2023年7月9日发(作者：)

贵阳医学院2012届博士研究生论文

英文缩略词表 -------------------------------------------------------------77

论文独创性声明 --------------------------------------------------------- 78

附：综 述--------------------------------------------------------------------79

1 贵阳医学院2012届博士研究生论文

家蝇（Musca domestica）抗真菌肽MAF-1基因的克隆、表达

及其时空表达模式研究

专 业：病理学与病理生理学

博士生：付 萍

导 师：吴建伟 教授

摘要

目的：1、克隆家蝇抗真菌肽MAF-1（Musca domestica antifungal peptide

-1）的cDNA序列，推导MAF-1的全长氨基酸序列，并进行生物信息学分析。2、构建MAF-1的表达体系并检测表达产物的抗真菌活性。3、初步揭示MAF-1基因在家蝇内的时空表达模式。方法：1、根据已知MAF-1的N端氨基酸序列设计简并引物，提取家蝇3龄幼虫的总RNA，采用RACE技术分别克隆MAF-1的3’端和5’端cDNA序列，进而拼接得到MAF-1的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。2、根据所得MAF-1的cDNA序列设计引物，克隆MAF-1成熟肽部分的基因片段，用原核表达载体pET-28a(+)，构建原核重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21/DE感受态细胞中，将转化菌菌液用亲和层析柱纯化获得带His标签序列的重组MAF-1融合蛋白；用重组MAF-1融合蛋白制备大鼠多克隆抗体，进行Western Blotting鉴定；以白假丝酵母菌（ATCC10231）为指示菌检测表达产物的抗真菌活性。3、以GAPDH基因为内参基因，采用实时荧光定量PCR（Real Time

PCR）技术检测实验室驯化家蝇、野生家蝇生活史各发育阶段中MAF-1基因的表达差异，家蝇3龄幼虫脂肪体、唾液腺、肠道和体壁中MAF-1的表达差异，以及热诱导前后不同时间的家蝇3龄幼虫中MAF-1基因表达水平的变化。结果：1、MAF-1的编码cDNA序列全长537bp，翻译后为178个氨基酸残基组成的蛋白多肽。生物信息学分析结果显示，所得MAF-1蛋白序列具有一段信号肽，成熟肽部分的理论分子量为17184.2Da，等电点为5.37，与其实际检测的分子量17208.384Da，1 贵阳医学院2012届博士研究生论文

等电点4.96相近。同时，MAF-1是以α螺旋为主的线性蛋白，其序列中可能的一功能结构域位于第128至153位氨基酸残基处。另外，MAF-1序列中有2个蛋白激酶C磷酸化位点 (Protein kinase C phosphorylation site)、1个N端酰基化位点(N-myristoylation site)，多个蛋白相互作用位点。模建的MAF-1的三维空间结构图为以α螺旋为主要二级结构的线性蛋白。2、成功构建MAF-1原核重组表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21/DE中，纯化得到带His标签序列的重组MAF-1融合蛋白；Western Blotting鉴定显示所得MAF-1融合蛋白具有免疫原性，可被用其制备的大鼠多克隆抗体识别；抗真菌活性检测结果显示，获得的重组MAF-1融合蛋白对白假丝酵母菌（ATCC10231）具有明显的抗真菌活性。3、MAF-1基因在家蝇内的时空表达模式研究结果显示，在实验室驯化家蝇及野生家蝇的卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹和雌雄蝇各生长阶段中，MAF-1基因均有不同程度的表达。其中，驯化家蝇中MAF-1基因在1龄幼虫和2龄幼虫内的表达最高，其次是3龄幼虫。蛹、雄蝇内的表达与卵期相近，雌蝇内MAF-1的表达较卵期有所下调。野生家蝇中MAF-1的表达在1龄、2龄、3龄幼虫内均比卵期增强，其次是在蛹、雌蝇内的表达，而在雄蝇和卵内的表达相对最低。家蝇3龄幼虫经热诱导后，MAF-1基因在其体内的表达均有所上调。在热诱导后12h，家蝇3龄幼虫内的MAF-1基因表达水平最高，在热诱导后48小时，表达水平趋近于诱导前的表达水平，但MAF-1基因的表达与诱导后时间的长短并未显现出线性关系。在家蝇3龄幼虫的各主要组织中，唾液腺和脂肪体中的MAF-1基因表达水平明显比体壁及肠道高。结论：1、家蝇独特的抗真菌肽MAF-1的cDNA全长序列为537bp，翻译后为178个氨基酸残基组成的蛋白多肽，是一全新的以α螺旋结构为主的线性昆虫抗真菌肽， GenBank的登录号为HM178948。 2、成功构建了能够表达具有体外抗真菌活性的重组MAF-1融合蛋白的大肠杆菌pET-28a(+)-MAF-1-BL21表达体系，证明了克隆的MAF-1cDNA序列及其生物信息学分析结果的正确性。3、初步揭示了MAF-1基因在家蝇体内的时空表达模式，推测MAF-1基因可能既是家蝇的免疫分子之一，也是家蝇幼虫发育有关的生理因子之一，并发现家蝇3龄幼虫的唾液腺可能在其免疫防御机制中具有重要作用。结果为进一步研究MAF-1的生物学活性、结构与功能关系等奠定了基础，同时也为MAF-1的获取提供了新的途径。

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关键词：家蝇；MAF-1；克隆；生物信息学；重组表达；时空表达

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前 言

目前，深部真菌感染正日益成为导致癌症放疗、化疗、器官移植患者以及艾滋病患者死亡的主要原因[1, 2]。在引起的人体深部真菌病中，念珠菌引起机体机会性感染病最为常见，在不同国家和地区的感染率达36%～63%，严重威胁着人类的健康[3, 4]。在医院内各种机会性致病真菌感染中，白假丝酵母菌所致的念珠菌病发病率居首位[5]。与此同时，现有治疗全身性真菌感染的药物较为有限，且药物本身存在各种毒副作用。此外，随着抗生素的广泛和不规范使用，耐药真菌的数量和种类正不断增加。临床应用的抗真菌药物具有的毒副作用和日益出现的大规模耐药现象，成为了人类必须面对的两个严重问题。治疗和预防真菌感染面临着巨大困难，寻求和研发新的安全有效的抗真菌感染药物成为迫切需要。

抗微生物肽是生物体抵御病原体感染的一类大量且多样的天然多肽，是生物体有效的内源性先天免疫因子[6]。自20世纪70年代瑞典科学家Boman等[7]从蚕蛹中分离天蚕素（cecropin）以来，人们陆续在昆虫、两栖类、水生动物、及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物中发现了1700余种抗微生物肽，并发现其是一类具有巨大发展潜力的能抵御病原微生物入侵的新型药物来源[8-10]。昆虫种类繁多，具有多种多样的形态、习性、行为和机能，其适应能力、分布范围都超过其它动物群。面对极为复杂艰难的生存环境，昆虫进化了高效的先天免疫系统，可以通过结构和生理屏障及多种功能的血细胞、体液因子的协同作用，对侵入体内的病原体及异物产生明显的免疫防御反应，抗微生物肽是这其中的关键组分，是昆虫抵御病原微生物入侵的第一道防线 [11]。昆虫的抗微生物肽种类多样，在不同的昆虫中所存在的这些功能多肽也有所不同[12,13]。就果蝇（Drosophila melanogaster）基因组研究表明，除了已发现的32个抗菌肽编码基因外，还存在大量的未知免疫相关基因，编码不同的抗菌肽参与昆虫的免疫防御[14]。迄今，人们已陆续从多种昆虫体内分离出100多种抗微生物肽，它们不但能抵抗病原微生物的侵袭，还具有抵抗部分寄生原虫以及抗肿瘤细胞的作用[15]。随着研究的深入，发现这些抗微生物肽不仅对病原微生物具有高效抗性，对人畜安全无毒且环保，在炎症及脓毒症中具有可应用性，并且还可调节真核生物的免疫功能[10,16,17]。因此，昆虫抗微生物肽的研究已成为国内外生物技术研发

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的热点之一，是目前功能多肽研究的一个重要领域，不但有利于扩大新的安全的防御病原生物侵入的药物开发来源，也有利于通过基因改良防止或阻断昆虫媒介传播性流行病的生物技术研究。

