2024年4月15日发(作者：热门手机排行榜前十名2022)

202

年

月

5

日

第

30

卷第

期

Vol.

30,

No.

0 Januay

5,

2021

7(

到荡业

China

Pharmaceuticals

•

检验检测

•

Inspection

and

Test

dh

：

D.

3969//

Po

106

-4930

2020

01.

018

高效液相色谱法测定烯丙孕素的有关物质

包汝泼

，

翁士乔△

，

李开刚

(宁波三生生物科技有限公司

，

浙江宁波

315400

)

摘要

：

目的

建立测定烯丙孕素有关物质的高效液相色谱

(HPLC

)

法

。

方法

色谱柱为

GRACE

Al/ima

Ci

8

柱

(

250

mmx46

mm,

5

Rm

),

流动相为乙腈-水

(

20

：

40

,

V/V

)

流

速为

1.

0mL/mP,柱温为

25C

,

检测波长为316/m,

进样量为

20

r

L

。

结果

各杂质峰与主峰分离度良好

。

烯丙

孕素

、

杂质

A

、

杂质

B

、

杂质

C

质量浓度分别在

0.

549

0

〜

8.

12

0

Rg/mL,

0.

001

0

〜

8.

025

9

Rg/mL,

2

.

503

4

〜

8.

055

1

Rg/mL,

0.

500

0

〜

8.600

0

R

g/mL

范围内与峰面积线性关系良好

(r

^

0.

099

9

)

o

结论

该方法灵敏

、

准确

，

专属性强

，可用于烯丙孕素有关物质的检测

。

关键词

：

烯丙孕素

；

有关物质

；

高效液相色谱法

；

质量控制

中图分类号:

R927.11;R977.

1

文献标志码

：

A

文章编号

：

1006

-4931(2021)01

-0069-04

Determination

of

RelateV

Substances

of

Altrevogest

by

HPLC

BAO

Rupr

o

WENG

Shlqiar

,

Lt

Kaigang

(

NmqUo

SansPeng

BPOpff

TmSsdgy

Co.

,

Ltd.

,

NmqUo

,

Zhejinq

,

Chios

3

15500'

)

Abstract

：

Objective

To

estabUsh

a

high

pePormaneo

Upuib

chymamgmphy(

HPLC

)

method

for

the

determination

of

related

substances

of

a/renogest.

Methods

The

cnromatogra/Pic

column

was

GRACE

AAtima

C

1

column

(

250

mm

x

4.

6

mm,

5

Rm

),

the

moPito

phase

was

acetonitrile

-

water

(

6

0

：

40

,

V/V

)

,the

Pow

rate

was

1.

0

mL/min,

the

column

mmperaturo

was

25

C

,

the

demchon

wevelenyth

was

310

nm

,

and

the

injechon

volume

was

20

r

L.

Reselts

A/renoges)

conlg

be

well

separated

from

other

impuriUes.

A/renogest

,1//010

A

,

impuri/

B

and

impu/ty

C

showed

good

Uneari/

in

the

ranyos

of

0.

509

0-8.

12

0

Rg/mL,0.

501

6

-

8.

025

9

Rg/mL,

04

03

4

-

8.

055

1

Rg/mL

,

0440

0-8.

000

0

Rg/mL

(厂

M

0.

999

9

).

Conclusion

The

method

U

sensi/vv

,

acc/ram

and

mination

of

related

su/stances

of

a/renogest.

Key

words

:

aTreogest

;

related

su/stances

;

HPLC

;

quality

control

specUic

,

which

can

be

used

for

the

deter

­

烯丙孕素为三烯

21

碳甾体类孕激素

，

属

1

-

睾丸

烯丙孕素可显著改善乏情后备母猪繁殖性能

,

提高其发

酮系列11

,

是一种口服给药

，

且有孕激素活性的化合物

,

和所有甾体类化合物一样

,

具有脂溶性,

能进入靶细胞

,

情率和产仔数

,

且对后代仔猪的生产性能无影响

[3

-

8]

