2024年5月14日发(作者：二手手机价格查询)

应用流式细胞术测定CD24表达鉴定人髓核细胞

张丽;马迅;关晓明;何李明;赵胜;宋文慧

【摘 要】背景:CD24 是成熟髓核细胞表面表达的特异性分子,测定CD24 的表达是

否可以作为鉴定髓核细胞的一种方法?目的:验证流式细胞仪测定髓核细胞CD24 表

达鉴定髓核细胞的方法.方法:采用酶消化法分离培养人髓核细胞,取生长旺盛的第2

代人髓核细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,RT-PCR测定Ⅱ型胶原及SOX9

的表达,流式细胞仪检测其CD24 阳性表达率,分析来自同一批细胞的免疫组织化学

染色、RT-PCR结果与CD24 阳性率的相关性.结果与结论:体外分离培养的7 例第

2 代髓核细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,RT-PCR结果阳性,流式细胞

仪测定CD24 其阳性率均为50%以上,髓核细胞分泌胞外基质Ⅱ型胶原与SOX9 的

表达与CD24 阳性率结果有相关性.提示采用流式细胞仪测定CD24 表达可以快速、

简便地鉴定髓核细胞.%BACKGROUND: CD24 e known as its specific

expression on the surface of nucleus pulposus (NP) celb. Whether

detecting CD24expression can be used as a method to identify NP cells

remains poorly WE: To verify whether flow cytometry

(FCM) detection of CD 24 expression in NP cells is a fast and convenient

method to identify NP S: Human NP cells were isolated and

cultured from seven patients who underwent various spinalsurgeries via

enzyme digestion. Type 0 collagen immunohistochemistry staining was

proceeded to the well grown passage 2 NP cells. RT-PCR experiments had

been done to measure the mRNA expression of type D collagen and SOX9

from the same cell source. Also the positive rates of CD24 were detected

by FCM. The correlation among these results from the same sample was

analyzed. RESULTS AND CONCLUSION: Type D collagen

immunohistochemistry staining results of in vitro cultured passage2NP

cells was posith/e. RT-PCR and FCM also acquired positive results. The

positive rate of CD24was above 90%. Extracellular matrix type D collagen

expression of NP cells correlated to positive CD24 results.

Detecting CD24 expression using FCM can identify NP cells fast and

conveniently.

【期刊名称】《中国组织工程研究》

【年(卷),期】2011(015)046

【总页数】4页(P8583-8586)

