2024年5月4日发(作者：文件夹在哪里找)

一

３ｌ一　中国动物检疫２０１０年第２７卷第２期　

两种方法纯化兔抗绵羊肺炎支原体Ｉ　ｇＧ的比较　

武薇，韩克光　

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷０３０８０１）　

摘要：目的：比较两种方法纯化兔抗绵羊肺炎支原体ＩｇＧ的效果。方法：采用饱和硫酸铵和辛酸一硫酸铵两种　

方法分离纯化兔抗绵羊肺炎支原体抗体，并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）、分光光度计和琼脂　

扩散（ＡＧＰ）试验对纯化产物进行相对分子质量、蛋白质含量及免疫活性进行鉴定。结果：纯化后抗体的蛋白含量基本　

相同；产物纯度和效价以辛酸一硫酸铵法较高。结论：辛酸硫酸铵法是一种简便、快速、高效的抗体纯化方法　

关键词：绵羊肺炎支原体；抗体纯化；辛酸硫酸铵法；饱和硫酸铵法　

中图分类号：￥８５２．６２　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００５—９４４Ｘ（２０１０）０２一ｏｏ３ｉ一０２　

Ｃ‘衄ｐａｒｉ蛳ｏｆ　ｔｗｏ　ｍｎｔｈｍ￣ｏｆ　ｐｑ瑾　ｌｈｅ　哺ｉ　删咖Ｐｍｕｍｏｎｉａ　Ｍｙｅ，ｏｐｌａｍｍ　ＩｇＧ　

Ｗｕ　Ｗｅｉ，Ｈａｎ　ｋｅ—ｇｕａｎｇ　

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ，Ｓｈａｎｘｉ　０３０８０　１）　

Ａｌｘ血矗融：ａ珈　即：Ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ—ａｎｔｉ—ｓｈｅｅｐ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　

ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ＩｇＧ．　【一ｈＯｄ：Ｓｅｐａｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｎｆｙ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔ—ａｎｔｉ—ｓｈｅｅｐ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ＩｇＧ　ｕｓｉｎｇ　ｓａｔｕｒａｔｅｄ　

ａｍｍｏｎｉｍｕ　ｓｕｌｆａｔｅ　（ＡＳ）ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｃａｐｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ—ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ（ＣＡ—ＡＳ）ｍｅｔｈｏｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｅｓｔ　

ｈｔｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ，ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ａｃｔｉｖｉｙｔ　ｂｙ　ｓｏｄｉｍｕ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　

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ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

