2024年5月4日发(作者：)

SyntheticBiologyJournal

2021，2（2）：222-233

2021年第2卷第2期

|

特约评述

DOI

:

10.12211/2096-8280.2020-048

合成甲基营养细胞工厂同化甲醇的研究进展及未来展望

张卉

1，2

，袁姚梦

3，4

，张翀

3，4

，杨松

1，2，5

，邢新会

3，4

（

1

青岛农业大学生命科学学院，山东青岛

266109；

3

266109；

2

青岛农业大学，山东省应用真菌重点实验室，山东青岛

100084；

4

清华大学合成与系

266109）

清华大学化学工程系生物化工研究所，工业生物催化教育部重点实验室，北京

统生物学研究中心，北京100084；

5

青岛农业大学，青岛生物沼气环境微生物国际合作基地，山东青岛

摘要：甲醇具有来源广、易储存运输、原料价格竞争力强等优势，被视为极具潜力的生物制造非糖基碳源资源。

常用的模式底盘微生物研究历史长、认知清楚、操作工具多，在工程化改造中具有显著优势。近年来，通过借鉴

天然甲基营养型微生物的甲醇利用途径对模式底盘进行改造，获得具备高效利用甲醇能力的合成甲基营养细胞工

厂的研究日益受到关注。本文系统综述合成甲基营养细胞工厂的甲醇氧化、同化基因及其调控元件，和以共用糖

基碳源结合适应性进化策略为主的核酮糖单磷酸途径重构及甲醇同化途径设计构建的研究现状，进而结合合成甲

基营养细胞工厂面临的挑战进行展望，提出基于全基因组靶向基因编辑技术结合实验室适应性进化策略构建更高

效合成甲基营养细胞工厂的研究方向。

关键词：甲醇；合成甲基营养细胞工厂；生物元件；核酮糖单磷酸途径；实验室适应性进化

中图分类号：Q815文献标志码：A

Researchprogressesandfutureprospectsofsyntheticmethylotrophiccell

factoryformethanolassimilation

ZHANGHui

1，2

，YUANYaomeng

3，4

，ZHANGChong

3，4

，YANGSong

1，2，5

，XINGXinhui

3，4

（

1

SchoolofLifeSciences

，

QingdaoAgriculturalUniversity

，

Qingdao266109

，

Shandong

，

China

；

2

ShandongProvinceKey

LaboratoryofAppliedMycology

，

QingdaoAgriculturalUniversity

，

Qingdao266109

，

Shandong

，

China

；

3

KeyLabofIndustrial

Biocatalysis

，

MinistryofEducation

，

InstituteofBiochemicalEngineering

，

DepartmentofChemicalEngineering

，

Tsinghua

University

，

Beijing100084

，

China

；

4

CenterforSyntheticandSystemsBiology

，

TsinghuaUniversity

，

Beijing100084

，

China

；

5

QingdaoInternationalCenteronMicrobesUtilizingBiogas

，

QingdaoAgriculturalUniversity

，

Qingdao266109

，

Shandong

，

China

）

Abstract:Methanolisanimportantandattractivenon-sugarcarbonsourceforindustrybiotechnologyduetoits

advantagesofavailablesource,easystorage,ely-studied

microorganismssuchasEscherichiacoli,CorynebacteriumglutamicumandSaccharomycescerevisiaehavealong

researchhistory,cleargeneticbackgroundandanumberofmaturedgenetictools,showingtheirpotentialin

eaccumulatedknowledgeofnativemethylotrophsinrecentyears,

收稿日期：2020-06-15修回日期：2021-01-11

基金项目：国家重点研发计划（2018YFA0901500）

引用本文：张卉，袁姚梦，张翀，杨松，邢新会.合成甲基营养细胞工厂同化甲醇的研究进展及未来展望［J］.合成生物学，2021，2（2）：222-233

Citation：ZHANGHui，YUANYaomeng，ZHANGChong，YANGSong，chprogressesandfutureprospectsofsyntheticmethylotrophiccell

factoryformethanolassimilation［J］.SyntheticBiologyJournal，2021，2（2）：222-233

第2卷

223

thesetraditionalindustrialmicroorganismshavebeenengineeredasmethylotrophiccellfactories(MeCFs)capableof

artical,wereviewtherecentresearchprogressincluding

genesinvolvedinthemethanoloxidation,summarizedthe

strategiesbasedontheadaptivelaboratoryevolutionwhichappliessugarastheco-substratetoconstructtheribulose

monophosphate(RuMP)cycle,asw

syntheticMeCFs,theconstruction,

methanoldehydrogenaseencodedbymdh,3-hexulose6-phosphatesynthaseencodedbyhpsand6-phospho3-

nzymescanbefurtherengineeredtoimproveactivitiesthroughprotein

ile,genesinvolvedinmethanoloxidationandassimilationpathwayscan

herimprovemethanolutilizationofthesyntheticMeCFs,theco-

substrateforsupportinggrowthhasbeendevelopedtopropelmethanolassimilation,whichrationallydesignsa

methanoldependentgrowthmodel,andthusprovidesanidealstartingpointforsubsequentlong-termadaptive

nd,wediscussthechallengesofengineeringthesyntheticMeCFs,and

summarizethefutureprospectsforimprovingtheefficiencyofmethanolutilizationthroughthecombinedstrategiesof

genome-widetargetedgeneeditingandadaptivelaboratoryevolution.