在众多昆虫之中，对蝇类的抗微生物肽的研究较多。1982年，日本东京大学的名取俊二教授首先从麻蝇幼虫中分离到两种抗菌蛋白[18]，之后，学者们逐渐开始认识到蝇类身上具有着高效的防御机制，至今已相继从果蝇、麻蝇、家蝇中分离到多种抗微生物肽。与较为广泛深入的抗细菌肽研究相比，抗真菌肽的研究报道较少。1993年，Iijima等[19]首次报道从麻蝇3龄幼虫血淋巴中分离出一种不需诱导产生，属于昆虫组成性蛋白的抗真菌肽AFP（antifungal peptide），由67个氨基酸残基组成，发现AFP在蒸馏水中有较强的抑杀白色念珠菌的作用，在盐溶液中次之，而在沙氏培养基中无作用，同时克隆了AFP的cDNA序列，分析其一级结构中富含甘氨酸和组氨酸。1994年，Fehlbaum等[20]用和等对果蝇进行诱导，从其血淋巴中分离到一种诱导型的抗真菌肽，并命名为Drosomysin，由44个氨基酸残基组成，对丝状真菌有强的抗性，而细菌和酵母真菌对其不敏感。之后，Yuan Y等[21]将Drosomcin基因转入大肠杆菌进行了表达研究，结果显示表达产物具有强的抗真菌作用。1995年，Levashina等[22]从果蝇中分离到一种新的由26个氨基酸残基组成，富含脯氨酸，既有抗革兰氏阳性菌活性，又有抗真菌活性的抗真菌肽metchnikowin。迄今为止，约从6种昆虫中分离获得7种抗真菌活性分子，其氨基酸数量均在100以下，对丝状真菌、酵母真菌都表现有强抑制作用，其中Metchnikowin、heliomicin、gallerimycin、tenecin Ⅲ 4种抗真菌肽还具有抑制细菌生长的双效抑菌效应[23,24]。Lamberty M

等[25]对Heliomicin基因进行了分析，发现其序列结构属于昆虫defensin家族，将其进行酵母内的重组表达，表达产物仍具有抑制细菌与真菌的作用。Hashimoto

K等[26]对gallerimycin基因进行了cDNA克隆和序列分析，发现其序列中存在某些细胞核因子结合位点的同源模序。Kim DH等[27]建立了tenecin Ⅲ的表达体系，可大量制备具有抗ns活性的重组tenecin Ⅲ。国内也有报道昆虫抗真菌肽基因的原核表达及在酵母中的表达，表达产物均具有抑制真菌生长的作用[28-30]。这些研究开辟了抗真菌生物制剂的新来源，为开展抗真菌肽的基因重组表达奠定了一定的理论和技术基础，为新型人用抗真菌抗生素或抗真菌农5 贵阳医学院2012届博士研究生论文

药带来了新希望和新思路。

家蝇（Musca domestica）属于双翅目、蝇科、家蝇属，孳生于杂菌丛生的环境中，传播疾病，是重要的媒介昆虫，其免疫防御机制日益引起研究者们的关注。许小霞、王婷婷、金小宝[31-33]等利用互联网生物信息库设计引物，从家蝇cDNA文库成功克隆出cecropin、attacin、defensin的同源分子，建立了表达系统。Jin[34]报道重组表达的家蝇cecropin除具有抗G+和G-细菌功能外，还具有一定的抗真菌活性。随着对家蝇自身抵御病原侵袭能力的深入研究发现，家蝇体内除含有其他昆虫中发现的某些抗微生物肽的同源分子，其本身还富含多种独特的具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤细胞以及杀灭弓形虫等活性的天然多肽[35-39]。目前，国内外学者仍多利用已有生物信息，探索和验证家蝇体内是否产生与已报道抗微生物肽类同的分子。本课题组则直接从免疫诱导后的家蝇幼虫血淋巴中，观察并分离系列独特的活性天然多肽。2002年，吴建伟教授[40]报道了经大肠杆菌诱导24h和48h后的家蝇3龄幼虫血淋巴具有抑制白假丝酵母菌生长的活性。之后，课题组一直致力于家蝇特有的抗细菌、抗真菌、抗病毒及抗肿瘤活性多肽的分离纯化和鉴定研究，并发现家蝇幼虫经免疫诱导后，含有的系列活性多肽存在组成性表达和诱导性表达两种表达形式[41-44]。在以白假丝酵母菌为指示菌，旨在分离纯化出家蝇幼虫血淋巴中特有的抗真菌活性肽的研究中，课题组应用固相萃取结合反向高效液相色谱技术，从家蝇3龄幼虫血淋巴中分离到一种全新的昆虫抗真菌肽，并命名为MAF-1（Musca domestica antifungal peptide -1），等电点呈酸性，分子量为17203.384Da，对白假丝酵母菌具有明显的抑杀作用，质谱鉴定表明其为一新的蛋白，采用Edman降解法测得其N端30个氨基酸序列，经Blast分析进一步提示其为一全新蛋白[45]。目前所研究发现的大多数抗菌肽或抗真菌肽多呈碱性、分子量小，MAF-1与其存在明显差别,是家蝇体内一种独特的活性多肽。进一步研究其结构特点、生物活性、在家蝇体内的表达规律、序列结构与功能的关系，以及与其他抗微生物肽的异同等，我们需要获知其全序列信息并进行生物信息学分析。

生物信息学是生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科，它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而揭示数据所蕴含的生物学意义。本研究拟根据MAF-1的N端30个氨基酸序列

设计引物，采用cDNA末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends,6 贵阳医学院2012届博士研究生论文

RACE）获得MAF-1的cDNA序列，进而获得MAF-1的全长氨基酸序列，利用生物信息学的分析方法，分析预测全长MAF-1的功能域、二级结构、功能位点及空间结构等。根据分析揭示的结果，构建MAF-1的重组表达系统，获得具有活性的重组蛋白，可对MAF-1的cDNA序列克隆及分析结果进行验证，并为进一步研究MAF-1蛋白的生物活性、结构与功能的关系以及代谢动力学等奠定基础，也为人工生产MAF-1蛋白创造条件。同时，本课题拟进一步研究这种在家蝇体内发现的全新抗真菌肽MAF-1基因在家蝇不同发育阶段及不同组织以及经诱导后不同时间的表达差异，将有利于探讨这一新基因在家蝇中的时空表达模式。一个基因的时空表达模式和其基因的功能紧密相关，它可以从某个侧面反映或者暗示出该基因可能的功能和作用[46]。探讨MAF-1基因在家蝇中的时空表达模式，将有助于阐明MAF-1在家蝇免疫防御体系中的功能以及可能存在的其他生理学作用。

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第一章 家蝇抗真菌肽MAF-1基因的cDNA克隆

及其生物信息学分析

随着大量生物实验的数据积累，形成了当前数以百计的生物信息数据库，其中，GenBank就包含了所有已知的核酸序列和蛋白质序列。目前，不少学者利用互联网生物信息库设计引物，克隆出家蝇体内的某些抗微生物肽的同源分子[31-33]。MAF-1是从家蝇内分离到的天然抗微生物肽，质谱鉴定提示其序列信息尚未收录到数据库中，是一全新的昆虫抗真菌肽[45]。以测得的MAF-1的N端氨基酸序列为基础，获悉其核酸序列及氨基酸序列，既可进一步研究其结构与功能的关系，亦可补充和丰富生物信息库的数据。cDNA末端快速扩增技术（Rapid

Amplification of cDNA Ends, RACE）是20世纪80年代在PCR技术基础上逐步成熟的一门技术，目前广泛运用于未知基因cDNA全长序列的钓取，与经典的文库筛选法克隆出全长相比，它不仅具有简捷快速的优势，而且还免去了文库构建的繁琐及接触同位素对人体的危害[47]。因此，我们根据MAF-1的N端序列设计简并引物，采用RACE技术克隆MAF-1的cDNA序列，进而得到MAF-1的全长氨基酸序列，同时，利用生物信息学的分析方法，对MAF-1蛋白序列的功能域、二级结构、功能位点等进行预测分析，以期为进一步研究MAF-1基因的结构、建立表达体系、探明调控机制以及结构与功能的关系奠定基础。

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1、材料

1.1 实验材料

1.1.1虫种

家蝇（Musca domestica）：实验室传代繁殖，幼虫饲养于麦麸中，成蝇以奶粉、白糖及清水为饲料，奶粉和白糖混合，清水另置，避免污染。饲养条件：温度25±1℃，相对湿度（RH）50%～60%，光照黑暗各12小时交替。

1.1.2菌株和质粒

大肠杆菌DH5α由中山大学引进, 由贵阳医学院病原生物学实验室常规保存。

1.2主要试剂及耗材

RNAiso Reagent (Total RNA提取试剂)、3’Full RACE Core Set Ver.2.0、5’-Full RACE Kit、Taq DNA Polymerase（TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd）。Tris、硼酸、EDTA、氯仿、异丙醇、无水乙醇（成都金山试剂公司）。固相RNase清纯剂（Surface RNase Erasol）(北京天恩泽基因科技有限公司)。