免疫球蛋白尤其ＩｇＧ现己广泛　

率，蛋白质含量等方面比较这两种纯　

ｍａ）；ｓｗ—ｃＪ一１Ｆ超净工作台（苏州净　

应用于生命科学的许多领域，特别是　

化方法的提纯效果　］，旨在为抗体纯　化设备有限公司）；ＡＲ１４０电子天平　

在医学诊断和基础研究中起着越来　化提供一种简便实用的方法。　

（美国ＯＨＡＵＳ公司）；ＵＶ２０００型分光光　

越重要的作用。随着人们对免疫球蛋　１材料与方法　度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；　

白性质认识的深入以及蛋白质检测　

１．１　材料　

６８１型磁力加热搅拌器（上海南汇电　

技术的发展，免疫球蛋白纯化技术也　１．１．１　主要试剂　讯器材厂）；ＤＹＹ一５型电泳仪（北京六　

在不断改进。ＩｇＧ主要来源于血清和　琼脂粉（Ｓｏｌａｒｂｉｏ批号０６０８１５）；　

一

仪器厂）；Ｋｏｄａｋ　１Ｄ凝胶成像系统　

动物的腹水，常常在不同程度上混杂　

正辛酸（成都科龙化工试剂厂批号　

（Ｋｏｄａｋ公司）。　

非抗体蛋白和脂类物质，所以为消除　

２００６１２０１）；硫酸铵（天津市化学试剂　

１．１．３实验动物　

干扰，必须对其进行纯化。在提纯ｌｇＧ　

三厂批号２００６０６２８）；丙烯酰胺（Ｓｏ—　９０日龄健康日本大耳白兔（清洁　

过程中，不但要保证除去绝大多数杂　

ｌａｒｂｉｏ批号０７０６１１）；Ｎ，Ｎ一亚甲基双　

级，北京兴隆实验动物饲养厂）。　

蛋白而且不影响ＩｇＧ生物活性，这就　丙烯酰胺（Ｓｏｌａｒｂｉｏ批号０７０２１６）；　

１．２方法　

需要一种好的硫酸铵法提纯兔抗绵　

ＥＤＴＡ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ批号０７０９１　１）。　

１．２．１兔抗绵羊肺炎支原体ＩｇＧ血　

羊肺炎支原体ＩｇＧ，并从纯度，回收　

１．１．２主要仪器　

清的制备　

透析袋（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）；ＴＤＬ一５０Ｂ台　

按照裴艳涛嘲的免疫程序对兔子　

山西省科技攻关项目资助．项目编号：　

式离心机（上海安亭科学仪器厂）；　

进行免疫，抗体效价合格后无菌采集　

２Ｏ０６０３１　０５８—１　

通讯作者：韩克光　

３Ｋ３０型高速冷冻离心机离心机（Ｓｉｇ—　血液１０ｍＬ，置３７℃作用１ｈ，再经　

阿蒂斯Ｔ，等．分子克隆实验指南［￣【］．　

ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ．Ａｒｃｈ　Ｖｉｍｌ。　ｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ　

第２版．金冬雁，黎孟枫，侯云德，译．　

１９９４，ｌ３８（３—４）：２１２—２３１．　

ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ［Ｊ］．Ａｄｖ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ，１　９８７，３３　

北京：科学出版社，１９９２．　

［９］　ｏｌｏｆｅｓｓｏｎ　Ａ，Ｍｉｔｔｅｌｂｏｌｚｅｒ　Ｃ，　

（１）：９ｌ－１７４．　

［８］　Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｃｋ　Ｅ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒｓｅｎ　Ｓ，　

Ｔｒｃｉｂｅｒｇ　Ｂｅｍｄｔｓｓｏｎ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｕｎｕｓｕａｌ，　

［１１］Ｂｏｏｍ　Ｍ　Ｅ，Ｒａｃｅ　Ｒ　Ｅ，Ｗｏｌｆｍ－　

Ｓｔｒｏｒｇａａｒｄ　Ｔ。ｅｔ　ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐａｒｉ－　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌｅｕｔｉａｎ　ｍｉｎｋ　

ｂａｒｇｅｒ　Ｊ　Ｂ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＡｌｅｕｔｉａｎ　

ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｎｏｎ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｏｆｕｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ．Ｊ　Ｃｌｎｉ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７　

ｉｄｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　ａｓ　ａ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］，Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，　

ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ａｌｅｕｔｉａｎ　ｍｉｎｋ　ｄｉｓ—　（１２）：４１４５－４１４９．　

１９８０－３５（３）：８３６．８４３．　

ｅａｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌ　

［１０］Ｃｏｔｍｏｒｅ　Ｓ　Ｆ，Ｔａｔｔｅｒｓａｌ１　Ｐ．Ｔｈｅ　ａｕ—　

中国动物检疫２０１０年第２７卷第２期　一３２—　

相同，辛酸硫酸铵法纯化后大部分杂　

２５００ｒ／ｍｉｎ，离心１５ｍｉｎ，取上清即可。　

２．３蛋白含量测定　

两种方法提纯后的蛋白含量相　

蛋自己被去除，只有少量杂蛋白存　

１．２．２抗体纯化辛酸一硫酸铵盐　

析法和饱和硫酸铵盐析法参照文献　

差０．３８７４ｍｇ／ｍＬ，饱和硫酸铵法为　在，ＩｇＧ为主体，饱和硫酸铵纯化后多　

进行　。　

１０．２４０４ｍｇ／ｍＬ辛酸硫酸铵法为　

为杂蛋白，ＩｇＧ所占比例较低。两种方　

法提纯后的纯度都较纯化前　

１．２．３抗体纯化前后效价测定采用　

ｌＯ．６２７８ｍｇ／ｍＬ，结果见表ｌ。　

双向琼脂免疫扩散（ＡａＰ）试验测定埘。　

表１　两种方法提纯后抗体的蛋白质含量　

１．２．４抗体纯度测定纯度测定采　

用￥ＤＳ－ＰＡＧＥ电泳法［５］。　

１．２．５　ＩｇＧ蛋白含量的测定　采用　

分光光度计法［６］，公式为：蛋白含量　

（ｍｇ／ｍＬ）＝（１．４５Ａ　一Ｏ．７４Ａ￣）×稀释　

（５２．２３％）纯度有很大提高。与相关　

３分析与讨论　

对于抗体的纯化、特别是免疫球　

文献论述相符【７］由此可见辛酸法对血　

２．１　抗体纯化前后的效价　

提纯前的血清效价为１：１６，辛酸　

蛋白ＩｇＣ的纯化，尽管纯化方法较　清的纯化效果较理想，且优于饱和硫　

　