Keywords:methanol;syntheticmethylotrophiccellfactory;biologicalelements;ribulosemonophosphatepathway;

adaptivelaboratoryevolution

生物经济成为绿色可持续产业和社会发展的

重要模式，其核心是生物制造。然而，不可再生

的化石资源和与人争粮的糖基原料已经难以作为

最优原料支撑工业生物制造的应用发展

［1］

，同时

木质纤维素原料目前仍存在预处理技术和经济性

的局限，因此寻找合适的非糖替代原料是生物制

造的重要挑战

［2］

。廉价和来源广泛的有机碳一原

料甲醇，主要可以由煤和天然气生产，并且通过

224

合成生物学第2卷

沼气或城市固体废物产生的二氧化碳与电解生成

的氢气进行反应获得可再生的甲醇

［3-5］

。与传统的

糖基原料相比，甲醇具有更高还原性，可作为碳

源生产包括长链醇、有机酸和碳氢化合物在内的

高附加值的化学物质

［6-7］

。

自然界中存在大量以甲醇为碳源的甲基营养

型微生物，其独特的代谢机制使得它们能够以甲

醇为唯一碳源和能源合成细胞生长需要的物质和

能量

［8-9］

。目前，自然界发现的利用甲醇的甲基营

养型微生物主要包括甲基细菌和酵母菌，这些甲

基微生物可以利用不同类型的甲醇脱氢酶

methanoldehydrogenases，Mdhs），包括吡咯喹啉

醌（pyrroloquinolinequinone，PQQ）依赖的

Mdhs

［10］

、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖的

Mdhs

［11］

、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的醇

氧化酶（Aods）

［12］

。尽管利用天然甲基营养型细菌

将甲醇转化成甲羟戊酸

［13-14］

、3-羟基丙酸

［15］

和蛇

麻烯

［16］

等化学产品的研究已经取得一些进展，但

由于存在遗传背景不完全清楚、遗传工具相对较

少以及甲醇利用率偏低等局限，制约了天然甲基

营养型细菌的广泛应用发展

［17-18］

。近年来，以遗传

操作与工程化改造更为便捷的模式底盘微生物为

基础，将其代谢网络重塑为能以甲醇作为碳源合

成高附加值化学品的合成甲基营养细胞工厂成为

重要发展方向。现有的研究一般利用模式底盘微

生物（大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母

等），通过引入天然甲基营养型微生物的甲醇同化

途径

［19］

，包括丝氨酸循环途径（serinecycle）、核

酮糖单磷酸途径（ribulosemonophosphatecycle，

RuMP）、木酮糖单磷酸途径（xylulose

monophosphatecycle，XuMP）或核酮糖二磷酸途

径（ribulosebisphosphatecycle，RuBP）构建合成

甲基营养细胞工厂，其中存在于天然甲基营养型

微生物中的RuMP能够通过3-己酮糖-6-磷酸合成

酶（3-hexulose-6-phosphatesynthase，Hps）直接

将甲醇氧化产物甲醛与核酮糖-5-磷酸（Ru5P）缩

合生成己酮糖-6-磷酸（H6P），该过程可更高效利

用辅因子及能量，被认为是十分有效的有机碳一

同化途径

［20］

。本文系统综述了合成甲基营养细胞

工厂的关键生物元件、核酮糖单磷酸途径

（RuMP）构建与甲醇同化途径设计优化的研究现

状，进而结合合成甲基营养细胞工厂面临的机遇

和挑战，对未来的研究方向进行展望。

1合成甲基营养细胞工厂中甲醇氧化、

同化基因及其调控元件

合成甲基营养细胞工厂中氧化甲醇的第一步

反应，一般选用来源于革兰氏阳性天然甲基营养

菌且NAD为辅助因子的Mdhs。主要原因是NAD

依赖的Mdhs在好氧和厌氧条件下都能将甲醇脱氢

产生电子，用于生成代谢产物

［21］

。然而，该类

Mdhs催化甲醇活性偏低是合成甲基营养细胞工厂

构建的一个重大瓶颈

［22-24］

，亟需开发更加高效的

Mdhs。Witthoff等

［25］

首先在谷氨酸棒状杆菌中构

建了RuMP途径，发现异源表达来源于甲醇芽孢杆

菌（Bacillusmethanolicus）的Mdh和内源激活蛋

白（endogenousactivatorprotein，Act）效果最佳。

在大肠杆菌中，Müller等

［26］

发现了来自甲醇芽孢

杆菌（olicus）的Mdh2最有效。随后，

Wu等

［27］

首次发现源于非甲基营养菌的钩虫贪铜

菌（CupriavidusnecatorN-1）中的Mdh2在大肠杆

菌中具有催化活性，并且通过酶定向性进化

Mdh2，使其对甲醇催化效率提高6倍。Whitaker

等

［22］

也发现非甲基营养的嗜热脂肪芽孢杆菌（B.