1.3主要仪器及设备

超净工作台（苏州净化设备有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；数显不锈钢电热培养箱（上海博讯实业）； PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；稳压稳流电泳仪（美国GE公司）；紫外分光光度计（美国GE公司）；Millipore 0.22μm0.45μm滤器（美国）；Milli－Q超纯水仪（法国Millipore

Pharmacia公司）；Allegra 64R 冷冻高速离心机（美国BECKMAN公司）；PB203-E型电子精密天平（上海梅特勒托利多仪器公司）；μ－Quant酶标分光光度仪（美国Bio－Tek公司）；超低温冰箱（日本三洋公司）；凝胶成像系统IQuant400（美国Amersham Pharmacia公司）；10μL、20μL、100μL、1000μL微量加样器（德国Eppendorf公司）。

2. 方法

2.1 引物的设计与合成

根据所测得的MAF-1的N端30个氨基酸序列（ESAPAPEVSGDAVFSAIQNGLKNLGNAFFW），设计用于3’RACE的两条简并引物W1、W2，由3’RACE试剂盒提供反转录引物及两条下游引物。再根据3’RACE所获得9 贵阳医学院2012届博士研究生论文

的3’cDNA序列设计用于5’RACE的引物。最后根据所得的结果设计用于MAF-1的RT-PCR的上下游引物。各引物序列见表1-1。

表1-1 MAF-1的cDNA克隆所用引物序列

Table 1-1. Primers for the cDNA Cloning of MAF-1.

Primer name

W1（3’RACE）

W2（3’RACE）

R1（5’RACE）

R2（5’RACE）

MF（RT-PCR）

MR（RT-PCR）

Primer sequences（5’-3’）

GCICCIGCICCIGARGTIAGYGGIGAYGCIGTITT

GGIGAYGCIGTITTYAGYGCIATICARAAYGG

GGTGGGCGGTCTTGAAGTCATT

GGCACCCTCAATCCAGACCTTC

ATGTCGAAATTGTTCTTCCTTGTTGGTC

GGCATGGGGCTTCATTTCCTTGGC

2.2 家蝇3龄幼虫总RNA的提取

取新鲜家蝇3龄幼虫约30mg于玻璃匀浆器中，加入Tritrol试剂

(Invitrogen)1mL，充分匀浆后转移至离心管中静置5min， 12 000g 4℃离心5 min,取上清并加入氯仿200µL，用力振荡后静置5min， 12 000g 4℃离心15 min，吸取无色上清液，并向上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀后静置10 min，12 000g 4℃离心10 min。弃上清，加入75%乙醇1mL清洗RNA沉淀，12 000g 4℃离心5 min后弃去乙醇。待沉淀充分干燥后加入50µLRNase-free水溶解，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，同时取适量总RNA测定其OD260、OD280。

2.3 MAF-1的3’RACE

2.3.1 反转录反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制10μL反应体系

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家蝇3龄幼虫总RNA 2.4 μL (1 μg)

3’RACE Adaptor（5μM） 1.0 μL

5×M-MLV Buffer 4.0 μL

dNTP Mixture(10mM each) 1.0 μL

RNase Inhibitor(40U/μL) 0.25μL

Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-) 0.25μL

RNase Free dH2O 3.1μL

总体积 10.0μL

放入PCR仪中，反应条件设置为：

42℃ 60min

70℃ 15min

2.3.2 Outer PCR反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制50μL反应体系：

反转录反应液 3.5μL

1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 6.5μL

W1(10μM) 2.0μL

3’RACE Outer Primer(10μM) 2.0μL

10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+ Free) 4.0μL

MgCl2 (25mM) 3.0μL

TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0.25μL

dH2O 28.75μL

总体积 50 μL

放入PCR仪中反应条件设置为：

11 贵阳医学院2012届博士研究生论文

94℃ 3min

94℃ 30sec

55℃ 30sec 20 Cycles

72℃ 1min

72℃ 10min

PCR反应结束后，取5μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。然后继续进行Inner PCR反应。

2.3.3 Inner PCR反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制50μL反应体系：

1st PCR产物 1.0μL

dNTP Mixture (2.5mM each) 8 .0μL

10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+ Free) 5.0 μL

MgCl2 (25mM) 5.0μL

TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0. 5μL

W2(10μM) 2.0μL

3’RACE Inner Primer(10μM) 2.0μL

dH2O 26.5μL

总体积 50 μL

放入PCR仪中反应条件设置为：

12 贵阳医学院2012届博士研究生论文

94℃ 3min

94℃ 30sec

55℃ 30sec 30 Cycles

72℃ 1min

72℃ 10min

扩增结束后取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。用胶回收试剂盒回收特异条带，连接TaKaRa pMDTM18-T载体，转化感受态细胞5α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆接种于LB培养基，过夜培养后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，将阳性质粒送大连宝生物公司测序。

2.4 MAF-1的5’RACE

2.4.1 去磷酸化处理

在1.0mL离心管中配制50μL反应体系：

家蝇3龄幼虫总RNA 3.5 μL (2 μg)

RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0 μL

10×Alkaline Phosphatase Buffer (MgCl2) 5.0μL

Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (16U/μl) 0.6μL

RNase Free dH2O 39.9μL

总体积 50 μL

50℃ 60 min

反应结束后向反应液中加入20μL的3 M CH3COONa（pH5.2），130μL的RNase Free dH2O后，充分混匀。再加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的离心管中，然后加入2μL的NA Carrier后均匀混合，再加入200μL异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min。13000g 4℃离心20min后弃上清，再加入500μL的70%冷乙醇漂洗，13000g 4℃13 贵阳医学院2012届博士研究生论文

离心5min，弃上清后干燥。然后用7μL的RNase Free DH2O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

2.4.2 “去帽子”反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制10μL“去帽子”反应液：

CIAP-treated RNA 7μL

RNase Inhibitor (40U/μL) 1μL

10×TAP Reaction Buffer 1μL

Tobacco Acid Pyrophosphatase (0.5U/μL) 1μL

总体积 10 μL

将反应液37℃反应60min，得到CIAP/TAP-treated RNA。

2.4.3 5’RACE Adaptor的连接

首先配制下列溶液

CIAP/TAP-treated RNA 5μL

5’RACE Adaptor (15μM) 1μL

RNase Free dH2O 4μL

65℃ 5 min

冰上放置 2 min

然后加入下列试剂

RNase Inhibitor (40U/μL) 1μL

5×RNA Ligation Buffer 8μL

40% PEG#6000 20μL

T4 RNA Ligase (40U/μL) 1μL

16℃ 60min

反应结束后向反应液中加入20μL的3M CH3COONa（pH5.2），140μL的Rnase Free dH2O后，充分混匀后，加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的离心管中，再加入200μL14 贵阳医学院2012届博士研究生论文

的氯仿，混匀后13000g室温离心5min后，再将上层水相转移至新的离心管中，加入2μL的NA Carrier均匀混合，再加入200μL的异丙醇，混匀后冰上冷却10min。13000g 4℃离心20min后弃上清，加入500μL的70%冷乙醇漂洗，13000g

4℃离心5min后弃上清干燥。最后，加入6μL的Rnase Free dH2O溶解沉淀，得到Ligated RNA。

2.4.4 反转录反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制10μL反应体系

Ligated RNA 6 μL

Random 9 mer (50 μM) 0.5 μL

5×M-MLV Buffer 2 μL

dNTP Mixture(10mM each) 1 μL

RNase Inhibitor(40U/μL) 0.25μL

Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-) 0.25μL

总体积 10.0μL

放入PCR仪中，反应条件设置为：

30℃ 10min

42℃ 60min

70℃ 15min

2.4.5 Outer PCR反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制50μL反应体系：

反转录反应液 2μL

1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 8μL

MgCl2 (25mM) 3μL

TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0.25μL

R1(10μM) 2.0μL

5’RACE Outer Primer(10μM) 2.0μL

dH2O 28.75μL

15 贵阳医学院2012届博士研究生论文

总体积 50 μL

放入PCR仪中反应条件设置为：

94℃ 3min

94℃ 30sec

55℃ 30sec 20 Cycles

72℃ 1min

72℃ 10min

PCR反应结束后，将PCR反应液继续进行Inner PCR反应。

2.4.6 Inner PCR反应

在0.2mL PCR薄壁管中配制50μL反应体系：

Outer PCR反应液 1μL

10×LA PCR Buffer Ⅱ((Mg2+ Free) 5μL

MgCl2 (25mM) 5μL

dNTP Mixture (2.5mM each) 8μL

TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0. 5μL

R2(10μM) 2μL

5’RACE Inner Primer(10μM) 2μL

dH2O 26.5μL

总体积 50 μL

放入PCR仪中反应条件设置为：

16 贵阳医学院2012届博士研究生论文

94℃ 3min

94℃ 30sec

55℃ 30sec 25 Cycles

72℃ 1min

72℃ 10min

扩增结束后取5µLPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。用胶回收试剂盒回收特异条带，连接TaKaRa pMDTM18-T载体，转化感受态细胞5α，进行蓝

