中间型ＭＭＰ一２，是去除了８　ＫＤａ的肽段，但未　酶原、活性ＭＭＰ．９在大部分良性肿瘤中表达很低或缺　

完全激活，只有低分化腺癌（ＩＯＤ值４２５７０．９１）、黏液表　

失，在恶性肿瘤中均有明确表达（Ｕ＝０．０００、Ｕ＝２．５００，　

皮样癌（ＩＯＤ值３２１２７．２３）和腺样囊性癌（ＩＯＤ值　

Ｐ＝０．０３１、Ｐ＝０．０２２）。部分低分化腺癌和腺样囊性癌　

４１９９８．５Ｏ）有所表达；６２　ＫＤａ的活性ＭＭＰ一２条带（见图　

中，在ＭＭＰ一２酶原和活性ＭＭＰ一２带问可见一条微弱的　

２）。ＭＭＰ一２酶原在全部样本中都有较强表达（表２），　

６４　ＫＤａ透明条带，颜色较浅，即为中间型ＭＭＰ－２。　

实用医院临床杂志２０１０年９月第７卷第５期　

ｔ聋　

、　

奄　

ｉ　

ｉ　

图１　ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９免疫组化结果ａ：基底细胞腺瘤ＭＭＰ一２（１０￣４０），部分肿瘤细胞胞浆着色．ｂ：基底细胞腺瘤ＭＭＰ一９（１０ｘ４０），个别肿瘤细胞胞　

ｔ　

浆着色；ｃ：多形性腺瘤ＭＭＰ－２（１０ｘ４０），部分肿瘤细胞着色；ｄ：多形性腺瘤ＭＭＰ－９（１０ｘ４０），肿瘤细胞几乎不着色；ｅ：低分化腺癌ＭＭＰ一２（１０ｘ４０），绝大　