stearothermophilus）中的Mdh在大肠杆菌中具有一

定催化活性，其氧化甲醇的K

m

值较低，更加有利

于甲醇氧化。最近，为了解决Mdhs催化效率低的

问题，Roth等

［28］

用甲醛传感器开发噬菌体辅助非

连续进化（PANCE）方法，对来自甲醇芽孢杆菌

的Mdh2

进行进化，使其催化活性提高

3.5倍，为

Mdhs进一步改造提供了理论基础。甲醇氧化生成

的甲醛，可以被RuMP途径中的Hps和6-磷酸-3-己

酮糖异构酶（Phi）同化进入下游中心代谢。需要

注意的是，除了Mdh、Hps和Phi之外，近年来还

有研究报道通过计算并加以人工设计改造的酶，

如甲醛酶（Fls）

［29］

和乙醇醛合成酶（Gal）

［30］

构建

全新的代谢路径实现甲醛同化进入下游代谢。

研究者还发现通过蛋白组装策略构建的多酶

复合物，可以快速固定甲醛，显著提高甲醇利用

（

第2卷

225

效率。例如，Price等

［31］

利用无支架的蛋白自组装

策略，使用SH3配体的相互作用获得Mdh-Hps-Phi

的工程化超分子酶复合物，使得体外果糖-6-磷酸

（F6P）的产量提高了97倍，最终的甲醇体外消耗

速率提高了2.3倍。同样，Fan等

［32］

通过融合蛋白策

略，将嗜热脂肪芽孢杆菌（thermophilus）

来源的Mdh与甲醇芽孢杆菌（olicus

MGA3）来源的Hps和Phi进行融合表达，利用最

优柔性连接肽（GGGGS）

3

和（GGGGS）

6

连接Mdh、

Hps与Phi，形成的融合蛋白酶提高了甲醇氧化及

转化成F6P的效率。在Mdh-Hps-Phi多酶复合物的

级联反应中，通过酶复合物降低了酶分子的空间

距离，提高甲醛转化成F6P的代谢效率，强化了甲

醇消耗。

此外，在合成甲基营养细胞工厂中，甲醇被

Mdhs氧化产生甲醛，而甲醛对细胞具有毒性，

因此，甲醛诱导型启动子（P

frm

）对于细胞工厂的

构建十分重要。P

frm

是大肠杆菌中的天然启动子，

受FrmR蛋白的负反馈调控，只有在甲醛存在条

件下，FrmR才会优先与甲醛结合，从而解除对

启动子P

33-34］

frm

抑制，启动下游基因表达

［

。利用

这一特点，Rohlhill等构建了基于P

frm

诱导基因表

达盒（mdh-hps-phi）表达的质粒，避免了甲醛胞

内积累，实现了对mdh-hps-phi操纵子的动态

调控

［35］

。

2合成甲基营养细胞工厂中构建RuMP

同化甲醇

天然甲基营养细胞工厂中的RuMP主要包括三

个模块：包含Hps和Phi的甲醛固定模块；将F6P

转化成C

3

中间代谢物丙酮酸的转化模块；甲醛受

体Ru5P再生的碳重排模块，其中高效的甲醛受体

再生是甲醇同化的关键所在

［5，23，36］

。由于典型底

盘细胞工厂拥有完整的糖酵解途径和三羧酸循环

途径，在其中引入天然甲基营养型微生物RuMP关

键基因mdh、hps和phi，利用其代谢产生的中间产

物，并以糖基碳源作为辅助碳源，可以实现对甲

醇的氧化同化。目前的研究策略主要包括：增强

甲醛受体再生；共用糖基碳源结合实验室适应性

进化策略增强甲醇同化；合成甲基营养细胞工厂

中甲醛代谢和还原力动态调控。

2.1增强甲醛受体再生

合成甲基营养细胞工厂中甲醛受体Ru5P不足

是限制甲醇同化效率的关键原因，阻断F6P进入

氧化型磷酸戊糖途径的代谢流，提高非氧化戊糖

磷酸途径（non-oxidativepentosephosphate

pathway，PPP）相关基因的表达，是增强Ru5P

再生的一种策略。此外，异源表达编码果糖二磷