硫酸铵法提纯后的抗体效价不变，饱　

多、较成熟，但对于不同来源抗体的　酸铵法。

纯化，合理选择既简单快捷，又可得　

４结论　

和硫酸铵法的为１：８。　

到高纯度、活性好的抗体纯化方法却　辛酸硫酸铵法是优于饱和硫酸　

２．２抗体纯度测定　

提纯前的血清，有多条带，说明　

十分关键。为得到一种更好的纯化兔　

铵法，并且能够满足各种体外检测实　

含有多种蛋白。经辛酸法纯化后，肉　

抗绵羊肺炎支原体ＩｇＧ的方法，本实　验的纯化抗体的有效方法。　

眼只见分子量为４５ＫＤ和２５ＫＤ的两　

验采用饱和硫酸铵和辛酸一硫酸铵　

参考文献　

条条带，与ＩｇＧ抗体的重链和轻链的　

两种方法分离纯化兔抗绵羊肺炎支　［１］周玉，李岩松，潘风光，等．小鼠　

分子量相符；经饱和硫酸铵法纯化　

原体抗体，并用十二烷基硫酸钠聚丙　腹水ＩｇＧ类单克隆抗体纯化方法的　

后，可见多条亮度不同的条带，在　

烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）、分光　

研究［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００６，　

　

４５ＫＤ和２５ＫＤ处颜色较浅。　光度计和琼脂扩散（ＡＧＰ）试验对纯化　

（１Ｏ）：１４—１６．

用Ｋｏｄａｋ　１０凝胶成像系统对电　产物进行相对分子质量、蛋白质含量　［２］裴艳涛．绵羊肺炎支原体标准株　

　

Ｙ９８蛋白质组双向电泳图谱的构建及　

泳胶进行蛋白带密度扫描，结果（图　

及免疫活性进行鉴定。

抗原与抗体在凝胶内扩散，在两　其抗原性研究［Ｄ］．保定：河北农业　

１）表明，辛酸硫酸铵沉淀血清的纯度　

较高，达９８．０５％。饱和硫酸铵沉淀后　

孔之间比例最合适的位置出现沉淀　大学硕士论文，２００３．　

血清的纯度是８５％。　带，沉淀带相对应的稀释倍数为效　［３］罗胜军，李小兵，魏东，等．三种　

１　２　４　

价。辛酸硫酸铵法提纯后的抗体效价　

方法纯化相思子毒素单抗的比较　

没有发生变化，饱和硫酸铵提纯后效　［Ｊ］．动物医学进展，２００６，２７（１１）：　

　

价降低，是纯化过程中将部分ＩｇＧ去　

７２－７５．

除了的缘故。　

［４］姚火春．兽医微生物学实验指导　

盐析（特别是饱和硫酸铵盐析　

［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００８，　

法）是抗体分离纯化中最常用的技术　

５Ｏ．　

之一，具有溶解度大、对温度不敏感、　

［５］周顺伍．动物生物化学实验指导　

分离效果好、对抗体有稳定结构等优　

［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００６，３：　

　‘

　

点。辛酸硫酸铵法中辛酸这种短链脂　

１４０－１４４．

肪酸在酸性（ｐＨ４．２～４．５之间）条件　［６］王林嵩．生物化学实验技术［Ｍ］．　

下，能沉淀兔抗绵羊肺炎支原体血清　

北京：科学出版社，２００７，９：２９．　

中的非ＩｇＧ类蛋白，再结合硫酸铵盐　

［７］白丽，钱王晶．应用辛酸硫酸胺　

析，可以比硫酸铵法从血清中获得更　

法提取小鼠腹水和血清中的ＩｇＣ抗　

高纯度的ＩｇＧ。利用该方法纯化抗体，　

体［Ｊ］．大理医学院学报，２０００，９（４）：　

３—４　

回收率和纯度都可达８０％以上。　

倍数。　

２结果　

１：饱和硫酸铵提纯的抗体；２：辛酸一硫酸　

铵提纯的抗体；３：提纯前的血清；４：蛋白　

Ｍａｒｋｅｒ　

图１　血清提纯前后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图　

……　…’…’’’。……’’…’……

抗体纯化前后的蛋白含量基本　

……’’’’………………’…’…………’’’　………　…’……’’　

ｉ　

ｉ　

韩国一农场出现口蹄疫　

２０１０年１月７日，韩国农林水产食品部表示，京畿道抱川市一家奶牛农场发生口蹄疫，这是韩国自２００２年　

以来首次出现口蹄疫疫情。　

韩国农林水产食品部当天表示，农场的６头奶牛被确认感染口蹄疫。为防止疫情进一步扩散，政府部门决定　

从当天起对以该农场为中心的半径５００米区域内的所有牛、猪等偶蹄类动物进行屠宰。同时，以该农场为中心，　

；将半径３公里以内、３至１０公里、１０至２０公里的区域分别设定为危险区、警戒区和管理区，以加强对这些区域　

内人员和家畜的管理。此外，政府部门还将在全国范围内对家畜实施紧急防疫措施。　

’　

。…。。。…………。…。。。。…。……。。……。…　…。………。。……。…。。…。。。…。。……　…。…。…。