誊　镡　罐　

部分肿瘤细胞着色，信号较强；ｆ：低分化腺癌ＭＭＰ一９（１０ｘ４０），大部分肿瘤细胞着色　

表２各型肿瘤中ＭＭＰ酶原与活性ＭＭＰ的ＩＯＤ平均计分值（分）　

２．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ受所购抗体适用范围的限制，本实　

验只对３４例涎腺肿瘤进行ＭＭＰ－２的Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检　

测。得到的ＰＶＤＦ膜在相应分子量区域（７２　ＫＤａ）见一　

条长方形棕黄色抗原条带，即为所检测的ＭＭＰ－２组织　

蛋白条带（图３）。由于转移过程中蛋白浓度减少，故膜　

上的显色条带较浅，肌上皮瘤、基底细胞腺瘤的有些条　

带肉眼几乎不能辨认，通过计算机成像分析才能检测　

到。良恶性肿瘤间ＭＭＰ一２的表达存在差异（Ｐ＝　

０．０２９）。　

ＭＭＰ一２—一　

～

７２ＫＤａ　

多　

ＭＭＰ一９酶原一　

活性ＭＭＰ一９一　

ＭＭＰ一２酶原一　

活性ＭＭＰ一２一　

形　

性　

腺　

瘤　

基　

底　

细　

胞　

腺　

瘤　

黏　

液　

表　

皮　

样　

癌　

腺　

泡　

细　

胞　

癌　

腺　

样　

囊　

性　

癌　

多　

形　

性　

腺　

瘤　

腺　基　

样　底　

囊　细　

性　胞　

癌　

腺　

瘤　

图３涎腺肿瘤的Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ结果　

多　

形　

性　

腺　

瘤　

基　

底　

细　

胞　

腺　

瘤　

肌　

上　

皮　

瘤　

腺　

泡　

细　

胞　

癌　

腺　

样　

囊　

性　

癌　

多　

形　

性　

腺　

瘤　

腺　

样　

囊　

性　

癌　

黏　

液　

表　

２．４　三种方法的结果比较　将免疫组化所测的ＭＭＰ一　

皮　

样　

癌　

２计分值与Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法测得的ＩＯＤ值标准化后进行　

比较，得到图４的分布趋势，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ与免疫组化检　

测的ＭＭＰ一２表达强度一致。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ是定量检测，　

图２涎腺肿瘤的明胶酶谱结果　

免疫组化是半定量检测，二者趋势一致说明免疫组化实　

２０　

实用医院临Ｊ末杂志２０１０年９月第７卷第５期　

娜　∞　∞　加　０　

验所得数据是真实可信的。免疫组化实验不能检测出　

涎腺良恶性肿瘤问ＭＭＰ一９的表达差异，明胶酶谱法不　

但能检出总ＭＭＰ一９的差异，还能检出ＭＭＰ一９酶原、活　

性ＭＭＰ一９的差异。从图５＿口ｆ以看　，ＭＭＰ一２、ＭＭＰ一９在　

涎腺良恶性肿瘤中表达不同主要是由于活性ＭＭＰ一２、　

识不一而有所差异，故免疫组织化学只能对所检测蛋白　

的表达强弱进行半定量比较。本实验辅以Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　

定量方法进行补充，使设计更加严谨，结果更加可信。　

明胶酶谱法是一种　分酶原和活性酶的特异性方　

法。ＭＭＰ一２、ＭＭＰ一９都是以酶原形式分泌，在细胞外环　

ＭＭＰ一９表达不同所造成。　

厂　＿１　

４１－Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ￣　

肿瘤类型　

图４　免疫组化与Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ所测ＭＭＰ一２在各型　

肿瘤间趋势一致　

嘎　

魍　

馥　

良性　恶性　良性　恶性　

图５涎腺良、恶性肿瘤中ＭＭＰ活性酶与酶原的构成比　

３讨论　

迄今为止，免疫组化方法仍是原位检测组织蛋白最　

直观、应用最广的方法，在检测基质金属蛋白酶蛋白的　

实验中，它不仅提供了各型肿瘤问、各种因子间半定量　

的比较数据，更重要的是做到了组织定位，从形态学上　

反映了ＭＭＰｓ的表达规律。如黏液表皮样癌中ＭＭＰｓ　

主要表达在表皮样细胞和中间细胞，黏液细胞着色少；　

腺样囊性癌中，条索状实性区域上皮细胞表达强于腺　

管一筛孑Ｌ样区域。根据组织学分级，黏液细胞分化相对　

成熟，而表皮样细胞和中间细胞分化较低，显示了较强　

的生长活性。该结果支持Ｒｏｓｓ　的结论：中间细胞是　

黏液表皮样癌中最具侵袭性的细胞。多数学者认　

为　’　腺样囊性癌中实性条索样区域较腺管和筛孑Ｌ样　

区域浸润性更强，本研究中也显示ＭＭＰｓ在这些区域中　

的表达更强。这些细胞定位特征提示了ＭＭＰｓ在涎腺　

恶性肿瘤浸润、侵袭过程中的重要作用。　

但由于实验中主观因素干扰较多，如阳性信号的强　

弱受室温、空气湿度、溶液离子浓度等非控制因素的影　

响，各批次着色程度差异较大，另外阳性判断也因主观认　

境中其Ｎ末端一肽段被切下来后即转变为活性形式。　

实验中运用非还原ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，利用ＭＭＰｓ与阴离　

子去垢剂ＳＤＳ结合，形成蛋白质一ＳＤＳ复合物，使待测蛋　

白质带上相同的负电荷，其量大大超过了蛋白质分子原　

有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质问原有的电荷　

差别，此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子　

质量。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳后，将分子量不同的ＭＭＰｓ及　

与ＭＭＰｓ结合的组织抑制剂同时分离，再用阳离子去垢　

剂（Ｔｒｔｉｏｎ—Ｘ１００）除去ＳＤＳ，这一过程中引发了ＭＭＰｓ　

酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约ｌ０　

×１０　ＫＤａ的小肽，转变为有活性的酶　，降解凝胶中　

相应部位的明胶。体内已被纤溶酶等物质激活的活性　

ＭＭＰｓ，在除掉ＳＤＳ后也可以恢复酶活性　，在酶谱上　

称之为活性型ＭＭＰｓ，可在比酶原分子量小１０　Ｘ　１０　

ＫＤａ处留下白色透明条带，从而与酶原相区别。活性酶　

在体内才具有水解胶原等基质的作用，冈而在功能上的　

意义要大于相应的酶原。本研究免疫组化结果显示恶　

性涎腺肿瘤中ＭＭＰ一２的表达强于良性肿瘤，明胶酶谱　

实验则进一步证实是活性ＭＭＰ一２表达不同导致这一差　

异，ＭＭＰ一２酶原的分泌量在二者问差异是不明显的，这　

也更加清晰的显示在恶性肿瘤中ＭＭＰ一２通过增加激活　

量促进了肿瘤细胞的侵袭、转移。ＭＭＰ一９在恶性涎腺　

肿瘤中的表达强于良性肿瘤，但免疫组化实验不能发现　

统计学上的差异。明胶酶谱法显示：不仅活性ＭＭＰ－９　

而且ＭＭＰ一９酶原的分泌在二者也有重要差异，证实　

ＭＭＰ一９同样参与了肿瘤组织降解细胞外基质、开辟浸　

润、转移通道的过程。此外，酶谱实验还显示了部分恶　

性涎腺肿瘤中中间型ＭＭＰ一２的表达，在ＭＭＰ一２酶原的　

激活过程中，中间型ＭＭＰ一２相当于一个储备库，维持活　