酸醛缩酶（Fba）和景天庚酮糖二磷酸酶（Glpx）

的基因（图1），并结合提高本源的6-磷酸果糖激

酶（Pfk）、转酮酶（Tkt）、核酮糖磷酸差向异构

酶（Rpe）和核糖磷酸异构酶（Rpi）的表达量，

是增强Ru5P再生的另一策略。基于这些策略，

Bennett等

［36-38］

在合成甲基营养细胞工厂构建时，

敲除编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi，阻断了

F6P进入氧化型磷酸戊糖途径的代谢流，并过表

达甲醇芽孢杆菌中编码五种酶（Pfk，Fba，Glpx，

Rpe和Tkt）的基因，强化了Ru5P的前体物供给，

从而显著改善了甲醇在大肠杆菌中的同化效率。

同样，Woolston等

［23］

过表达编码Glpx的基因，

并利用小分子抑制剂（碘乙酸盐）减少糖酵解途

径代谢流量，同样提高了甲醇同化进入大肠杆菌

中心碳代谢的效率。最近，

Rohlhill等

［39］

利用甲

醛诱导启动子P

frm

过表达pfk、fba、glpx、rpe和

tkt，实现动态调控Ru5P再生，促进甲醇同化

过程。

2.2共用糖基碳源结合实验室适应性进化策略强化

甲醇同化

由于在合成甲基营养细胞工厂中引入RuMP

途径的代谢通量偏少，目前研究者普遍以添加糖

基碳源结合实验室适应性进化（adaptive

laboratoryevolution，ALE）策略构建甲醇利用的

合成甲基营养细胞工厂

［40］

。其中，共用的糖基碳

源被用于生成Ru5P，而甲醇主要提供合成甲基细

胞中心代谢所需的碳源。因此，根据不同共用糖

基碳源的代谢途径，计算模拟设计出不同的营养

缺陷菌株，进而结合ALE策略以增强合成甲基营

226

合成生物学第2卷

图1基于共用糖基碳源的合成甲基营养细胞工厂构建的代谢途径

［36-38，41-45］

（蓝色指示代表RuMP途径；橘色，紫色和灰色号分别指示在合成甲基营养细胞工厂构建中敲除edd、rpi和maldh

，

并以葡萄糖酸为共用糖

基的代谢途径，敲除edd、rpi和pgi并以葡萄糖为共用糖基的代谢途径以及敲除rpi以木糖为共用糖基的代谢途径；绿色指示代表异源表达

glpx和fba的基因；红色指示代表亮氨酸响应调控蛋白的调控，其中“+”代表激活途径，“－”代表抑制途径）

Fig.1Theconstructionofthesyntheticmethylotrophiccellfactorybasedonthesugarastheco-substrate

[36-38,41-45]

[ThebluerepresentstheRumppathway;theorange,purpleandgrayrepresentthemetabolicpathwayofknockingoutgenes(edd,rpiand

maldh)basedonthegluconateastheco-substrate,knockingoutgenes(edd,rpiandpgi)usingglucoseasthetheco-substrate,knocking

outthegenerpibasedonthexyloseastheco-substrate,respectively;thegreenrepresentstheheterologousexpressionofgenesglpxand

representstheregulationofleucine-responsiveprotein,inwhich"+"representstheactivationpathwayand"－"represents

theinhibitionpathway]