°

烯丙孕素的研究与应用已有近

40

年的历史

，

目前国内

外研究该产品的厂家较多,但未见其有关物质测定方法

结合胞内特异性受体

12

，

以类似于天然孕酮的作用来抑

制促性腺激素的释放

。

烯丙孕素是后备母猪同期发情的

的公开报道

。

本研究中建立了一种简单易行

、

专属性强

、

灵

敏度高的烯丙孕素有关物质检测的高效液相色谱

（

HPLC

）

理想药品⑶

，

可用于大规模批次化的人工授精

14

。

另外

，

*

基金项目

：

国家重点研发计划重点专项

201

年度项目

[201YFD050105

；

。

第一作者

：

包汝泼

，

男

，

硕士研究生

，

高级工程师

，

研究方向为药物研发

，

（

电子信箱

）

5

aoru/o@

bio

-

—

s.

net

。

△

通信作者

：

翁士乔

，

男

,

大学本科

，

高级工程师

，

研究方向为药物研发

，

（

电子信箱

）

wenfshiuiao@

bio

-

-s.

ue）

o

32

色谱柱和淋洗液选择

犤犦

采用

Dionea

IonPac™

CS1A

柱

，

色谱柱达到方法系

强

，

线性范围宽

，

可用于西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量

测定

。

统适用性要求

。

淋洗液使用

1

mmol/mL

甲磺酸溶液,

参考文献

[1.

国家药典委员会

•

中华人民共和国药典

（

一部

）

^..北京

：

考察了柱温

、

淋洗液流速

、

淋洗液浓度

，最终选择流速为

0

0mL/min

,

柱温为

32

C

°

中国医药科技出版社,201:70.

[2.

国家药典委员会

•

中华人民共和国药典

（

四部

）

^..北京

：

3.4

阴性样品干扰

生产厂家提供的不加西瓜霜的阴性样品按供试品

溶液制备方法制备溶液,按拟订色谱条件进样

1

r

L

,

中国医药科技出版社

,201

：

6

1.

[8.

封淑华

.

离子色谱法在药品检测中的最新进展

2.

中国药业

，

2010,1

（

（

1

）

:1

-3.

⑷甘

盛

，施晓光

，

韩

婷

，

等

.

离子色谱法测定药用芒硝中硫

结果含硫酸钠为

0-

1

mg,

可能为样品中其他原料

、

辅

料及溶剂带入

，

较样品中含有的硫酸钠的含量

（

为

1.

79

mg

）

低

。

因此

，

可忽略阴性样品的影响

，

认为阴性

对照品溶液无干扰

。

酸钠含量

2.

中国药业

,221,01

（

1

）

:39

-47.

[5]

滕南雁

，

梁飞燕

.

离子色谱法测定中药西瓜霜硫酸盐的含量

[J.

3.

5

方法评价

所建立的离子色谱法

，

方法简便

，

准确度高,专属性

药物分析杂志

,2011,31

（

8

）

:

149

—

151.

（

收稿日期

:

2020

-01

-02;

修回日期

:

2020

-02-2

）

）

69

•检验检测

•

Inspectios

and

Tesi

202

1

年

1

月

5

日第

3

卷第

1

期

Chiaa

Pharma

a

cuticals

的溶液，

即得

。

Vol.

30,

No.

1,

January

5,

2001

法

，

有助于烯丙孕素的质量控制研究l

2-00。

现报道如下

。

1

仪器与试药

对照品溶液:精密量取供试品溶液

1

mL,

置

OO

mL

容量瓶中,加流动相稀释至刻度

，

摇匀

,

即得

。

1

・

1

仪器

060

型高效液相色谱仪

［

美国安捷伦科技公司

，

包

含二极管阵列检测器

（

DAD

）

、

；

XS205

型分析天平

（

瑞士

梅特勒

-

托利多仪器有限公司

，

精度为十万分之一

、

。

杂质对照品贮备液:分别取杂质

A

、

杂质

B

、

杂质

C

对照品约

Omq

精密称定

，

置

OOmL

容量瓶中

，

加流动相

溶解并稀释成质量浓度为

0.

1

m//mL

的溶液

，即得

。

1.

2

试药

烯丙孕素原料药

（

批号分别为

000,0023

）

,

烯丙

对照品贮备液

：

取烯丙孕素对照品约

Om/

,

精密

称定

，

置

OO

mL

容量瓶中,加流动相溶解并稀释成质量

浓度为

0.

