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不同液态发酵基质对红曲霉产红曲色素及桔霉素的影响

吴宏;代文婷;连喜军;郭安民;吴洪斌

【摘 要】在前期分离纯化出的10株红曲霉基础上,以18种液体培养基对10株红

曲霉进行发酵培养,通过分光光度计和质谱分析仪测定各发酵液中红曲色素和桔霉

素含量,分析不同地区红曲霉的红曲色素和桔霉素的代谢特性,筛选出高产红曲色素

低产桔霉素的红曲霉菌株.结果表明,产红曲色素最适的液体培养基配方为葡萄糖

3％、蛋白胨1％,其中新疆地区红曲霉所产红曲色素量最高,为6.81×10-2 mg/mL;

新疆地区红曲霉仅在18种培养基中的面筋碱性蛋白酶水解液+葡萄糖发酵液中产

生了桔霉素,而红曲霉ZBX天津在所有培养基发酵液中均未产生桔霉素.

【期刊名称】《中国酿造》

【年(卷),期】2018(037)011

【总页数】4页(P91-94)

【关键词】红曲霉;红曲色素;桔霉素

【作 者】吴宏;代文婷;连喜军;郭安民;吴洪斌

【作者单位】新疆农垦科学院农产品加工研究所,新疆石河子832000;新疆农垦科

学院农产品加工重点实验室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工研究

所,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工重点实验室,新疆石河子

832000;天津商业大学天津市食品生物技术重点实验室,天津300134;新疆农垦科

学院农产品加工研究所,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工重点实验

室,新疆石河子832000;新疆农垦科学院农产品加工研究所,新疆石河子832000;新

疆农垦科学院农产品加工重点实验室,新疆石河子832000

【正文语种】中 文

【中图分类】TQ925.7

红曲霉菌（Monascus）属于真菌界，子囊菌门，子囊菌纲，散囊菌目，红曲科，

由法国科学家Van Tieghem于1884年分类并命名[1]。中国红曲发酵始于唐朝，

主要用于腐乳、民间医药、食品着色剂、发酵剂和红米酒[2]。红曲色素是红曲霉

代谢过程中产生的系列聚酮类化合物，是微生物发酵法工业化生产的天然色素，广

泛应用于食品、医药及化妆品领域[3-5]。红曲色素的传统生产方式为固态发酵，

其生产率低，耗粮多，而液体发酵具有生产周期短、工艺简便、安全性高的特性

[6]。目前，优化红曲菌发酵培养基质及条件是提高红曲色素生产水平和降低桔霉

素含量的有效途径之一[7]。桔霉素是红曲霉代谢产生的一种真菌毒素，具有显著

的肾毒性、肝毒性、致癌、致畸性及免疫毒性[8-12]。自法国科学家Blanc1995

年首次在红曲中发现强毒性桔霉素后，国内外针对红曲产品的安全性提出了制约条

件。日本规定红曲色素中桔霉素限制标准为0.2 mg/kg[13]。美国食品药品监督管

理局（food and drug administration，FDA）规定红曲色素中含有的桔霉素安

全性合格后才能作为食品添加剂使用。欧洲规定了只允许不含桔霉素的产品进口和

销售[14-15]。

该研究在前期新疆及其他地区腐乳中分离纯化得到的10株红曲菌的基础上，经过

18种液体培养基发酵，分析其次级代谢产物——红色素和桔霉素，筛选出产红色

素能力强、低产或不产桔霉素的菌株。通过探索不同地区红曲霉的红色素产量以及

产桔霉素的特性，以期为红曲霉在食品工业中更好地发挥作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要材料