【关键词】髓核细胞;流式细胞术;CD24;Ⅱ型胶原;SOX9

【作 者】张丽;马迅;关晓明;何李明;赵胜;宋文慧

【作者单位】山西医科大学第二医院骨科,山西省太原市030001;山西医科大学第

二医院骨科,山西省太原市030001;山西医科大学第二医院骨科,山西省太原市

030001;山西医科大学第二医院骨科,山西省太原市030001;山西医科大学第二医

院骨科,山西省太原市030001;山西医科大学第二医院骨科,山西省太原市030001

【正文语种】中 文

【中图分类】R318

0 引言

在椎间盘退变的修复方法中，传统的保守治疗和手术治疗方法都存在很多弊端，以

生物学治疗为发展方向的新兴治疗方法包括基因治疗方法、细胞治疗方法和组织工

程学方法等。

在组织工程学研究中，种子细胞的培养至关重要。髓核细胞作为髓核组织工程学的

种子细胞，在体外培养过程中，常常需要对所培养的细胞进行鉴定，到目前为止，

还没有一个公认的鉴定髓核细胞的方法。

一般的鉴定方法包括：观察细胞形态，PCR方法或者免疫组织化学方法验证该细

胞是否表达Ⅱ型胶原、SOX9等细胞外基质[1]。研究报道，成熟髓核细胞表达

CD24[2-3]。

作者采用流式细胞术测定体外培养髓核细胞的CD24表达来验证该方法是否可以

成为快速、简便地鉴定髓核细胞的方法之一。

1 材料和方法

设计：以细胞为研究对象，体外观察实验。

时间及地点：实验于2009-05/2010-08在山西医科大学第二医院中心实验室完成。

材料：标本取自山西医科大学第二医院骨科的7例行各种椎间盘手术的患者，年

龄10～42岁，中位年龄26岁。根据《医疗机构管理条例》，患者及家属均知情

同意。

主要试剂与仪器：

试剂及仪器 来源Ⅱ型胶原酶、胰酶倒置相差显微镜Trizol、M-MLV Random

Primer、Taq DNA Polymerase PCR仪IgG1-PE、CD24-PE、流式细胞仪

(FC500)Gibico 美国Olympus 日本TaKaRa 日本Promega 美国PE 9700 美国

Beckman Coulter 美国

方法：

人髓核细胞的分离培养—酶消化法：无菌条件下取出新鲜髓核组织，浸于D-

Hank’s液中，洗净后，将髓核剪碎至组织块小于1 mm×1 mm×1 mm，用2

g/LⅡ型胶原酶37 ℃水浴箱中消化1.0～2.0 h，PBS洗涤2次，再加入2.5 g/L

的胰蛋白酶溶液37 ℃水浴箱中消化10 min，PBS洗涤2次，200目滤网过滤去

除组织残留碎块。用添加体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养完全培养液

终止消化，冲洗2次，加入含双抗的培养液均匀吹打，将细胞接种于底面积为25

cm2的培养瓶中，在37 ℃，体积分数5%的CO2培养箱中开始原代培养，5 d

后首次换液，以后每3 d半量换液1次，原代培养细胞达到90%融合时胰酶消化

传代，细胞传至第2或者第3代且培养细胞达到90%融合时，用于下一步实验。

细胞爬片：将盖玻片提前泡酸，洗净后晾干，再用无水乙醇浸泡4 h以上，双蒸水

冲洗干净后烘干，高压消毒后备用。将生长状态良好的第2代髓核细胞按照

3×108 L-1的细胞浓度直接接种于放有盖玻片的六孔板中，贴壁生长5 d后(此时

为第3代髓核细胞)，用40 g/L多聚甲醛PBS溶液固定20 min后，PBS溶液清

洗两遍，于-20 ℃冷冻保存。

免疫组织化学法测定Ⅱ型胶原：体积分数0.3% H2O2室温孵育10 min，蒸馏水

洗涤3次，3 min/次。加入兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体；4 ℃冰箱过夜或37 ℃ 2

h，PBS洗涤3次，3 min/次，加入二抗(生物素化山羊抗兔IgG，1∶400)，37 ℃

40 min，PBS洗涤3次，3 min/次。滴加试剂SABC，20～37 ℃ 20 min。PBS

洗5 min×4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1 mL蒸馏水，加试剂盒

中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般

在5～30 min之间。蒸馏水洗涤。苏木精轻度复染。脱水、透明、常规封固。结

果判断：呈现棕黄色为阳性，无着色为阴性。

RT-PCR检测Ⅱ型胶原和SOX9 mRNA：采用Trizol一步法提取髓核细胞总RNA，

利用M-MLV将1 g总RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR分别

扩增Ⅱ型胶原和SOX9基因，其PCR产物大小分别为609 bp和304 bp。Sox9

的扩增条件：94 ℃ 预变性4 min，94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃充分

延伸30 s，共35个循环。Ⅱ型胶原退火温度60 ℃，其余扩增条件均同Sox9。

流式细胞术测定CD24表达：将生长状态良好的第3代髓核细胞用胰酶消化后，

调整细胞浓度为1×109 L-1，共设两管，每管取1 mL细胞，PBS清洗后，将鼠

抗人单克隆抗体CD24-PE加入其中一管(总共100 μL)细胞悬液中，另一管加入同

型对照混匀后室温避光孵育30 min，再用2 mL PBS清洗后弃上清，加入500 μL

PBS(含10 g/L多聚甲醛)流式细胞仪上机检测，根据同型对照的荧光强度设定阴

性细胞群，观察髓核细胞CD24阳性细胞表达率。

主要观察指标：①人髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果。②人髓核细胞Ⅱ型

胶原和SOX9 RT-PCR检测结果。③流式细胞术测定髓核细胞CD24表达。

统计学分析：采用SPSS 12.0软件分析，流式细胞术测定CD24表达阳性百分率

采用x ±s表示。同一标本来源的不同检测方法之间的相关性分析采用方差分析。

2 结果

2.1 人髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果 体外分离培养的人髓核细胞通过

传代、爬片、固定后，经Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，结果呈阳性，细胞胞浆染色

为棕色，见图1。

2.2 人髓核细胞Ⅱ型胶原和SOX9 RT-PCR结果 髓核细胞经总RNA提取、反转录

及PCR扩增，其细胞外基质Ⅱ型胶原和SOX9的mRNA水平验证均为阳性，见

图2，PCR产物大小分别为609 bp和304 bp。

2.3 流式细胞术测定髓核细胞CD24表达 对体外培养的7例人髓核细胞均采用流

式细胞术检测其CD24表达，阳性百分率测定值均大于50%，由小到大分别为

52.6%，57.8%，58.4%，64.3%，68.2%，70.8%，72.4%，平均为

(63.5±7.44)%。其中1例结果见图3。

Figure 1 TypeⅡcollagen immunohistochemistry staining of nucleus

pulposus cells (positive) (×200)图1 髓核细胞结果(阳性) (×200)