1

m//mL

的溶液，即得

。

系统适用性溶液:取烯丙孕素原料

O

my

精密称

孕素对照品

（

批号为

151003,

纯度为

99.

4%

）

,

杂质

A

（

批

号为

190701

,

纯度为

99.4%

）

,

杂质

B

（

批号为

190701

,

纯

度为

99.

7%

）

，

杂质

C

（

批号为

190701

,

纯度为

99.

3%

）

，

结

构见图

0

均由宁波三生生物科技有限公司合成室制备

。

乙

定

，

置

20

mL

容量瓶中

,

分别精密加入杂质

A

,

B

,

C

对照

品贮备液

1

mL

于容量瓶中

，

加流动相溶解并稀释至刻

腈为色谱纯,其他试剂均为分析级冰为超纯水

。

0H

度

，

摇匀

，即得

。

2.3

方法学考察

系统适用性及专属性试验

：

取

2.

2

项下供试品溶

液

、

系统适用性溶液及空白溶剂

（

流动相

、

，

按拟订色

谱条件进样

。

结果空白溶剂不干扰检测

，烯丙孕素理

论板数大于

5

000,

烯丙孕素与各杂质分离度良好

。

色谱图见图

2

。

破坏性试验

21-o］

：

1

）

未破坏

，

取样品约

Om/

,

置

20

mL

容量瓶中

，

用流动相定容

，

摇匀

，

备用;

2

）

酸破坏

，

取样品约

O

mp

,

置

20

mL

容量瓶中

，

加

1

mot/L

盐酸溶

液

2

mL,

室温下放置

2/

加碱液调节溶液至中性

，

用流

Fig.

1

ChemicoU

strbcturyi

formula

o0

altrenogest

and

its

impurities

动相定容

，

摇匀

，

备用;

3

）碱破坏

，

取样品约

Om/

,

置

24mL

容量瓶中

，

加

1

mot/L

氢氧化钠溶液

2

mL,

室温下放置

2

方法与结果

2.

1

色谱条件

色谱柱:

GRACEAlWimaC

o

柱

（

250mmx4.

6mm,

5

Rm

）

;

2/

加酸液调节溶液至中性

，

用流动相定容

，

摇匀

，

备

用

；

4

）

氧破坏

，

取样品约

9

mp,

置

20

mL

容量瓶中

，

加

流动相:乙腈

-

水

（

60

：

40,

V/

V

）

;

流速

：

0

0

mL/min

;

柱

34%

双氧水

5

mL

,

室温下放置

2

h

,

冷却,调节溶液至中

性

，

用流动相定容

，

摇匀

，

备用

；

3

高温破坏

，

取样品约

温

：

25

C

;

检测波长

：

3O

nm

；

进样量

：

20

r

L

。

2.2

溶液制备

供试品溶液:取烯丙孕素原料适量

，

置

50

mL

容量

O

mp,

置

20

mL

容量瓶中

，

加水适量

，

溶解

，

置

9

0

C

水

浴中放置

O

h

,

冷却,用流动相定容

，

摇匀

，

备用;

6

）

强光

瓶中

，

加流动相溶解并稀释成质量浓度为

01

m//mL

破坏

，

取样品约

O

mp,

置

20

mL

容量瓶中

，

加水适量

，

mAU

9.345

i/

min

A

C

0

杂质

A

2.

杂质

B

3.

杂质

C

4.

烯丙孕素

A.

空白溶剂

B.

系统适用性溶液

C.

供试品溶液

图

2

系统适用性及专属性试验高效液相色谱图

0

impurity

A

0.

impurity

B

3.

impurity

C

5.

altunogef)

A.

Bland

solution

B.

System

sshadi/ty

solution

C.

Ten)

solution

Fig.

2

HPLC

chromatograms

o0

system

spitabilita

test

and

specifcita

test

70

202

1

年

1

月

5

日

第

3

卷第

1

期

Vol.

00,

No.

0

January

5,

2021

China

Pharmaceuticals

mAUmAU

•

检验检测

•

Inspection

and

Test

mAU

80

60

9.

986

40

20

10.

730

0

0

5

S

min

10

1

t/

min

20

A

mAU

1.

003

80

60

1.

577

40

-

5.

063

5.

491

20

-9.01

5696

：

^14

6

P56

3

1216

0

[0.