斑筛选，挑取阳性克隆接种于LB培养基，过夜培养后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，将阳性质粒送大连宝生物公司测序。

2.5 MAF-1基因验证（RT-PCR）

在0.2mL PCR薄壁管中配制50μL反应体系：

家蝇3龄幼虫总RNA 1μL

PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL

2³1 Step Buffer 25μL

YW1 (20μM) 1μL

YW2 (20μM) 1μL

RNase Free dH2O 20μL

总体积 50 μL

放入PCR仪中反应条件设置为：

17 贵阳医学院2012届博士研究生论文

50℃ 30min

94℃ 2min

94℃ 30sec

60℃ 30sec 30 Cycles

72℃ 1min

扩增结束后取5µlPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。用胶回收试剂盒回收特异条带，连接TaKaRa pMDTM18-T载体，转化感受态细胞5α，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆接种于LB培养基，过夜培养后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，将阳性质粒送大连宝生物公司测序。

2.6 MAF-1基因核酸序列及其所编码氨基酸序列的生物信息学分析

扩增出的cDNA序列运用NCBI（）进行Blast分

析。用DNAman软件翻译出氨基酸序列，得到MAF-1全长氨基酸序列，预测其分子量和等电点等基本性质，并将序列用NCBI的blastp (protein-protein

BLAST)进行比对分析。利用生物信息学网站ExPASy (Expert Protein Analysis

System /)中的TMpred对MAF-1进行跨膜区分析，用SignalP 4.0 Server进行信号肽分析，用PSORT Ⅱ server 进行亚细胞定位分析，用SMART进行功能域的预测，用SOPMA进行二级结构的预测分析。利用PredictProtein分析MAF-1的功能位点。最后，利用ExPASy中的3D-pssm(Phyre

Version0.2)模建MAF-1的三维空间结构图。

3. 结果

3.1 家蝇3龄幼虫总RNA的提取及鉴定18 贵阳医学院2012届博士研究生论文

电泳检测所提家蝇3龄幼虫总RNA，可见28S和18S两个清晰条带，且18S与28S条带的亮度之比约2:1，表明所获得的总RNA无明显降解（图1-1）。总RNA的OD260/ OD280约为1.99。可见所提取的总RNA质量高，可用于下一步实验。

1:DL2000 DNA Marker. 2: 家蝇幼虫总RNA

1:DL2000 DNA Marker. 2: Total RNA extracted from housefly.

图1-1 家蝇幼虫总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析

Fig.1-1 Agarose gel extrophoresis of total RNA from housefly larvae.

3.2 MAF-1的3’RACE

家蝇3龄幼虫总RNA经RT-PCR反转录为cDNA后，经第一次PCR反应后，反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，无特异条带出现。将第一次PCR产物用特异引物W2进行第二次PCR反应后，反应产物经电泳检测可见600bp附近有明显特异性条带（图1-2），经测序得到568bp核苷酸序列。运用NCBI对该cDNA序列进行Blast分析,未找到同源序列，提示该基因为一全新序列，将其登录到GenBank，获得登录号HM178948。用DNAman软件翻译得到147个氨基酸序列，其中GDAVFSAMQNGLKNLGNAFF与MAF-1的N端氨基酸序列吻合（图1-3）。

19 贵阳医学院2012届博士研究生论文

M：50bp DNA Ladder Marker；1、2：第一次PCR产物；3、4：第二次PCR产物.

M：50bp DNA Ladder Marker；1、2:

The product of the outer PCR；

3、4:

The product of the inner PCR.

图1-2 MAF-1基因的3’RACE产物电泳图

Fig. 1-2 The result of 3’RACE for MAF-1.

20 贵阳医学院2012届博士研究生论文

GD-FF: 3’端cDNA翻译序列中与MAF-1 N端氨基酸序列的一致部分；TAA: 终止密码子.

GD-FF: The part which was consistent to the N-terminal amino acid sequence of MAF-1.

TAA: Termination codon.

图1-3 MAF-1的3’RACE所得cDNA序列及翻译后的氨基酸序列

Fig. 1-3 The partial cDNA and amino acids sequence of MAF-1 by 3’RACE.

3.3 MAF-1的5’RACE

家蝇3龄幼虫总RNA经RT-PCR反转录为cDNA后，经第一次PCR反应后，反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，无特异条带出现。将第一次PCR产物用特异引物W2进行第二次PCR反应后，反应产物经电泳检测可见250bp附近有明显特异性条带（图1-4），经测序得到139bp未知的5’端核苷酸序列，用DNAman软件翻译得到147个氨基酸序列，其中ESAPAPEVS与MAF-1的N端氨基酸序列吻合（图1-5）。

21 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1: DL2000 DNA Marker；2: 第二次PCR产物；3:

第一次PCR产物.

1: DL2000 DNA Marker；2: The product of the inner PCR；3: The product of the outer PCR.

图1-4 MAF-1基因的5’RACE产物电泳图

Fig. 1-4 The result of 5’RACE for MAF-1.

ES-VS: 序列中与MAF-1 N端氨基酸序列的一致部分; ATG: 起始密码子.

ES-VS: The part which was consistent to the N-terminal amino acid sequence of MAF-1;

ATG: Initiation codon.

图1-5 MAF-1的5’RACE所得cDNA序列及翻译后的氨基酸序列

Fig. 1-5 The partial cDNA and amino acids sequence of MAF-1 by 5’RACE.

22 贵阳医学院2012届博士研究生论文

3.4 MAF-1全长cDNA序列的拼接及RT-PCR

根据已知的MAF-1的N端氨基酸序列，将3’RACE和5’RACE所得的MAF-1的各部分cDNA序列进行拼接，得到具有一个完整开放阅读框（ORF）的cDNA序列（图1-6）。根据此序列设计特异引物MF、MR，以家蝇3龄幼虫总RNA为模板进行RT-PCR，扩增完整开放阅读框内的cDNA序列，扩增产物经电泳检测，在500bp附近有特异条带出现（图1-7），测序得到537bp的核苷酸序列，与拼接序列一致。

: MAF-1的cDNA序列翻译后与所测N端氨基酸序列一致部分;

ATG: 起始密码子; TAA: 终止密码子.

: The part which was consistent to the N-terminal amino acid sequence of MAF-1;

ATG: Initiation codon; TAA: Termination codon.

图1-6 MAF-1全长cDNA序列及翻译后氨基酸序列

Fig. 1-6 The cDNA and amino acids sequence of MAF-123 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1: DL2000 DNA Marker；2: PCR产物.

1: DL2000 DNA Marker；2: The product of PCR.

图1-7 MAF-1基因的RT-PCR

Fig. 1-7 The result of RT-PCR for MAF-1.

3.5 MAF-1基因核酸序列及其所编码氨基酸序列的生物信息学分析

3.5.1 MAF-1cDNA序列及其所编码氨基酸序列的比对分析

运用NCBI的Blastn在线分析工具对MAF-1的cDNA序列进行比对，未找到同源序列，提示该基因为一全新序列，将其登录到GenBank，获得登录号HM178948（图1-8）。运用DNAman分析软件分析MAF-1cDNA序列，识别序列的起始密码子和终止密码子，得到编码的氨基酸序列，将该序列运用NCBI的Blastp在线分析工具进行分析，均未找到同源序列。

图1-8 Blast 检索结果

Fig. 1-8 Blast result.