10株红曲霉菌为本实验室前期从不同地区腐乳中分离纯化得到[16]，其中红曲霉

菌“连天津”为实验室现有红曲霉；ZBX新疆：分离自新疆大块红腐乳；BCQ吉

林：分离自吉林朱老六红腐乳；BCQ广东：分离自广东广利达南乳红腐乳；ZBX

天津：分离自天津利民红腐乳；BCQ（D）：分离自北京老才臣大块红腐乳；ZBX

（8）：分离自北京老才臣玫瑰腐乳；ZBX（D）：分离自北京王致和大块红腐乳；

9（M）：分离自北京王致和玫瑰腐乳；9（H）：分离自北京王致和红辣腐乳。

1.1.2 主要试剂

大豆分离蛋白（食品级）：谷神生物科技集团有限公司；碱性蛋白酶（2×106

U/g，食品级）：天津滨海诺奥科技发展有限公司；红曲红素标准品（纯度

≥99.0%）：上海洽姆仪器科技有限公司；蛋白胨、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖（均为

生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市风

船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DZKW-S-4电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；YX-18LM手提式

压力蒸汽灭菌器高压锅：江阴滨江医疗设备有限公司；L535-1低速离心机：湖南

湘仪实验室仪器开发有限公司；SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有

限公司；HNY-111C恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；TU-1901

分光光度计：北京谱析责任有限公司；LCQ-Advantage液质（liquid

chromatographymass spectrometr，LC-MS）联用仪：美国Thermo-

Finnigan公司。

1.3 方法

分别用麦芽糖、葡萄糖和蔗糖为碳源，并分别以蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆分离

蛋白碱性蛋白酶水解液、面筋碱性蛋白酶水解液、碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液和醇

溶蛋白碱性蛋白酶水解液做氮源，制成18种发酵培养基，将新疆和其他地区分离

得到的10株红曲霉菌株分别于18种液体培养基中发酵培养，然后进行发酵代谢

产物红曲色素和桔霉素的吸光度值测定和质谱分析，最终确定适合的红曲霉液体培

养基和高产红曲色素低产桔霉素的红曲霉菌株。

1.3.1 红曲霉液体培养基的制备

（1）制备大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解液：将7%的大豆分离蛋白水溶液煮开放

凉，用NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解

5 h；

（2）制备面筋碱性蛋白酶水解液：将7%的面筋水溶液煮开放凉，用NaOH调节

pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（3）制备碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液：将7%的碱溶蛋白水溶液煮开放凉，用

NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（4）制备醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液：将7%的醇溶蛋白水溶液煮开放凉，用