世

t/

min

t/

min

0

5

10

1

20

D

A.

未破坏

B.

氧破坏

C.

高温破坏

D

.

酸破坏

E

.

碱破坏

F.

强光破坏

图

3

破坏性试验高效液相色谱图

A.

No

damaye

B.

Oxyyen

damaye

C.

High

temperature

damaye

D.

Acid

damaye

E.

AlUali damaye

F.

Photodamaye

Fig.

3

HPLC

chromatograms

of

destroctive

tests

溶解

，

于光照强度

4

500

m

条件下放置

1

d,

用流动相

定容

，

摇匀

。

按拟订色谱条件进样测定。

结果表明,经热

、

氧

、

高温破坏后降解不明显

，

经酸

、

光破坏后有降解杂质

用

Agilen

）

160

-

1

型

HPLC

仪所得结果的

RSD

为

0

,

实验员

2

采用

Agi/n

）

160-2

型

HPLC

仪所得结果的

RSD

为

0.

80%

，

表明方法精密度良好

。

稳定性试验:取烯丙孕素原料药

（

批号为

1128

）

适量,

依法制备供试品溶液

，

置室温

。

精密量取

20

r

L,

分别在

0,&

产生

，

但与主峰分离度良好

。

详见图

3

°

线性关系考察:分别取烯丙孕素

、

杂质

A

、

杂质

B

p

杂质

C

、

烯丙孕素对照品适量

，

精密称定,加流动相制成

24,30h

时按拟订色谱条件进样测定

。

结果的

RSD

为

0.

20%

质量浓度为

1

R

g/mL

的混合贮备液

，

精密量取混合贮

备液

04,0

0,2.

0,4.

0,6.

0,8.

0

mL

,

置

1

mL

容量瓶

（2

=

3

）

，

表明烯丙孕素供试品溶液在

30h

内稳定性良好

。

加样回收试验:分别精密量取杂质

A

、

杂质

B

、

杂质

中

,

用流动相稀释至刻度

,

摇匀

,

按拟订色谱条件分别进

C

对照品贮备液各

4,5,6mL

,

置

10

mL

容量瓶中

，

加

入供试品溶液中

，

制成含标准物质浓度

80%

,

10%

和

样

20

r

L

测定

，

记录峰面积

。

以峰面积

（

Y

）

为纵坐标

、

质

量浓度

（

X,

R

g/mL

,

为横坐标进行线性回归

，

得回归方

10%

的溶液各

3

份决

9

份

）

，

分别进样

20

r

L,

按拟订色

谱条件进样测定

,

带入线性方程计算回收率,

计算时扣除

程

，

并计算各杂质的校正因子

。

结果见表

1

表

1

烯丙孕素及杂质的线性关系考察结果和检测限

Tab.

1

Linear

reUtionship

and

detection

limit

of

altrevogest

and

its

impurities

化合物

供试品已有的杂质含量

（

3.

39

R

g/mL

）

。

结果见表

2

°

2.

4

样品有关物质测定

精密量取

2.

2

项下供试品溶液及对照品溶液各

线性回归方程

s

范围

（

R

O/mL

）

校正因子检测限

（Re/mL

）

烯丙孕素

杂质

A

Y

=

28.628

X

+

4.

933

8

0.999

9

0.329

0

-8.1150

Y

=

29681

X

+

097040

6000

0.5016

~

8625

9

Y

=

30

127

X

+

07393

0.999

9

0.303

7-8653

1

Y

=

39.786

X

+

1695

5

0.099

9

0.500

0

~

86000

0

60

0.

023

7

0.

025

3

0.

025

2

0613

20

r

L,

按拟订色谱条件进样测定,记录色谱图至保留时

间的

2

倍

。

结果见表

3

°

0.

09

0.

99

0.09

杂质

B

杂质

C

3

讨论

检测波长选择

分别称取烯丙孕素及杂质

A,B,C

适量

，

加流动相

3.

1

检测限确定:取

2

:

2

项下各溶液

，

将其稀释至一定

浓度

，

以

3

倍信噪比

（

S/N

=

3

）

测定

。

烯丙孕素及各杂

质的检测限见表

1

°

溶解并稀释成质量浓度为

0.