养细胞工厂利用甲醇的代谢通量。Meyer等

［41］

首

先基于模拟代谢网络分析，发现在大肠杆菌底盘

中敲除编码磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因edd和编

码核糖磷酸异构酶的基因rpi（图1）且引入甲醇

同化途径，以葡萄糖酸为共用糖基碳源，并加入

0.1g/L酵母粉和20mmol/L丙酮酸作为辅助碳源，

通过传代培养初次获得依赖甲醇生长的进化菌株

MeSV1.1。随后，通过敲除进化菌株MeSV1.1编

码苹果酸脱氢酶的基因maldh以平衡胞内氧化还

原状态，进而获得更依赖甲醇生长的适应性进化菌

株MeSV2.1和MeSV2.2。而最终进化菌株MeSV2.2

在5mmol/L葡萄糖酸和500mmol/L甲醇作为碳源

的情况下，培养100h后OD

600

达到1.3，甲醇消耗速

率达到了（13±7）mmol/（g·h）（以CDW计），接近天

然的甲基营养菌。Bennett等

［42］

以葡萄糖为共用

糖基碳源，使进化的大肠杆菌获得甲醇依赖性生

长的特性，进化菌株的比生长速率可以达到

0.15h

－1

。Chen等

［43］

以木糖为共用糖基碳源时，

第2卷

227

通过ALE实验，进化菌株能够以等摩尔比消耗甲

醇和木糖，获得0.17h

－1

的比生长速率。

Tuyishime等

［44］

以木糖为甲醇依赖生长工程菌的

辅助糖基碳源，最终在谷氨酸棒杆菌进化菌株

MX-11中实现部分利用甲醇合成谷氨酸。此外，

有研究者发现某些氨基酸（如苏氨酸）作为甲醇

的共同利用底物，可以明显提高甲醇利用效率，

而且激活氨基酸的代谢途径（即敲除亮氨酸响应

调控蛋白Lrp），也可以提高合成甲基营养细胞工

［45］

厂同化甲醇效率（图1）

。除此之外，表1

［46］

实验室适应性进化的结果如表2所示，进化

菌株突变基因的基本特点是降低了利用共用糖基

碳源的相关酶催化活性，从而实现降低本源的碳

代谢途径和能量代谢途径（如糖酵解途径、

Entner-Doudoroff途径和TCA循环）的代谢流，

以维持胞内碳代谢流和氧化还原的平衡状态。值

得注意的是Liao课题组近期研究结果也发现甲醛

脱毒途径相关基因的突变，即进化菌株

CFC526.16编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因发生

SNP突变，调低了Entner-Doudoroff途径代谢通

量，从而实现RuMP途径、糖酵解途径和磷酸戊

糖途径的代谢平衡。此外，该研究还发现在进化

过程中存在插入序列介导的基因组上基因拷贝数

动态变化现象，一段富含甲醇同化途径和糖异生

途径所需基因的DNA大片段（约70kb）随着细

胞进化代数增加而相应增加片段拷贝数，这一动

态变化是与进化菌株的高效甲醇同化代谢过程相

一致的

［24］

。

总结了目前合成甲基营养细胞工厂构建中，共用

糖基碳源增强甲醇同化的研究进展。不同于上述

工作，Liao课题组2020年最新研究报道利用代谢

途径理性设计与适应性进化策略，首次实现大肠

杆菌底盘中构建的合成甲基营养细胞工厂能够以

甲醇作为唯一碳源和能源进行生长，最终获得的

进化菌株倍增时间8.5h，进化菌株SM1在72h内

生物量OD

600

值达到2

［24］

。

表1

Tab.1

碳源

甲醇和酵

母抽提物

大肠杆菌

大肠杆菌

宿主

大肠杆菌

共用糖基碳源增强甲醇同化

Enhancementofmethanolassimilationbasedonthesugarastheco-substrate

甲醇同化进展

39%三羧酸循环中间产物和53%糖酵解中间产物被

13

C甲醇标记，实现

柚皮素合成

增强核酮糖-5-磷酸再生和甲醇同化，增加3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式

丙酮酸的

13

C甲醇标记量

P

frm

控制动态调控酶的活性，增加大肠杆菌在甲醇中的生长速率

甲醇消耗速率为1.7mmol/(L·h)

增加甲醇进入中间代谢物的碳通量

[39]

[38]

文献

[22]

Mdh、Hps和Phi来源

嗜热脂肪芽孢杆菌，甲醇芽

孢杆菌，甲醇芽孢杆菌

嗜热脂肪芽孢杆菌，甲醇芽

孢杆菌，甲醇芽孢杆菌

嗜热脂肪芽孢杆菌，甲醇芽

孢杆菌，甲醇芽孢杆菌

甲醇和

葡萄糖

谷氨酸棒

状杆菌

大肠杆菌

甲醇芽孢杆菌，枯草芽孢杆

菌，枯草芽孢杆菌

嗜热脂肪芽孢杆菌，甲醇芽

孢杆菌，甲醇芽孢杆菌

[25]

[38]

甲醇和葡

萄糖酸盐

甲醇和

木糖

大肠杆菌

甲醇芽孢杆菌，甲基鞭毛杆

菌，甲基鞭毛杆菌

通过实验室适应性进化，24%甲醇进入中心碳代谢，甲醇可作为主要生

长碳源

通过实验室适应性进化，甲醇和木糖大约以11的摩尔比共同消耗，进

∶

化菌株的生长速率为（0.17±0.006）h

－1

，并利用甲醇生产乙醇和丁醇

进化的Mdh2突变体最大反应速度增加3.5倍，甲醇进入突变菌株中心

代谢物的碳通量是未突变菌株的2倍

高达63%的

13

C甲醇进入细胞内代谢物

[41]

大肠杆菌

大肠杆菌

谷氨酸棒

状杆菌

钩虫贪铜菌，甲醇芽孢杆菌，

甲基鞭毛杆菌

甲醇芽孢杆菌，甲醇芽孢杆

菌，甲醇芽孢杆菌

嗜热脂肪芽孢杆菌，甲醇芽

孢杆菌，甲醇芽孢杆菌

甲醇芽孢杆菌，甲醇芽孢杆

菌，甲醇芽孢杆菌

甲醇芽孢杆菌，枯草芽孢杆

菌，枯草芽孢杆菌

[43]

[28]

[44]