Figure 2 RT-PCR results of extracellular matrix typeⅡcollagen and SOX9

expression of nucleus pulposus cells图2 髓核细胞外基质Ⅱ型胶原和SOX9

RT-PCR结果

Figure 3 Expression of CD24 in nucleus pulposus cells detected by flow

cytometry图3 流式细胞术测定髓核细胞CD24表达

3 讨论

椎间盘退变可以引起多种疾病[4]，这些疾病对人们的困扰日益加重，其中髓核细

胞的退变最为明显[5]。髓核细胞改变在椎间盘退变中起到非常重要的作用[6]，髓

核为无血管组织，且细胞数量有限，发生病变后难以自身修复，如何利用种子细胞

修复退变髓核细胞已成为攻坚热点[7]。一般的手术或保守治疗虽然能够取得一定

的疗效，但是不能阻止椎间盘的退变[8-9]。近年来随着体外椎间盘髓核及纤维环

组织细胞培养技术的建立[10-12]，随着对不同物种椎间盘细胞研究以及软骨组织

工程研究的不断深入[13]，为退变椎间盘的形态结构与生理功能的再生修复带来了

希望，以髓核细胞为来源的组织工程学研究已成为生物学治疗椎间盘退变的一个方

向[14-17]。

目前对于髓核细胞的生物学特性缺乏足够的认识，如何鉴定髓核细胞是不断探索的

方向。由于髓核细胞与关节软骨的细胞外基质的表型很相似，都表达几种软骨形成

标志：SOX-9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，所以这些标志常作为鉴别髓核细胞的标志

[18]。在干细胞或脊索细胞向椎间盘性细胞的分化研究中，缺乏区分髓核细胞的特

异性标志成为一个重要障碍[19-20]。有些细胞marker被认为是非常有用的标志，

例如CD24、缺氧诱导因子1、基质金属蛋白酶2、葡萄糖转移因子1、磷脂酰肌

醇蛋白聚糖3和角蛋白19[2, 21-22]。

迄今为止，髓核细胞的鉴定从形态到表型一直以来没有固定的标准。就形态而言

[23]，一些研究者认为髓核细胞有多种形状：多边形、球形和梭形。Rui等[24]观

察到从人关节滑膜而来的未传代的干细胞中有多边形或者星形的细胞：在培养第1

代，能够观察到圆形和梭形的细胞，到了第3代，观察到都是均一的纤维样的细

胞群。本实验从髓核组织中分离培养的细胞，也观察到了两种形态的细胞：梭形和

多边形。关节滑膜细胞是软骨细胞，髓核细胞是类软骨细胞，由此作者推测类软骨

细胞也许与软骨细胞在形态学方面是一致的，可能都是多边形的或者星形的。有研

究报道髓核细胞具有某些干细胞特性[25]，那么是否不同形态的髓核细胞是由不成

熟和成熟的细胞组成的呢？有待于进一步研究。

CD24是糖基磷脂酰肌醇锚蛋白，一种表达于髓核组织细胞表面的分子标记。是

Fujita 等[2]的研究中筛选出的适用于鉴定髓核细胞的marker。结果中所检测髓核

细胞CD24阳性率一般在50%～70%，达不到100%，可能是由于体外培养的髓

核细胞形态一般不均一，那么有可能较成熟的髓核细胞CD24为阳性，而不成熟

的髓核细胞为阴性。如果将CD24阳性和阴性细胞进行分选后分别探讨其特性，

能够更加深入对髓核细胞特性的认识。

本实验用CD24荧光抗体标记细胞，可以不浪费很多细胞[总数(1～5)×105个]并

且快速地对培养细胞进行测定，在实际应用中是一种简单、快速、特异的鉴定髓核

细胞的方法。此外，一方面选择通过免疫组织化学和RT-PCR的方法测定髓核细

胞外基质的表达，另一方面采用流式细胞术检测CD24的表达，并与细胞形态学

结合来鉴定髓核细胞，目前为止未见此类报道。理论上为干细胞向髓核方向诱导分

化的细胞鉴定补充了新的方法。

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