0

mg/mL

的溶液

，

通过

DAD

检测器进行全波长扫描,发现在

31

nm

波长处烯

丙孕素与各杂质的响应最接近,且杂质

A

和杂质

B

的

精密度试验:取同一批

（

批号为

151408

）

对照品

7

份,

精密称定,用流动相溶解并稀释成质量浓度为

0-

0

mg/mL

的溶液

。

采用不同人员

（

实验员

1,2

）

及设备

（

Agilent

相对响应因子在

0.

0

〜

0

1

间

，

可不使用校正因子

，

易于

简化方法

。

并对

“

专属性试验

”

项下样品进行检测

，于

160

-

1

型

,Agilen

）

160-2

型

）

按拟订色谱条件进样

测定

，

以各杂质的测定结果进行计算

。

结果实验员

1

采

31

nm

波长下相较其他波长可检测出更多未知杂质

，

故选用

316

nm

作为有关物质检测波长

。

7

•

检验检测

•

Inspection

rd

Test

202

年

月

5

日

第

30

卷第

期

China

Pharmaceuticals

表

2

Tab.

2

Vol.

30,

No.

2

Janua/

5,

200)

加样回收试验结果

(

a

=9

)

Result

ol

recovero

hstsi

a

=

9)

加入量

(

1/)

杂质

A

测得量

(ig)

杂质

C

杂质

A

杂质

B

杂质

C

杂质

A

回收率(％

)

杂质

B

杂质

C

杂质

A

x

(%3

RSD(%

)

杂质

C

杂质

A

杂质

B

杂质

B

杂质

B

杂质

C

0.

406

0

0.

406

0

0.

406

0

0.

503 0

0.

503 0

0.

503 0

0.

602

0

0.

602

0

0.

602

0

0.

404

5

0.

404

5

0.

404

5

0.

400

5

0.

400

5

0.

400

5

0.

503 0

0.

503 0

0.

503 0

0.

605 0

0.

605 0

0.

605

010

3

0.405

5

0.406

6

0.

502

0

0.

502

3

0.

505

5

0.

605

5

0.

429

3

0.

424

6

0124

5

0.

374

0

103.

05

06

:

25

04

.

75

06.

5

7

93.

70

9610

7313

7512

仝/]

10612

10615

017

6

0.

530

0

0.

549 0

0.

524

0

0.

633 6

0.

730

5

0.

625

5

OlOO

0106

4

OlOO

OlOO

OlOO

0.

66

5

0.

66

5

0.

66

93.

3

93.

93

0139

2

0.

505

0

9515

90.

75

04.

9

93.

65

90.

77

05.

70

90.

28

10615

10419

610

615

4.

29

9916

104.

05

106.

d

106.

43

019

6

0106

4

9613

90.

35

90.

9

0110

7

0110

7

0.

620

0

表

3

烯丙孕素有关物质检测结果

(

％

)

Tab.

3

Detection

result

ol

related

substances

ol

altrenogest

(

%)

V/

V

)

为流动相

。

3.4

耐用性考察

通过对流速

、

柱温

、

流动相比例进行微调

，

考察本方

总杂质

037

037

037

批号

0003

杂质

A

037

037

037

杂质

B

未检出

未检出

未检出

杂质

C

未检出

未检出

未检出

法的耐用性,结果上述条件的调整不影响烯丙孕素的有

关物质检测结果

，

表明该法灵敏度高

、

分离度好

、

专属性

191019

0023

强

、

结果准确,适用于烯丙孕素有关物质的检测

。

参考文献

J.

PAPILH

MG.

Saunders

Handboob

of

Vetehna/

Drugs

(Fourth

EdiVon

：

[M..

NetPerlanUs

：

EWovior,

2

014:

2

1

一

22.

3.

2

色谱柱选择

本试验中筛选了不同规格和品牌的

.

3

色谱柱

：

GRACE

All

/

ua

silica

C1

3

柱

(

250

mm

x

5.

4

mm

,

5

R

m

)

,

[2]

ROUSSEL

—

UCLAF.

WerUwijze

voor

hot

Oereiben

van

een

youa-

uUhUerUu/NL

4401955

[J..

044

-

03

-

20

Diamonsi-

C

o

(

2

)

柱

(

257

mm

x

5.

4

mm

,

5

R

m

)

,

Waterr

XTerr

a

RP

o

柱

(

2

57

mm

x

5.