甲醇和

核糖

大肠杆菌

谷氨酸棒

状杆菌

40%的甲醇进入中心碳代谢途径

25%的

13

C标记出现在糖酵解和磷酸戊糖途径中间代谢物

[26]

[46]

228

合成生物学第2卷

表2

Tab.2

宿主

大肠杆菌

甲醇依赖菌株通过ALE获得的有利突变

Summaryofmutationsobtainedbyadaptivelaboratoryevolutioninsyntheticmethanol-dependentstrains

基因功能

谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶

甲酸脱氢酶

柠檬酸合成酶

编码Hpr的蛋白酶

磷酸葡萄糖异构酶

DNA结合转录抑制子

谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶

DNA结合转录抑制子/烟酰胺单核苷酸腺

苷转移酶

组成磷酸转移酶系统的酶I

异柠檬酸脱氢酶

6-磷酸葡萄糖脱氢酶

丙酮酸激酶I

腺苷酸环化酶

嘌呤核苷磷酸化酶

甲醛脱毒操纵子，外膜蛋白

碳水化合物代谢的多功能调节子

邻乙酰高丝氨酸巯基化酶

参与细胞形态、抗生素易感性、渗透保护

在内的基因功能的多重调控子

预测的ATP激酶，细胞色素C氧化酶亚基

蛋白酶

基因突变类型

移码突变

移码突变

转座子插入

转座子插入

基因内缺失

碱基置换

移码突变

碱基置换

基因内缺失

基因内缺失

碱基置换

基因内插入

基因内插入

基因内插入

基因间缺失

碱基置换

碱基置换

碱基置换

碱基置换

依赖甲醇生长的预测功能

提供额外的NADH

促进甲醛氧化为CO

2

，

提供额外的NADH

促进甲酸氧化为CO

2

，

降低三羧酸循环的碳通量，插入转座子元件

破坏磷酸糖转移酶系统，插入转座子元件

提高磷酸葡萄糖异构酶酶活，增加细胞生长

所需的NADPH

改变葡萄糖酸摄取量

失活甲醛氧化途径，甲醛用于同化途径

改变NAD

+

/NADH比值

降低葡萄糖消耗速率

降低三羧酸循环的碳通量，以维持细胞氧化

还原平衡

调低Entner-Doudoroff途径通量

调低糖酵解途径通量

降低三羧酸循环相关酶的转录水平，改变

NAD

+

/NADH比值

提供甲醛固定受体

增加细胞内甲醛浓度

提高醇脱氢酶和木糖激酶的催化活性以强化

[44]

甲醇和木糖的利用效率

提高宿主对甲醇的耐受性

参与

通过调节类谷氧还蛋白和NAD

+

合成酶，

维持细胞内氧化还原状态

改变能量代谢

[43]

[42]

[41]

文献

[24]