NaOH调节pH=8.0，加入0.1%的碱性蛋白酶，于55℃恒温条件下酶解5 h；

（5）分别用麦芽糖、葡萄糖和蔗糖为碳源，以蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆分离

蛋白碱性蛋白酶水酶解液、面筋碱性蛋白酶水解液、碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液和

醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液作氮源，制作18种发酵培养基，通过后续发酵确定最

适培养基组成。培养基设计：100 mL发酵液：添加3%碳源+1%氮源，①代表蛋

白胨，②代表大豆分离蛋白，③代表大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解液，④代表面筋

碱性蛋白酶水解液，⑤代表碱溶蛋白碱性蛋白酶水解液，⑥代表醇溶蛋白碱性蛋白

酶水解液。麦芽糖以M表示，葡萄糖以P表示，蔗糖以Z表示。18种发酵培养

基设计如下：①+M、①+P、①+Z、②+M、②+P、②+Z、③+M、③+P、

③+Z、④+M、④+P、④+Z、⑤+M、⑤+P、⑤+Z、⑥+M、⑥+P、⑥+Z。

1.3.2 液体培养基的灭菌与接种培养

将3%碳源、1%氮源、100 mL水加入三角瓶中，用纱布、牛皮纸封口，放入蒸汽

高压灭菌锅，121℃灭菌20min，灭菌后冷却至室温。将分离纯化后的不同红曲

霉菌株接种到液体培养基中，置于摇床中，32℃、180r/min条件下培养48h。

1.3.3 吸光度测定与含量计算

将经过48 h发酵后的红曲霉发酵液逐一进行离心，分别取上清液，用分光光度计

在波长490nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算其色素产量。

1.3.4 质谱条件

质谱条件：电喷雾离子源；扫描方式为负离子扫描；雾化气压力为80 kPa；毛细

管电压3.5 kV，干燥气温度180℃，干燥气流速6.0 L/min。

2 结果与分析

2.1 10株红曲霉在18种培养基发酵液的红曲色素含量

图1为红曲色素标准曲线。发酵液中的红曲色素含量由红曲色素标准液曲线计算

得出，结果见表1。

图1 红曲红的标准曲线Fig.1 Standard curve of Monascus red

表1 红曲霉菌种发酵产色素量Table 1 Production of Monascus pigments

from Monascus strains fermentation mg/100 mL色素产量红曲霉菌株1.连天

津 新疆 吉林 广东 天津

①+M①+P①+Z②+M②+P②+Z③+M③+P③+Z④+M④+P④+Z⑤+M⑤+P⑤

+Z⑥+M⑥+P⑥+Z色素产量

①+M①+P①+Z②+M②+P②+Z③+M③+P③+Z④+M④+P④+Z⑤+M⑤+P⑤

+Z⑥+M⑥+P⑥+Z 0.71 5.79 1.20 1.05 1.32 0.63 2.53 2.52 0.71 2.02 1.36

2.04 0.63 0.84 0.35 0.69 1.60 0.59 6.81 6.81 6.81 3.46 2.04 6.81 6.81 6.81

6.75 6.75 5.66 6.81 6.81 6.81 5.35 6.81 5.04 6.81 4.46 6.81 6.03 4.72 1.71

1.90 5.38 2.40 4.65 5.81 3.03 5.27 6.81 3.31 5.70 5.88 3.67 6.81 6.81 6.81

6.69 1.48 1.93 1.84 4.37 5.47 2.68 4.73 6.81 4.11 6.81 5.07 3.27 4.13 4.27

2.88 5.26 6.81 2.97 0.87 1.30 1.33 6.81 3.72 6.81 6.58 5.74 3.82 6.63 6.81

2.57 6.81 2.21 2.38红曲霉菌株(D)6.81 6.81 6.81 4.28 6.12 1.40 6.81

5.45 6.81 4.84 6.15 6.29 6.81 4.39 6.81 6.81 6.54 6.81 (8)3.41 6.81 5.98

7.27 5.06 1.04 6.81 6.81 5.79 6.81 4.55 6.81 6.81 5.45 4.92 6.81 6.81 2.30

(D)4.93 6.81 6.81 1.17 5.32 2.40 5.23 4.76 2.95 3.77 6.81 6.49 4.20 4.42

5.18 2.77 2.71 5.81 9.9(M)6.81 6.81 6.40 1.53 1.96 3.32 3.06 5.93 6.81 6.81