4

mm,

5

R

m

)

,

AgeWvensi-

C

o

柱

(

257

mm

x

5.

4

mm

,

5

R

m)

,

K/mui-

90

—

5

—

C

o

柱

3.

李艳艳

，

李宇琛

，

姚诗贅

，

等

.

烯丙孕素內服溶液调控母猪同期发

情的临床药效试验

[J..

畜牧与兽医

,200,51(6

):

04-127.

J.

NADAL

-

ROIG

E,PLA

LM.

MuWipehob

planning

tool

for

multi

-

(

250

mm

x

5.

4

mm

,

5

R

m

)

,

GRACE

AlWima

C

o

柱

(

250

mm

x

5.

4

mm

,

5

Rm)

,

Welch

Matehatv

XB

-

C

o

柱

(

250

mm

x

5.

0

mm

,

5

R

m

)

,

OMNI

BOND

ORCA

C

o

柱

(

250

mm

x

5.

0

mm

,

5

R

m

)

。

由于杂质

A

和烯丙孕素在

色谱柱上的色谱行为极接近

，

而杂质

B

、

杂质

C

和烯丙

she

pig

proUxctiou

systems

J.

.

Jouruat

of

Animal

Science

,

2014

,

92(9):404

-

4160.

2.陈志林

，

师晓杰

，

张凯

，

等

•

烯丙孕素对乏情后备母猪繁殖

性能的影响

3.

养猪

,200(4):23

-

29.

[1.

李

晓

，

董瑞兰

，

宋春阳

，

等

•

烯丙孕素对批次化生产中后备

母猪繁殖性能及后代生长性能的影响

[J..

中国畜牧杂志

，

孕素的色谱行为差异较大，

故重点考察杂质

A

和烯丙

孕素的分离度

。

经筛选

，

上述色谱柱杂质

A

分离度分别

2020,56(7):01

—

94.

为无分离效果

，

116,

无分离效果

，

0

01,0

20,

0

73

,

无

2.

杨海峰

，

李艳艳,陈晓兰

，

等

.

烯丙孕素內服溶液的临床药效和靶

动物安全性研究

J.

中国农业科技导报

,2020,22(1

)

：

73

—

84.

分离效果

，

063

。

故最终确定色谱柱为

GRACE

AlWima

2.

冯言言

，

郑莉

，

林红

，

等

•

烯丙孕素溶液对母猪繁殖性能

的临床疗效研究进展

J.

今日养猪业

，2020(3):32-34.

C

o

柱

(

250

mm

x

5.4

mm

,

5

R

m

)

。

3.

3

流动相选择

本试验中通过流动相组成对比(

甲醇和乙腈)

，发现

2.

国家药典委员会

.

中华人民共和国药典(二部

H

m

..

北京

：

中国医药科技出版社

,

200

：

480

-

435.

使用甲醇时,

烯丙孕素与各杂质无法有效被洗脱分离

,

采用乙腈能使各杂质完全分离

。

通过调整乙腈比例

[10.

国家药品监督管理局

.

化学药物杂质研究的技术指导原

贝则

[EB/OL].

(2007-03-23)3020-01

-20]

.http:

///ww.

cho.

ory.

cs/zdyz.

do?

methob

=

laryeOaye&ib

=

507a301fU

本栏目由

(

57%

,55%

,60%

,

65%

,

74%

、

进行

条件优化

，

结果

[11.

MAHESWARAN

R.

FDA

Perspec/vos

：

ScUutUic

ConSberabons

of

Fo/eh

DeqadatUn

StuXios

in

ANDA

SuXm/sUns

[J

].

Pharma-

国药控股云南有限公司

协办

72

ceh/cat

TechuUw/,2012,36

(

5)

：

73

—

80.

64%

乙腈的分离

效果最好

，

故选择

[12.

黄晓龙

.

浅谈强制降解试验

[EB/OL..

(2004

-03

-

11)

[2020

-

06

-

25

..

http:

/

/

/ww.

cho.

ory.

co/dzdw.

do?

methob

=

laryeOayo

&ib

=

1470.

(收稿日期

:

2020

-63

-

13;

修回日期

：

2020

-06-25)

水

-

乙腈

(

40

：

60

,