3.5.2 MAF-1蛋白的基本性质分析及其跨膜区、信号肽及亚细胞定位分析

用DNAman分析软件对MAF-1cDNA序列进行分析，结果显示其PolyA尾上游3024 贵阳医学院2012届博士研究生论文

个核苷酸处存在典型加尾信号AATAAA，序列包含一个537bp的完整开放阅读框（ORF），根据ORF推导的MAF-1蛋白由178个氨基酸残基组成（图1-6）。

运用ExPASy中的TMpred对MAF-1氨基酸序列进行跨膜区分析，结果表明，MAF-1蛋白序列的N端存在一跨膜螺旋区域，方向由膜外向膜内，跨膜区可能为第1至18位氨基酸（图1-9）。用SignalP4.0分析可见，MAF-1蛋白具有信号肽，且剪切位点可能位于第18与第19位氨基酸之间(图1-10)。结合前期实验所得MAF-1的N末端测序结果，确定MAF-1成熟肽由第23位至第178位氨基酸即156个氨基酸组成。用PSORT Ⅱ server进行亚细胞定位分析，推测MAF-1蛋白可能与细胞外或细胞质中的某类蛋白质相似，而MAF-1成熟肽可能与细胞核中的某类蛋白质相似。

图1-9 MAF-1蛋白的TMpred分析结果

Fig. 1-9 TMpred output for MAF-1.

25 贵阳医学院2012届博士研究生论文

图1-10 MAF-1蛋白的SignalP-4.0分析结果

Fig. 1-10 SignalP-4.0 output for MAF-1.

运用ExPASy中的ProtParam作蛋白质的基本性质分析，结果显示，包含178个氨基酸残基的MAF-1蛋白分子量约为19528.1Da，等电点约为6.20；而MAF-1成熟肽的理论分子量为17184.2Da，等电点为5.37，富含Lys(13.5%)、Ala（12.8%）、Glu（11.5%）、Leu（8.3%），且蛋白性质稳定。

3.5.3 MAF-1蛋白的二级结构分析

采用ExPASy的Smart数据库对MAF-1成熟肽进行结构域进行分析可知其功能结构域可能是第128位氨基酸和第153位氨基酸间的序列（图1-11），即KKFKE

TADKLIESAKQQLESLAKEMK。用ExPASy的SOPMA工具分析MAF-1蛋白序列的二级结构，结果显示（图1-12），MAF-1蛋白富含α螺旋，有3个α螺旋区，其功能结构域正好位于第3个α螺旋区。利用PredictProtein分析发现，MAF-1序列中有2个蛋白激酶C磷酸化位点 (Protein kinase C phosphorylation site)、1个N端酰基化位点(N-myristoylation site)（图1-13），并预测MAF-1为非球形蛋白（图1-14）,其序列中含有多个蛋白质相互作用位点(图1-15)。

26 贵阳医学院2012届博士研究生论文

图1-11 MAF-1结构域分析结果

Fig. 1-11 The domains prediction for MAF-1

图1-12 MAF-1二级结构预测结果

Fig. 1-12 The secondary structure prediction for MAF-1

图1-13 MAF-1模序查询结果

Fig. 1-13 The output of motif search for MAF-127 贵阳医学院2012届博士研究生论文

图1-14 MAF-1球形蛋白预测结果

Fig. 1-14

The GLOBE prediction of globularity for MAF-1

图1-15 MAF-1蛋白相互作用位点预测结果

Fig. 1-15 The predicted protein-protein interaction sites for MAF-1

3.5.4 MAF-1的三维结构预测

运用ExPASy中的3D-pssm(Phyre Version2.0)模建MAF-1的三维空间结构，结果显示，MAF-1呈富含α螺旋，结构中无二硫键，是一种线性蛋白，与PredictProtein的分析结果一致（图1-16）。

28 贵阳医学院2012届博士研究生论文

图1-16 MAF-1三维结构预测结果

Fig. 1-16

The tertiary structure prediction for MAF-1

4. 讨论

家蝇（Musca domestica）孳生环境复杂，其免疫防御机制日益引起研究者们的关注。研究发现，多种强效的抗微生物肽类物质在其免疫防御机制中发挥着重要作用[48]。已有学者利用生物信息学资源，从家蝇体内克隆得到了cecropin、attacin、defensin、diptericin等的同源分子[31-34,49-53]。但家蝇体内除外这些在其他昆虫中发现的抗菌肽的同源分子，其本身还富含多种独特的具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤细胞以及杀灭弓形虫等活性的肽类物质，目前尚未见从家蝇体内获得的特有新分子的克隆及其生物信息学研究报道[35-39]。发现和阐明这些新的抗微生物活性肽对研究家蝇特异的免疫防御机制具有重要意义。

本实验根据前期研究结果，采用RACE技术获得了家蝇3龄幼虫体内组成型的抗真菌肽MAF-1的cDNA序列及其编码的氨基酸序列，经Blast比对分析，进一步证实MAF-1与cecropin等抗菌肽并没有同源性，是一种全新的昆虫抗真菌肽。目前，研究者根据昆虫抗微生物肽结构和氨基酸的组成特点，将抗菌肽分为了几类，即线性α螺旋肽、具有二硫键的环状或末端开放的抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽及富含甘氨酸的抗菌肽等几类。其中，大多数线性α螺旋肽分子量小、碱性氨基酸含量明显高于酸性氨基酸，等电点呈碱性，常呈组成型表达[54]。MAF-1也是一种组成型表达的线性抗真菌肽，富含α螺旋，但分子量较大，酸性氨基酸与碱性氨基酸的含量均约占全序列的20％，等电点却呈酸性，结构中29 贵阳医学院2012届博士研究生论文

可能存在某些修饰。可见，在目前抗微生物肽的分类中，MAF-1并不完全符合现有分类的标准，应该是一类新的抗微生物肽。

用SignalP4.0分析获知MAF-1蛋白具有信号肽，其剪切位点可能位于第18与第19位氨基酸之间，这与Edman降解法测得的结果相差4个氨基酸残基。生物信息学是以数据库为载体，利用数学知识建立计算模型，以计算机为工具对实验生物学中获得的大量数据进行存储、处理、分析和检索，并以生物学知识对结果进行解释，揭示蕴藏在DNA和蛋白序列中的生物遗传本质。但是生物信息学分析的结果必须通过生物实验科学进一步验证。Edman降解法是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽的氨基末端进行分析，所得的结果准确率高。因此，在后续实验中，MAF-1蛋白的成熟肽N端应以Edman降解法测得的N端为准，即信号肽的剪切位点视为第22位与第23位氨基酸之间。经TMpred进行跨膜区分析，MAF-1的信号肽即是一跨膜螺旋区域，且跨膜方向是由膜外向膜内，而亚细胞定位分析提示MAF-1蛋白可能与细胞外或细胞质中的某类蛋白相似，而MAF-1成熟肽可能与细胞核中某类蛋白质相似。已有报道证明抗微生物肽可能存在细胞内作用靶点[55]。可见，MAF-1在作用机制上可能就存在细胞内的作用靶点。目前研究发现的大多数抗微生物肽是由细胞合成后分泌到胞外作为效应分子发挥其功能的，

MAF-1蛋白不仅结构上与它们存在明显差别，可能在功能及作用机制上也存在明显差异，这需要对生物信息学的分析结果进一步研究证明。

在对MAF-1蛋白序列的分析中，我们发现其第128位氨基酸残基至第153位氨基酸残基间可能存在一个功能结构域。该段功能域具有26个氨基酸残基，pI值呈碱性。整个序列中所具有的2个蛋白激酶C磷酸化位点就分布在功能域中或临近该功能域，多个蛋白结合位点却均分布在功能域外。蛋白激酶C磷酸化位点与蛋白功能的活化或失活密切相关，蛋白结合位点提示其可能与其他功能分子协同发挥有效免疫作用，支持抗菌肽的先天免疫具有多分子共同参与防御的机制的假设（抗菌肽间存在协同作用）[56]。已有研究表明，抗微生物肽之间存在协同作用，且这种协同作用可弥补单一抗微生物肽在机体内呈低浓度的不足[57]。我们有理由推断，在家蝇高效的免疫防御体系中，MAF-1也并不是独自发挥作用，它可能与其他的活性多肽或蛋白协同作战，这些多肽或蛋白通过与MAF-1的结合，增强或减弱MAF-1的生物学活性。有哪些蛋白或多肽可以与30 贵阳医学院2012届博士研究生论文

MAF-1结合进而对其生物学功能进行调控，这些问题的解决必将为深入研究家蝇抗菌多肽先天性免疫体系奠定基础。

分析所得的功能域有可能是MAF-1的主要功能区。如若我们通过基因克隆表达MAF-1的功能结构域，并证实其生物学活性，将大分子的抗真菌肽改造为保留主要功能区的小分子多肽，势必有望为改造筛选新的可用于临床的高效低毒抗真菌药物提供新的选择及科学依据。因此，我们将根据研究所得新型抗真菌肽MAF-1的cDNA序列及生物信息学分析结果，在后续工作中建立MAF-1的重组表达体系，深入研究其结构与功能的关系以及具体的调控机制等，为揭开家蝇高效的免疫防御机制及新型肽类药物的筛选作出努力。