2.91 3.96 2.87 3.94 4.75 6.18 3.36 3.97 10.9(H)6.81 6.81 6.81 1.67 1.99 0.79

6.81 4.61 5.15 6.81 6.03 6.40 6.29 5.59 4.38 4.46 4.30 5.98

从表1中10株红曲霉对应的各种培养基发酵液中红曲色素产量可看出，红曲霉

ZBX（8）在各培养基的最高红曲色素产量值为7.27×10-2 mg/mL，对应培养基

为②大豆分离蛋白+M麦芽糖培养基，而另外9株红曲霉中除了连天津红曲霉外，

其他8株菌红曲色素产量最高的均集中在①蛋白胨+P葡萄糖培养基，红曲色素产

量最高为6.81×10-2 mg/mL，故最佳培养基为蛋白胨＋葡萄糖培养基。相比较而

言，ZBX新疆的红曲色素在各培养基的最低产量较其他菌株高，连天津的红曲色

素产量较低，分离自北京腐乳中的菌株红曲色素产量并不相似，广东腐乳中分离出

的菌株红曲色素产量较东北腐乳中分离的菌株红曲色素产量要高。各菌株具体的红

曲色素产量范围见表2。

表2 红曲霉的色素产量范围Table 2 Yield range of Monascus pigments

mg/100 mL色素产量红曲霉菌株1.连天津 新疆 吉林 广东

天津范围色素产量范围0.35～5.792.04～6.811.71～6.811.48～

6.810.87～6.81红曲霉菌株(D)1.40～6.81 (8)1.04～7.27

(D)1.17～6.81 9.9(M)1.53～6.81 10.9(H)0.79～6.81

由表2可知，新疆红曲霉的红色素产量最高，其范围为2.04×10-2～6.81×10-2

mg/mL，并且其红色素产量达到最大值6.81×10-2 mg/100 mL时所对应的培养

基有11种，比较而言，新疆红曲霉为产红曲色素的最佳菌种。连天津红曲色素产

量最低，其浓度范围0.35×10-2～5.79×10-2 mg/100 mL。

2.2 10株红曲霉所对应的培养基发酵液中桔霉素质谱图分析

若发酵液含有桔霉素，则质谱图中出现的质核心（m/z）为249或251。红曲霉

ZBX新疆在④+P培养基中培养48 h的发酵液质谱图分析结果见图2（代表性质

谱图），含有桔霉素的红曲霉及其对应的发酵液培养基如表3所示。

图2 红曲霉ZBX新疆在面筋碱性蛋白水解液和葡萄糖发酵液的质谱图Fig.2 Mass

spectrogram of Monascus ZBX-Xinjiang at hydrolytic solution of gluten

alkaline protease and glucose fermentation liquid

由表3可知，新疆地区红曲霉只有在培养基为④+P的发酵液中出现了桔霉素，约

为0.7×104 ng/mL，该地区红曲霉在其余的发酵液中均无桔霉素检出；对于实验

所涉及的所有发酵液来说，培养基为①+Z、②+Z、④+Z、⑤+M、⑤+Z、⑥+M、

⑥+Z这7种发酵液中均无桔霉素；而红曲霉ZBX天津的所有发酵液中均未检测

出桔霉素。3结论

表3 产桔霉素的红曲霉及其对应的发酵液培养基Table 3 Monascus strains with

citrinin production and their corresponding fermentation medium注：“-”

表示未检出。100mL发酵液：3%碳源+1%氮源 麦芽糖M 葡萄糖P 蔗糖Z①蛋白

胨广东(D)②大豆分离蛋白吉林(D)- -③大豆分离蛋

白碱性蛋白酶水解液(D)9.9(M)(D)④面筋碱性蛋白酶水解液⑤碱溶蛋

白碱性蛋白酶水解液⑥醇溶蛋白碱性蛋白酶水解液10.9(H)吉林；

广东(D)；(D)9.9(M)；10.9(H)1.连天津；广东吉林；

(8)(D)；10.9(H)1.连天津；吉林(D)- -新疆

广东吉林10.9(H)1.连天津- - -

通过以上实验分析得出，在研究的多地区10株红曲霉及其对应的18种液体培养

液中，红曲霉产色素量与红曲霉菌种和液体培养基组成有重要关联。在10株红曲

霉菌种中，红曲霉ZBX（8）仅在②大豆分离蛋白+M麦芽糖培养基中红曲色素产

量最高，为7.27×10-2 mg/mL，新疆地区红曲霉的红色素产量达到最大值

6.81×10-2 mg/100 mL时所对应的培养基有11种；除了连天津红曲霉和ZBX

（8）红曲霉，其余8株红曲霉色素产量最高的一组均集中在①蛋白胨+P葡萄糖

培养基，红曲色素产量为6.81×10-2 mg/mL；通过质谱分析，新疆地区红曲霉在

18种液体培养基中仅在④面筋碱性蛋白酶水解液+P葡萄糖的发酵液中产生桔霉

素，其余培养液中均无桔霉素产生，红曲霉ZBX天津的所有发酵液中均未产生桔

霉素。综上所述，红曲霉ZBX天津安全性最强，而新疆地区红曲霉比其他地区红

曲霉菌种产色素能力强。

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