基因名称

frmA

fdoG

gltA

ptsH

pgi

大肠杆菌

gntR

frmA

nadR

大肠杆菌

ptsI

icd

大肠杆菌

zwf

pykF

cyaA

deoD

frmAB,yaiO

谷氨酸棒

状杆菌

atlR

metY

mtrA

cgl2030,

ctaE

2.3合成甲基营养细胞工厂中甲醛代谢和还原力动

态调控

源下，生长不需要完整的TCA循环，进而将TCA

循环中依赖于NADH的苹果酸脱氢酶（Maldh）

的基因敲除，以增加进化菌株对甲醇的依赖性。

同样，Rohlhill等

［39］

也将干扰甲醛代谢的基因

maldh敲除，并使用甲醛诱导型启动子P

frm

调控磷

酸戊糖途径的rpe和tkt基因表达。除此之外，为

了克服NADH积累，驱动甲醇氧化，Price等

［31］

利用蛋白质工程手段改造RuMP关键酶活性时，

使用大肠杆菌来源的乳酸脱氢酶（Ldh）催化丙

酮酸，从而循环再生NAD

+

（图2）以促进甲醇转

化。在合成甲基营养细胞工厂构建中，多余的

NADH通过转化酶再生为NADPH，从而有利于

生产赖氨酸

［47］

和1，3-丙二醇

［48］

等高消耗NADPH

的化学品。

在合成甲基营养细胞工厂构建中，引入异源

Mdhs不仅生成甲醛，还会伴随还原力（还原性

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH）的产生。从热

力学角度分析，NADH的积累会增加催化反应的

吉布斯自由能，不利于合成甲基营养细胞工厂氧

化甲醇的第一步反应。在以糖基作为碳源生长

时，TCA循环同样也产生NADH，而天然甲基营

养型细菌普遍缺少完整的TCA循环，这就有利于

NADH平衡，而且有研究证明较低代谢活性的

TCA有利于甲醇同化

［20］

。基于此，Keller等

［40］

在开展进化甲醇依赖菌株研究时，通过代谢流平

衡分析（FBA）证实在葡萄糖酸盐和甲醇的双碳

第2卷

229

图2细胞工厂内甲醛代谢和还原力的动态调控

Fig.2Dynamicregulationofformaldehydemetabolismand

reducingpowerinthecellfactory

3其他途径在合成甲基营养细胞工厂中

同化甲醇的应用

除了RuMP途径，还可以引入并改造丝氨酸循

环途径和XuMP途径构建合成甲基营养细胞工厂。

而且，有研究者通过计算设计出简化有机碳一同

化途径的新颖酶，通过人工合成甲醇利用途径以

实现甲醇的高效利用。

Liao课题组

［49］

首先在大肠杆菌中重构扭脱甲

基杆菌（Methylorubrumextorquens）的丝氨酸循环

途径，以木糖作为共底物碳源，实现1分子甲酸和

1分子碳酸氢盐生成1分子乙酰辅酶A，该过程消

耗3分子ATP和1分子NADH。最近，Bar-Even课

题组

［50］

构建的高丝氨酸循环途径是依赖于大肠杆

菌本源丝氨酸醛缩酶（serinealdolase，SAL）和

4-羟基-2-氧代丁酸酯醛缩酶（4-hydroxy-2-

oxobutanoatealdolase，HAL）的两个混杂甲醛醛

缩醛酶反应，该途径只消耗1分子ATP生成乙酰辅

酶A，其效率优于改良的丝氨酸循环。在XuMP途

径重构的研究中，姜岷教授课题组初次在酿酒酵

母细胞基因组上整合毕赤酵母甲醇代谢途径，实

现酿酒酵母同化甲醇以增加生物量

［51］

。

Bogorad等

［52］

将非氧化糖酵解（NOG）与

RuMP途径相结合，将甲醇转化为乙酰辅酶A，形

成了一种不依赖ATP的非氧化糖酵解甲醇缩合途

径（MCC）。基于计算设计的甲醛酶（Fls）途径、

合成乙酰辅酶A（SACA）途径和2-羟酰基辅酶A

裂解酶（Hacl）途径都是能够代谢甲醛的线性途

径，是甲醇同化的可行性选择

［29，30，53］

。其中，合

成SACA途径是现有途径最短、ATP非依赖和氧气

不敏感的甲醇同化途径，可获得体外50%的甲醇

同化效率

［30］

。最近，中国科学院天津工业生物技

术研究所的马延和研究员课题组通过计算筛选出

苯甲酰甲酸酯脱羧酶（Gals）和转醛缩酶

（TalB

F178Y

）两种工程酶进行人工反应，构建了新的

体外C

1

同化途径（乙醇醛同化途径），优化该途径

使其碳效率达到88%

［54］

。

总之，计算设计获得新颖途径能力的不断增

强，可以加快碳同化效率，减少能量消耗，为高

效同化甲醇合成甲基营养细胞工厂的工程化改造

提供新思路。

4合成甲基营养细胞工厂面临的挑战及

未来展望

合成甲基营养细胞工厂的构建，是基于天然

甲基营养型微生物，借鉴其转化和利用甲醇的代

谢机制，利用工程化方法改造底盘细胞，从而构

建甲醇依赖型合成甲基营养菌株。由于模式底盘

细胞的遗传背景清晰、遗传操作工具丰富、可工

程化利用的生物元件成熟，蛋白质工程改造和代

谢产物生物传感器的不断发展，为合成甲基营养

细胞工厂的创制提供了基础保障

［55-56］

。

最近Liao课题组突破性获得以甲醇作为唯一

碳源和能源生长的大肠杆菌进化菌株

［24］

，为深入

研究合成甲基营养细胞工厂起到重要的推动作用。

不过相比于天然甲基微生物倍增时间为3～4h，合

成甲基细胞工厂生长效力还显著偏低

［24］

，如何进

一步提高其生长速率和生物量得率，以实现合成

甲基细胞工厂高效催化甲醇转化成高附加值化学

产品仍是研究焦点。目前以甲醇为唯一碳源和能

源的合成甲基营养菌株构建面临着巨大挑战，存

在三大主要问题亟需解决。第一，甲醇和甲醛等

物质对细胞的毒性问题

［57］

。即使是天然甲基微生

物，对有机醇类的耐受也有一定局限

［14，58-60］

。谷氨

酸棒状杆菌和大肠杆菌等非甲基细菌对甲醇耐受

性更低，为了解决这个问题，一方面，可以从甲

醇依赖的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌的ALE实验

230

合成生物学第2卷

中获得相关基因的突变位点，开展甲醇耐受的组

合突变改造；另一方面，可以利用全基因组规模

CRISPRi技术开发的高通量基因型和表型关联方法

对菌体的耐受机制展开研究，获得提升耐受性的

关键功能基因位点

［61-62］

，此外也可以借鉴其他有机

醇的耐受机制加以改造

［59］

。第二，甲醛和甲醛受

体的合理匹配问题。胞内甲醛不足导致RuMP途径

同化效率低的问题，可通过蛋白质设计策略和甲

醇生物传感器辅助PANCE的高通量筛选更高效异

源Mdhs来解决

［28］

，而针对甲醛过量积累导致的细

胞毒性，可以设计甲醛生物传感器动态调控甲醛