性型ＭＭＰ一２的高浓度，不因ＭＭＰ一２酶原的量暂时变化　

而影响最终活性酶的浓度，维持了细胞外基质的降解速　

率　“　。本实验在涎腺良性肿瘤中未发现中间型ＭＭＰ－２　

表达，而一些恶性肿瘤中能检测到其存在，说明随着涎　

腺恶性肿瘤持续生长，作为活性酶的储备库中问型　

ＭＭＰ一２将不断转化为活性ＭＭＰ一２，使活性酶持续增高　

或维持在一个相对较高的水平，令细胞外基质持续降　

解。综上所述，免疫组化、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ、明胶酶谱三种方法　

结合既发挥了免疫组化细胞定位的优势，打破其不能辨别　

酶原与活性酶的局限性，又克服了免疫组化法半定量的　

局限性，能更加客观准确反映各型肿瘤组织中ＭＭＰ一２、　

实用医院临床杂志２０１０年９月第７卷第５期　

２１　

基质金属蛋白酶Ｉ２和层粘连蛋白受体表达与胃癌　

生物学行为的关系　

　

王克兵　，徐　

澍２

（１．贵州省遵义县人民医院病理稃，贵州遵义５６３１００；２．　贵阳医学院附属医院病理科，贵Ｊ＇ｉ１贵阳５５０００４）　

【摘要】　目的　探讨基质金属蛋白酶一２（ＭＭＰ一２）和层粘连蛋白受体（１ａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｌａｍｉｎｉｎ．Ｒ）在胃癌中的表达与　

胃癌生物学行为的关系。方法　采用免疫组化ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ法检测８２例胃腺癌组织中ＭＭＰ．２和ｌａｍｉｎｉｎ．Ｒ的表达情况，　

分析其与胃癌生物学行为的关系。结果　ＭＭＰ－２和ｌａｍｉｎｉｎ—Ｒ在胃癌中的阳性表达率分别为６２．２％和５２．４４％；ＭＭＰ．２　

和ｌａｍｉｎｉｎ—Ｒ与患者年龄、性别、肿瘤发病部位、肿瘤大小和分级均不相关（Ｐ＞０．０５）；ＭＭＰ－２蛋白表达与浸润深度、　

ＴＮＭ分期相关（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１）；ｌａｍｉｎｉｎ—Ｒ表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、ＴＮＭ分期相关（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜　

０．０５，Ｐ＜０．０１）；ＭＭＰ一２和ｌａｍｉｎｉｎ—Ｒ在胃癌中表达呈正相关关系（ｒ：０．７２）。结论　胃癌组织中ＭＭＰ一２与ｌａｍｉｎｉｎ—Ｒ　

表达参与胃癌的侵袭和淋巴结转移。　

【关键词】　胃癌；基质金属蛋白酶－２；层粘连蛋白受体；生物学行为　

【中图分类号】Ｒ７３５．２　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２－６１７０（２０１０）０５－００２１－０３　

Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２　ａｎｄ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｏｆ　

ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ＷＡＮＧ　Ｋｅ—ｂｉｎｇ　，ＸＵ　Ｓｈｕ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｚｕｎｙｉ　Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｚｕｎｙｉ　５６３１００，　

Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＡｆｉｌｆｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕｉｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ。Ｇｕｉｙａｎｇ　５５０００４，Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－２。ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉ—　

ｃａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｏｆ　ｇａｓｔｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＭＭＰ－ｒ２　ａｎｄ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　８２　ｏａｓｅｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｗｅｒｅ　ｒ

ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＭＭＰ一２　ａｎｄ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｗａｓ　６２．２％ａｎｄ　

５２．４４％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐａｔｉｅｎｔｓ’ａｇｅ，ｇｅｎｄｅｒ，ｔｕｍｏｒ　ｌｏｃａｔｉｏｎ－ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｇｒａｄｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ一２　ａｎｄ　ｌａｍｉ—　

ｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－２　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｐｔｈ　ｏｆ　ｉｎｖａｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄ　ＴＮＭ　ｓｔａｇｉｎｇ　

（Ｐ＜０．Ｏ１）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｐｔｈ　ｏｆ　ｉｎｖａｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０１），ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓ—　

ｔａｓｉｓ（Ｐ＜０．０５）ａｎｄ　ＴＮＭ　ｓｔａｇｉｎｇ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ一２　ａｎｄ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｗａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　

ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ（ｒ＝０．７２）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－２　ａｎｄ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｖａ—　

ｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ．　

【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｓｔｏｍａｃｈ；Ｍａｔｉｒｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ・２；Ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　

基质金属蛋白酶．２（ＭＭＰ一２）的主要功能是参与细　

【基金项目】贵州省科学技术基金资助项目［黔科合Ｊ字（２００８）　

２２７８］　

胞外基质（ＥＣＭ）降解，有研究报道其在胃癌中表达与　

胃癌的局部浸润和远处转移发生密切相关…。层粘连　

蛋白受体（Ｌａｍｉｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｌａｍｉｎｉｎ—Ｒ）作为一种细胞粘　

附分子，参与基底膜成分一层粘连蛋白结合。已有研究　

ｎａｓｅｓ　ＭＭＰ－２，ＭＭＰ－９　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ＴＩＭＰ一１，－２，ａｎｄ－３　ｉｎ　

９的实际表达，是一种可行的三联检测手段。　

【参考文献】　

『１　１　Ｒｏｂｅａ　Ｖｉｓｓｅ．Ｈｉｄｅａｋｉ　Ｎａｇａｓｅ．Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔｌｏｐｒａｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉ．　

ｂｅｎｉｇｎ　ａｎｄ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｔｕｍｏｕｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｖａｒｙ　ｇｌａｎｄ［Ｊ］．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　

２Ｏｏ４，４４（３）：２２２－２３１　

｛６］ＲＯＳＳ　Ｂ．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｅｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　

ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｔｕｒｅｅ　ｔｈｅｒａｐｙｅｓ，Ａｒｃｈ　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ［Ｊ］．Ｈｅａｄ　Ｎｅｃｋ　Ｓｕｒｇ，　

１９９２，１１８：ｌ１７２－１１７８．　

ｔｏｙｓ　ｏｆｍｅｔａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕ—　

ｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，９２（５）：８２７．８３９．　

［２］Ｌｅ６ｎｉｅｗｓｋａ　Ｍ，Ｍｉｈｙｋ　Ｗ，Ｓｗｉａｔｅｃｋａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｐａｒ—　

ｔｉｃｉｐａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｍ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｉｘ　ｉｒｎ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　

『７］Ｒａｉｔｚ．Ｍａｒｔｉｎｓ，Ａｒａｕｊｏ．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｌｌｅ　ｅｘｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｉｒｘ　ｉｎ　ｓａｌｉｖａｒｙ　

ａｌｐｈａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｆｏｌｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｂｉｏｌ，２００９，４７　

（５）：Ｓ１０７—１１２．　

『３］Ｋａｔａｙａｍａ　Ａ，Ｂａｎｄｏｈ　Ｎ，Ｋｉｓｈｉｂｅ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍａｔｉｒｘ　ｍｅｔａｌｌｏ．　

ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ－・ｓｔａｇｅ　ｏｒａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｉ－・　

ｇｌａｎｄ　ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｏｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｍｅｄ，２００３，３２（５）：２９０－２９６．　

［８］谢刚，杨永红，王安群，等．气管腺样囊性癌临床病理分析［Ｊ］．实用　

医院临床杂志，２００８，５（３）：６６－６８．　

［９］Ｌａｅｍｎｌｉ　ＵＫ．Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｓｔｍｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　

ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７：６８０．　

『１Ｏ　１　Ｐｅｉ　Ｄ．Ｌｅｕｋｏｌｙｓｉｎ／ＭＭＰ２５／ＭＴ６．ＭＭＰ：ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍａｔｉｒｘ　ｍｅｔｌａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　

ｃａｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｔｕｍｏｒ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４，１０　

（２）：６３４－６４０．　

［４］刘煜，张嘉宁，朱正美．基质金属蛋白酶酶谱分析法［Ｊ］．生殖医学　

杂志，１９９８（７）：１１１—１１３．　

［５］Ｎａｇｅｌ　Ｈ，Ｌａｓｋａｗｉ　Ｒ，Ｗａｈｌｅｒｓ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｔｉｒｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉ－　

ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｌｉｎｅａｇｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ，１９９９，９：　

２９１．３０３．　

ｆ　１　１］Ｈｏｍｅｂｅｃｋ　Ｗ，Ｅｍｏｎａｒｄ　Ｈ，Ｍｏｎｂｏｉｓｓｅ　ＪＣ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｔｒｉｘ．ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｒｅｇｕｌａ－　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｉｅｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　　ｌＪ　１．Ｓｅｍｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　

Ｂｉｏｌ，２００２，１２（３）：２３１－２４１．　

（收稿日期：２０１０－０６－０３；修回日期：２０１０－０７－２０）