31 贵阳医学院2012届博士研究生论文

第二章 家蝇抗真菌肽MAF-1基因的重组表达及其

表达产物的活性检测

MAF-1已被初步证实是一种全新的昆虫抗真菌肽，构建MAF-1的重组表达系统，获得具有活性的重组蛋白，可对MAF-1cDNA序列的克隆与生物信息学分析结果进行验证，并可为进一步研究MAF-1蛋白的生物活性、结构与功能的关系以及代谢动力学等奠定基础，也可为人工生产MAF-1蛋白创造条件。昆虫抗微生物肽体内免疫诱导的产量很低，从机体中提取的步骤繁琐，成本高，直接合成的价格更为昂贵，严重限制了它的开发应用[58,59]。利用基因工程表达的方法生产抗微生物肽逐渐成为首选的途径，但是由于抗微生物肽分子较小，容易被蛋白酶降解，同时由于其表达产物对宿主菌有害，因此常不能在原核系统中直接表达，一般采用真核表达或融合表达的形式。近年来，已陆续报道多种抗微生物肽在原核细胞中进行成功融合表达[50-53]。大肠肝菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短、可带有易于纯化的标签蛋白，是最早被应用于表达抗微生物肽的表达系统，也是表达异源蛋白的首选表达系统[59]。我们拟选用其进行MAF-1基因与His标签的融合表达，使表达产物即重组的MAF-1蛋白带上His标签，既增强了重组蛋白的稳定性，又方便了重组蛋白的纯化[60-63]。32 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1、材料

1.1主要试剂

PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit、Ex Taq 酶、HindⅢ和EcoR I限制性内切酶、T4DNA ligase、dNTP Mixture、Primer STARTM HS DNA Polymerase、DNA标志物DL2000及1Kb DNA Ladder（均购自大连TaKaRa公司）；DNA凝胶回收试剂盒（广州玻尔生物有限公司）；质粒DNA快速提取试剂盒（广州东盛生物有限公司）；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、琼脂粉、琼脂糖（sigma公司）；丙烯酰胺、甘氨酸（Glycine）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵(Ap)(Amersham Pharm acia公司)；十二烷基硫（sodium dodecyl

sμLphate-polyacrylamide,SDS）、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂(Sigma公司)；考马斯亮蓝R-250（Sanland-chem公司）；His Band Purification Kit（Novagen公司）；0.45μm聚偏氟二乙烯（PVDF）膜为Millipore公司（美国）产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗大鼠IgG抗体、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒为Boster公司（中国武汉）产品；甘油（Glycerol）（北京天根公司）；双丙烯酰胺（黑龙江瑞兴公司）；溴酚蓝（北京索莱宝公司）；氯仿、异丙醇、无水乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、硼酸、氯化钠（NaCl）、甲醇、无水乙醇、冰醋酸、氯化钙（CaCl2）（国产分析纯级试剂）

1.2主要溶液的配制

1.2.1 10mg/mL溴化乙啶（EB）溶液：100mL水中加入1g EB，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔纸包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。1.2.2

5³TBE电泳缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、20mL的0.5mol/L EDTA

（pH8.0），加三蒸水至900mL，充分溶解，最后定容至1000mL。使用时稀释10倍至0.5³TBE。

1.2.3 10mg/mL卡那霉素溶液：在10mL蒸馏水中溶解0.1g卡那霉素后，0.22μm滤器过滤除菌，分装成1mL每份，贮存于-20℃。使用的终浓度为10μg/mL。

1.2.4 Luria-bertani（LB）液体培养基：Tryptone 10g、Yeast Extract 5g、NaCl 10g加入蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，高压（1.304×Pa）、120℃、20 min灭菌，4℃保存备用。临用前加入卡那霉素溶液使其终浓度为50μg/mL。33 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1.2.5 LB固体培养基：Tryptone 1g、Yeast Extract 0.5g、NaCl 1g、琼脂粉1.5g，加入蒸馏水至100mL，高压（1.304×Pa）、120℃、20 min灭菌，待温度降至60℃左右加入卡那霉素溶液，使其终浓度为100μg/mL，4℃保存备用。 1.2.6

0.1mmol/L CaCl2溶液：CaCl2·6 H2O 4.4g，加入蒸馏水至200mL，完全溶解后0.22μm滤器过滤除菌，分装成1mL每份，贮存于-20℃。 1.2.7

磷酸盐缓冲液（PBS）：KCl 0.2g、KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g、Na2HPO4

1.44g，加入900mL三蒸水溶解，调溶液pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。

1.2.8 1mol/L IPTG溶液：在8mL蒸馏水中溶解2.5g IPTG后，用蒸馏水定容至10mL，0.22μm滤器过滤除菌，分装成1mL每份贮存于－20℃。

1.2.9 溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/mL,并分装成1.5mL每份保存于-20℃,使用的终浓度为1 mg/mL，每份一经使用后便丢弃

1.2.10 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液：用20mL 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，0.22μm滤器过滤除菌，分装成1mL每份贮存于－20℃。

1.2.11 10％SDS溶液：在90mL Milli-Q纯水中溶解10g电泳级别SDS，加热至68℃助溶，浓盐酸调节溶液pH值至7.2，加Milli-Q纯水定容至100mL。

1.2.12 1×SDS上样缓冲液：50 mmol/L Tris·Cl pH6.8、100 mmol/L DTT、2%SDS、

0.1%溴酚蓝、10%甘油。

1.2.13 10％过硫酸铵溶液：1g过硫酸铵溶解于10mL Milli-Q纯水中，4℃保存

1－2周。

1.2.14 30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1g，加Milli-Q纯水至100mL，滤纸过滤后，室温避光保存。

1.2.15 5×SDS-PAGE缓冲液：15.1gTris碱、94g甘氨酸、5g电泳级别SDS，Milli-Q纯水定容至1000mL，使用时用Milli-Q稀释至1×。

1.2.16 考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 2.5g,甲醇450mL，冰乙酸100mL，补充水至1000mL，滤纸过滤除去颗粒物质。

1.2.17 脱色液：甲醇：水：冰乙酸按体积比45：45：10配制。

1.2.18 转移缓冲液：3.03g Tris碱、14.4g甘氨酸、100mL甲醇，三蒸水定容至1000mL。

1.2.19 考马斯亮蓝G250溶液：100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL 95％乙醇中，34 贵阳医学院2012届博士研究生论文

加入100mL 85％磷酸，搅拌溶解，以三蒸水定容至1000mL，滤纸过滤，室温避光保存。

1.2.20 细菌裂解缓冲液：50 mmol/L Tris·HCL pH 8.0、1mmol/L EDTA、0.1 mol/L

NaCl。

1.3 菌株及质粒

大肠杆菌DH5α、BL21/DE3 及质粒pET-28a(+)由中山大学引进, 由贵阳医学院病原生物学实验室常规保存。白假丝酵母菌（ATCC10231）由本实验室常规保存。

1.4 主要实验仪器

超净工作台（苏州净化设备有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；数显不锈钢电热培养箱（上海博讯实业）； PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；稳压稳流电泳仪（美国GE公司）；紫外分光光度计（美国GE公司）；Millipore 0.22μm0.45μm滤器（美国）；Milli－Q超纯水仪（法国Millipore

Pharmacia公司）；Allegra 64R 冷冻高速离心机（美国BECKMAN公司）；PB203-E型电子精密天平（上海梅特勒托利多仪器公司）；μ－Quant酶标分光光度仪（美国Bio－Tek公司）；超低温冰箱（日本三洋公司）；TS-1型脱色摇床（江苏其林贝尔仪器公司）；超声波破碎仪（中国新芝公司）；凝胶成像系统IQuant400（美国Amersham Pharmacia公司）；10μL、20μL、100μL、1000μL微量加样器（德国Eppendorf公司）。

1.5 实验动物

SD（Sprague Dawley）远交群大鼠，雄性，6－8周龄，购自贵阳医学院实验动物中心。

2. 方法

2.1 pET-28a(+)-MAF-1重组载体的构建与鉴定

2.1.1 引物的设计与合成

根据MAF-1的cDNA序列和原核表达质粒pET-28a(+)多克隆位点，用primer5.0及DNAclub软件设计引物，上游引物YW1，即5’-GGAATTCGAAT

CTGCC CCCGCCCCT GAGGT-3’，含有EcoRⅠ酶切位点及保护碱基；下游引物35 贵阳医学院2012届博士研究生论文

YW2，即5’- CCCAAGCTTCTAGGCATGGGGCTTCATTTCCTTGGC -3’，含有HindⅢ酶切位点及保护碱基，引物均委托宝生物公司合成。

2.1.2 目的基因的获得

以家蝇3龄幼虫总RNA为模板，采用PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit，应用引物YW1和YW2进行PCR扩增。

