2024年4月13日发(作者：)

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定

【实验目的】

1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。

2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。

【实验原理】

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、

而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，

破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS—蛋白质复合物的长度与其分子

量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁

移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，

使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电

泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与

SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量

远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳

迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可

求得未知物的分子量。

【实验材料】

1.实验器材

微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器

（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。

2.实验试剂

⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；

让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；

让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。

⑶ 10% (w/v) SDS: 取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。

⑷ 50% (v/v) 甘油: 取50ml 100%甘油，加入50ml蒸馏水。

⑸ 1% (w/v) 溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染

料。

⑹ A液--丙烯酰胺储备液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液

100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直

至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4℃存放数月。

⑺ B液--4×分离胶缓冲液：取75ml 2mol/L Tris-HCl (pH8.8)，加入4ml 10% SDS, 加21ml蒸馏水，

混匀，可在4℃存放数月。

⑻ C液--4×浓缩胶缓冲液:取50ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入4ml 10% SDS, 加46ml蒸馏水，

混匀，可在4℃存放数月。

⑼ 10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4℃存放数月。

⑽ 电泳缓冲液：取3g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，加蒸馏水至1L, pH约为8.3, 也可配制成10×

的储备液，在室温下长期保存。

⑾ 5×样品缓冲液：取0.6ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-

巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

⑿ 考马斯亮蓝染液：1.0g 考马斯亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即

成。

⒀ 考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。

【实验操作】

1.灌制分离胶

⑴ 组装凝胶模具: 可按照使用说明书装配好灌胶用的模具。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，

在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触，有细微的不匹配就

会导致凝胶的渗漏。

⑵ 将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神经毒素，操作时必

须戴手套。加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会

聚合，操作要迅速。小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。

⑶ 当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约

0.5cm)，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1mm～5mm的水层，这使凝胶表面变得平整。当凝胶聚合后，

在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面。

2.灌制浓缩胶

⑴ 吸尽覆盖在分离胶上的水后将A液、C液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合。加入过硫酸铵

和TEMED，并轻轻搅拌使其混匀。

⑵ 将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶

内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插

入可以减少气泡的产生。

⑶ 凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。将凝胶放入电泳槽内，如果使用Bio-Rad的

微型凝胶系统，可预先接好电极。将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲

液中。

3.制备样品和上样

⑴ 将蛋白质样品与5x样品缓冲液(20μl+5μl)在一个Eppendorf管中混合。100℃加热2 min～10min。

离心1s，如果有大量蛋白质碎片则应延长离心时间。

⑵ 用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部，并随着染料水平的升高

而升高注射器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。

4.电泳

⑴ 将电极插头与适当的电极相接。电流流向阳极。将电压调至200V（保持恒压；对于两块0.75mm

的胶来说，电流开始时为100mA，在电泳结束时应为60mA；对于两块1.5mm的胶来说，开始时应为

110mA，结束时应为80mA。）。

⑵ 对于两块0.75mm的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需30～40分钟(1.5mm的凝胶则需

40 min～50min)。关闭电源,从电极上拔掉电极插头,取出凝胶玻璃板,小心移动两玻璃板之间的隔片，将

其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。

5.考马斯亮蓝染色

这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1μg的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度

来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。

⑴ 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝(20ml已经

足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。

⑵ 对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5分钟~l0分钟，对于1.5mm的凝胶，则需10分钟～

20分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴

手套以避免将双手染色。

⑶ 加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用

过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。

6.干胶

⑴ 用一张l0cm×l2cm的Whatman 3MM滤纸覆盖凝胶，用一张玻璃纸或塑料保鲜膜覆盖在凝胶的

另一个表面，小心不要将气泡裹进去，这样会导致凝胶的破裂。可用一个试管作为卷轴推赶，可以有