合成与同化的代谢过程。而解决甲醛受体再生问

题，主要通过精细表达异源RuMP相关基因，或挖

掘RuMP潜在局部转录调控子从转录层面进行系统

优化调控

［19］

。第三，理性设计结合ALE，驱动

RuMP代谢流合理分配及向下游代谢途径转化。其

中，通过增加前体物的含量、敲除旁支途径使得

RuMP代谢流在甲醇的选择压力下向下游代谢模块

途径拖拽。最近以CO

2

为碳源的自养型大肠杆

菌

［63］

和酵母菌

［64］

的研究充分证实理性设计和

ALE相结合进行微生物代谢重塑的可行性。

然而，由于ALE自发突变率很低，需要通过

长期连续传代培养以富集突变。近年来，包括

CRISPRi

［61］

、CRISPRa

［65］

、CREATE

［66］

在内的

CRISPR技术的迅速发展为在全基因组范围内定制

化设计基因型干扰和突变奠定了基础。在连续传

代方面，近几年，eVOLVER作为可定制的自动化

细胞培养的集成装置，根据用户需求提供自动化

培养生长的实验参数，可以实现快速重新配置以

适应几乎所有的自动化连续培养实验

［67］

。我们自

主研发的基于液滴微流控技术的高通量自动化微

生物连续培养系统（MMC）

［68］

，可实现稳定传代

100代，显著提升微生物适应性进化、耐受性表型

样本获取的效率。未来需要将基于CRISPR的全基

因组靶向基因编辑技术与高通量自动化ALE技术

结合起来，能够大幅度提升合成甲基营养细胞工

厂的构建效率，最终突破目前面临的构建以甲醇

为唯一碳源的人工合成甲基营养细胞工厂的“生

命暗物质”瓶颈，为发展基于高效合成甲基营养

细胞工厂的生物制造提供技术基础。

符号说明

3PG——3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate)

6PG

——

6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphogluconate)

AcCoA

——

乙酰辅酶A(acetyl-CoA)

DHAP

——

磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetonephosphate)

E4P

——

赤藓糖-4-磷酸(erythrose4-phosphate)

Edd

——

磷酸葡萄糖酸脱水酶(phosphogluconate

dehydratase)

F6P

——

果糖-6-磷酸(fructose6-phosphate)

Fba

——

果糖二磷酸醛缩酶(fructosebisphosphatealdolase)

G3P

——

3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde3-phosphate)

G6P

——

葡萄糖-6-磷酸

(glucose6-phosphate)

GlpX

——

景天庚酮糖二磷酸酶

(sedoheptulose

bisphosphatase)

GltA

——

柠檬酸合成酶(citratesynthase)

Gly

——

甘氨酸(glycine)

H6P

——

己酮糖-6-磷酸(hexulose6-phosphate)

Hps

——

3-己酮糖-6-磷酸合成酶(3-hexulose6-phosphate

synthase)

Mal

——

苹果酸(malate)

Maldh

——

苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)

Mdh

——

甲醇脱氢酶（methanoldehydrogenase）

NADH

——

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide

adeninedinucleotidehydride)

NADPH

——

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide

adeninedinucleotidephosphatehydride)

OAA

——

草酰乙酸(oxaloacetate)

PEP

——

磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate)

Pfk

——

磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)

Pgi

——

磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase)

Phi

——

6-磷酸-3-己酮糖异构酶(6-phospho3-

hexuloisomerase)

PYC

——

丙酮酸(pyruvate)

R5P

——

核糖-5-磷酸(ribose5-phosphate)

Rpe

——

核酮糖磷酸差向异构酶(ribulosephosphate

epimerase)

Rpi

——

核糖磷酸异构酶(ribosephosphateisomerase)

Ru5P

——

核酮糖-5-磷酸(ribulose5-phosphate)

S7P

——

景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose7-phosphate)

Ser

——

丝氨酸(serine)

Tal

——

转醛酶(transaldolase)

Thr

——

苏氨酸threonine)

Tkt

——

转酮酶(transketolase)

Xu5P

——

木酮糖-5-磷酸(xylulose5-phosphate)

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technologyandBioengineering,2020,117(6):1724-1737.

通讯作者：杨松（1977─），男，博士，

教授。主要研究方向为代谢工程和系统

组学。

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通讯作者：邢新会（1963─），男，博

士，教授。主要研究方向为生物化工，合

成生物学，生物育种。

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第一作者：张卉（1996─），女，在读

硕士。主要研究方向为微生物代谢工程。

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