在0.2mL PCR薄壁管中配制50μL反应体系：

PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2μL

2×1 step Buffer 25μL

YW1(20μM) 1μL

YW2(20μM) 1μL

家蝇3龄幼虫总RNA 1μL

RNase Free dH2O 26.5μL

总体积 50 μL

放入PCR仪中反应条件设置为：

50℃ 30min

94℃ 2min

94℃ 30sec

60℃ 30sec 30 Cycles

72℃ 1min

扩增结束后，将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测和鉴定，并用DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化目的产物（具体步骤参见试剂盒说明书）。

2.1.3目的基因和质粒pET-28a(+)的双酶切、回收及连接

按质粒提取试剂盒说明书抽提质粒pET-28a(+)。分别对纯化的目的基因产物和质粒pET-28a(+)进行双酶切。酶切体系如下：36 贵阳医学院2012届博士研究生论文

10³Buffer 6μL

EcoRⅠ 3μL

HindⅢ 3μL

目的基因或pET-28a(+) 20μL

RNase Free dH2O 28μL

总体积 50 μL

将溶液混匀，水浴槽中37℃反应5 h后行1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的产物使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。

将双酶切后目的基因和质粒pET-28a(+)的纯化产物按照适当比例混合，建立10μL的连接反应体系。体系如下：

10³T4 DNA ligase Buffer 1μL

目的基因 3μL

pET-28a(+) 1μL

T4 DNA Ligase 1μL

RNase Free dH2O 4μL

总体积 10 μL

将溶液混匀，低温连接仪中16℃反应18 h。

2.1.4大肠杆菌DH5α感受态的制备和连接产物的转化、培养

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：使用CaCl2法[64]制备，于转化前一天制备好置于4℃。

连接产物的转化：①将感受态细胞从4℃冰箱拿出置于冰上；②在超净台内将上述连接产物10μL全部加入制备好的200 μL感受态细胞中，轻柔混匀，冰上放置30 min；③42℃热休克90 s，然后置于冰上3-5 min；④加入预热的无抗生素的LB液体培养基800 μL，37℃，170 rpm振摇1 h；⑤2000 rpm，10 min，弃去800 μL上清后，轻柔混匀溶液；⑥将溶液涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16 h；⑦从平板上挑取单菌落加入到3mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250 rpm振摇12 h后用日常型质粒提取试剂盒抽提质粒。

2.1.5阳性克隆的鉴定37 贵阳医学院2012届博士研究生论文

对上述抽提的质粒用相同的引物、相同的体系、相同的循环参数进行PCR；同时还在相同的酶切体系中对抽提的质粒进行双酶切。PCR产物和双酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；对PCR和双酶切鉴定已有相应条带的质粒，使用pET-28a(+)多克隆插入位点前的通用引物进行测序。测序工作由南京金思特生物技术有限公司完成。

2.2 重组MAF-1融合蛋白在大肠杆菌BL21/DE中的诱导表达

将构建好的pET-28a(+)-MAF-1重组质粒按照2.1.4所述方法转化至大肠杆菌BL21/DE感受态细胞中。从转化的平板上挑取单菌落加入到5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250 rpm振摇8 h后，按1：100转接。转接液在37℃，250 rpm摇振下培养至溶液的OD600＝0.6时，取1.5mL菌液作为诱导前对比样品后加入IPTG（终浓度1mmol/L），37℃，250 rpm摇振6 h，取1.5mL菌液作为诱导后样品。同样方法设立pET-28a(+)在大肠杆菌BL21/DE中的诱导表达对照。所有样品离心集菌，加入1³SDS上样缓冲液煮沸5－10 min，取10μL进行12％SDS-PAGE（分离胶12％、浓缩胶5％），用考马斯亮蓝R250室温染色4 h，脱色液脱色后观察重组MAF-1蛋白表达情况。

2.3重组MAF-1融合蛋白的大量表达和纯化

2.3.1重组MAF-1融合蛋白的大量表达

将确定能表达重组MAF-1蛋白的单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃，250 rpm摇振过夜后1：100转接到2000mL含卡那霉素的LB培养基中，培养至接种液的OD600＝0.6时加入上文中所确定的最佳IPTG浓度，在确定的最佳温度下 250 rpm摇振诱导表达适当的时间。取1.5mL用SDS-PAGE鉴定蛋白的表达。

2.3.2菌体的裂解、重组蛋白可溶性的判断

①将上述处理的2000mL菌液4℃、8000 rpm离心20 min集菌，弃去上清。每克菌（湿重）加入3mL裂解缓冲液，重悬沉淀的细菌。

②-20℃冷冻30 min，37℃放置20 min，反复冻融3次。

③裂解后的溶液冰上超声破碎（160W，超声1 s，停2 s，超声3 min）。

④4℃、13，000rpm离心20 min，收集上清和沉淀。分别取上清10μL加入2³SDS上样缓冲液和沉淀微量加1³SDS上样缓冲液煮沸5-10 min后行12%38 贵阳医学院2012届博士研究生论文

SDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。

2.3.3 待纯化融合蛋白样品的制备

2.3.3.1 可溶性重组MAF-1融合蛋白待纯化样品的制备

在上述裂解菌体所得的上清中加入尿素，并使尿素终浓度为1M，待尿素充分溶解后，用0.45μm滤器过滤后收集液体，以纯化可溶性的重组MAF-1蛋白。

2.3.3.2 包涵体中重组MAF-1融合蛋白待纯化样品的制备

将裂解菌体所得的沉淀用适量含有8M尿素的结合缓冲液重悬，置于摇床上平摇1h后，4℃、11000 rpm离心10 min后弃沉淀，将上清转至透析袋中，透析夹封口，以500mL含6M尿素的结合缓冲液为透析外液。4℃透析12h后，将透析外液更换为含5M尿素的结合缓冲液，继续透析12h。如此将透析外液中的尿素浓度由5M递减为4M、3M、2M、1M。然后收集透析内液，以纯化来源于包涵体中的重组MAF-1蛋白。

2.3.4 重组MAF-1融合蛋白的纯化

根据His²Tag融合蛋白纯化操作手册进行纯化，洗脱步骤中依次用6倍体积含50mM、100mM、150mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱并分别收集，约每1mL洗脱液收集为1ep管，并将各管取适量用12％SDS-PAGE判断重组蛋白纯化的效果。再根据SDS-PAGE结果，将纯化的重组蛋白装入透析袋中，以纯水为透析外液， 4°C透析24h，其间换液3-4次。透析毕，取透析袋置于干净盒子里用蔗糖包埋，将透析内液浓缩至约2mL。

2.3.5 各阶段样品蛋白浓度的测定

2.3.5.1 二喹啉甲酸（BCA）检测法绘制标准蛋白曲线

采用美国PIERCE公司的蛋白检测试剂盒，根据说明书配制标准蛋白浓度溶液和工作液，用酶标仪在562nm 下测定光密度（OD），绘制标准曲线。

2.3.5.2 测定纯化重组MAF-1蛋白时各阶段样品的蛋白浓度

取待测样品25μL，加入到含有200μL工作液的酶标板孔中，37℃培养30min

后测定562nm 吸光值，利用标准曲线计算其浓度。

2.4 大鼠抗重组MAF-1融合蛋白免疫血清的制备

将重组MAF-1蛋白与等体积的完全弗氏佐剂完全混匀（滴一滴混匀乳液在水面，乳液不扩散）[65]后，碘酒消毒SD大鼠的背部、足垫后皮下，注射混合乳液39 贵阳医学院2012届博士研究生论文

（200μg/只）。间隔2周后，将重组MAF-1蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂完全混匀，相同方式再次免疫大鼠。再间隔2周后，将重组MAF-1蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂完全混匀，相同方式再次免疫大鼠。末次免疫后一周采集大鼠血液[66]，分离血清，分装保存于－20℃。

2.5 Western Blotting方法鉴定重组MAF-1融合蛋白

2.5.1 湿法电转移

将纯化后的重组MAF-1蛋白行12%SDS-PAGE，采用预染蛋白标准。电泳结束后，将凝胶放至1³转移缓冲液中浸泡5min。剪取与凝胶大小一致的PVDF膜（做好正反及条带标记）依次浸于100％甲醇15s、超纯水2min（完全浸湿）、转移缓冲液中5－10 min。将与凝胶大小一致的6－8层（根据转移装置的松紧度使用）滤纸浸于转移缓冲液中，完全排除气泡。取凝胶置于3－4层滤纸上，PVDF膜对齐置于凝胶上，最上面对齐放置3－4层滤纸，每层均要注意排除气泡（最好在转移缓冲液中按顺序放置凝胶、膜和滤纸），然后夹于两块转移海绵垫中，按照转移装置上的电极表示正确放置，恒压90V转移1.5h，将蛋白由凝胶转移至PVDF膜上。

