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细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell

Apoptosis)

2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验 浏览次数：197 网友评论 0 条

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发

育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临

床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有

关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA

降解、凋亡小体形成等。

关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis

一、实验原理

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，

它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作

用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有

关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列

的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在

正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡

的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜

联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结

合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的

Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料

Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC） 500μl/250μl 20μg/ml

标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 ml

PBS（1×） 60/30 ml

20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头

微量离心管

可调速离心机

载玻片（用于荧光显微镜观察）

盖玻片（用于荧光显微镜观察）

去离子水

冰块

流式细胞仪或荧光显微镜

三、实验方法

1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺

细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml，备用。

2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心103．重复

步骤2两次。

4．将细胞重悬于200μl 标记缓冲液。

5．加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。

6． 加入300μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。

四、 实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特

有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI(碘化丙

啶)拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

五、注意事项

1．整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。

3．反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开

始衰变。

4． Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。