2.5.2 抗体孵育

将电转完毕的PVDF膜用100%甲醇浸泡10s后，于滤纸上干燥并做好标记。之后将其浸泡于5％脱脂奶粉封闭液中4℃孵育过夜。然后，将PVDF膜用PBS（pH7.4）漂洗（5 min³3次）后，置于用含1％BSA的PBS稀释（1：100）的一抗（制备的大鼠抗重组MAF-1蛋白免疫血清）溶液中，室温温和平摇孵育2 h。再用PBS（pH7.4）漂洗（5 min³3次）后，将膜置于用含1％BSA的PBS稀释（1：2000）的二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗大鼠IgG抗体）溶液中，室温温和平摇孵育1 h，用PBS（pH7.4）漂洗（5 min³3次）。

2.5.3 显色、观察结果

采用氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒进行显色。在1.5mL纯水中加入一滴试剂A，混匀，再加入试剂B和试剂C各一滴，配成显色液，将PVDF膜转入显色液中，静置避光显色，约5min后用终止液终止反应，然后将显色后的膜拍照并避光保存。

2.6 重组MAF-1融合蛋白的抗真菌活性检测40 贵阳医学院2012届博士研究生论文

2.6.1 菌液的配制

将白假丝酵母菌（ATCC10231）接种至沙氏培养基中，置37℃培养箱中孵育24h，使真菌处于对数生长期。然后，取对数生长期的白假丝酵母菌菌落3～5个，悬浮于5mL无菌蒸馏水中，调整其浊度至0.5麦氏标准单位（Mc Farland

standard unit），相当于每毫升含1³106～5³106个菌细胞。

2.6.2微量液体-菌落记数法[19]

取无菌的96孔板，分别于每孔中加入对数生长期09株白假丝酵母菌液50μL，待测样品50μL，另设无菌蒸馏水为阴性对照，氟康唑为阳性对照，充分混匀后置于湿盒中37℃培养24h。然后，从各孔中取出1μL划线涂布在沙氏培养基表面，再置入37℃培养24h后，取出进行菌落计数。

3. 结果

3.1 pET-28a(+)-MAF-1重组载体的构建与鉴定

以家蝇3龄幼虫总RNA为模板，通过PCR 扩增出MAF-1基因成熟肽片段（468bp），胶回收后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见500bp附近有一特异条带

(图2-1)。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ对pET-28a(+)-MAF-1重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示在500bp左右有一清晰条带（图2-2），与目的基因大小基本相符，此外重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功。用DNAman分析软件对重组质粒序列进行分析，可知重组MAF-1蛋白序列是在MAF-1成熟肽的156个氨基酸序列N端加入了35个氨基酸残基，其中包含His标签序列（图2-3）。用ExPASy的SOPMA工具分析重组MAF-1融合蛋白序列的二级结构，结果显示（图2-4），His标签的引入仍保持了天然MAF-1成熟肽的二级结构。41 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1: DL2000 DNA Marker；2:

MAF-1基因片段.

1: DL2000 DNA Marker；2: MAF-1 gene.

图2-1 MAF-1基因的PCR产物电泳图

Fig. 2-1 The result of PCR for MAF-1

1: DL2000 DNA Marker；2:

pET-28a(+)-MAF-1重组质粒双酶切产物.

1: DL2000 DNA Marker；2:

EcoRⅠand Hind

Ⅲ digestion of recombinant plasmid

pET-28a(+)-MAF-1；

图2-2 pET-28a(+)-MAF-1重组质粒双酶切产物电泳图

Fig.2-2 Electrophoresis of digesting recombinant plasmid pET-28a(+)-MAF-1.

42 贵阳医学院2012届博士研究生论文

: 引入的标签序列

: The insert amino acid sequence

图2-3 MAF-1重组融合蛋白氨基酸序列

Fig. 2-3 The amino acids sequence of MAF-1 fusion protein

图2-4 MAF-1重组融合蛋白的二级结构预测结果

Fig. 2-4 The secondary structure prediction for MAF-1 fusion protein.

3.2重组MAF-1融合蛋白在大肠杆菌BL21/DE中的表达、纯化

pET-28a(+)-MAF-1重组质粒在大肠杆菌BL21/DE经过37℃、1mmol/L IPTG诱导5h后的产物行12％SDS-PAGE分析，与pET-28a(+)空载转化菌、重组质粒转化菌未经IPTG诱导组相比较，可见在分子量标准18.4 kD与25.0 kD间约20kD附近（MAF-1成熟肽分子量与His标签分子量之和）有明显蛋白表达条带， 且重组质粒转化菌经裂解后的上清中有可溶性的重组MAF-1融合蛋白，包涵体中也有大量重组MAF-1融合蛋白的表达（图2-5）。43 贵阳医学院2012届博士研究生论文

应用His²Bind Purification Kit对pET-28a(+)-MAF-1重组质粒转化菌菌液上清及包涵体中的重组MAF-1融合蛋白进行纯化，由含50mM、100mM咪唑的洗脱缓冲液可完全洗脱菌液上清及包涵体中的重组MAF-1融合蛋白（图2-6）。将洗脱液透析后浓缩，测得其蛋白浓度为0.401mg/mL。

1：蛋白分子量标准； 2：pet28a未诱导； 3：pet28a诱导； 4：大量诱导表达后菌液上清；

5：大量诱导表达后菌液沉淀； 6：未经诱导的BL21全菌液； 7：经诱导表达后的BL21全菌液.

1：Protein Marker；2：pET-28a(+) trantformants without IPTG induction；3：pET-28a(+)

trantformants with IPTG induction；4：Supernatant of pET-28a(+)-MAF-1 induced by IPTG；5：Precipitation of pET28a(+)-MAF-1 induced by IPTG；6：pET-28a(+)-MAF-1 trantformants

without IPTG induction；7：pET-28a(+)-MAF-1 trantformants with IPTG induction.

图2-5 重组MAF-1融合蛋白的SDS-PAGE结果

Fig.2-5 SDS-PAGE analysis of MAF-1 fusion protein.

44 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1：蛋白分子量标准； 2：纯化的重组MAF-1融合蛋白.

1：Protein Marker；2：Purified fusion protein of pET28a(+)-MAF-1

图2-6 纯化后的重组MAF-1融合蛋白的SDS-PAGE结果

Fig.2-6 SDS-PAGE analysis of the purified MAF-1 fusion protein.

3.3重组MAF-1融合蛋白的Western Blotting鉴定

纯化所得重组MAF-1融合蛋白经Western Blotting鉴定，结果显示所制备的大鼠抗重组MAF-1融合蛋白免疫血清能识别重组MAF-1融合蛋白，显影条带分子量大小与预期一致（图2-7）。

1：蛋白分子量标准； 2：重组MAF-1融合蛋白；3：阴性对照.

1: Protein Marker；2：Fusion protein of pET28a(+)-MAF-1； 3：Negative control.

图2-7重组MAF-1融合蛋白的Western Blotting鉴定

Fig.2-7 Western Blotting result of MAF-1 fusion protein45 贵阳医学院2012届博士研究生论文

3.4 重组MAF-1融合蛋白的抗真菌活性检测

以白假丝酵母菌（ATCC10231）为指示菌，采用微量液体-菌落记数法检测纯化后重组MAF-1的抗真菌活性。结果显示（表2-1，图2-8），100μg/mL的重组MAF-1具有明显的抗真菌活性。

表2-1 重组MAF-1融合蛋白的抗真菌效果

Tab.2-1 Antifungal activity of fusion protein of pET28a(+)-MAF-1

样品

重组MAF-1蛋白

阴性对照

阳性对照

注：与阴性对照相比

* P<0.05.

Note：Compared with Negative control

* P<0.05.

100µg/mL

0

1mg/mL氟康唑

浓度 菌落数（个）

(xSD)

59±9*

1132±86

98±12*

46 贵阳医学院2012届博士研究生论文

1 2

3

1：重组MAF-1（100μg/mL）； 2：阳性对照； 3：阴性对照.

1：Fusion protein of pET28a(+)-MAF-1（100μg/mL）；2：Positive control；3： Negative control.

图2-8 重组MAF-1的抑真菌活性检测

Fig.2-8 The antifungal activity comparision

4. 讨论

抗微生物肽是昆虫免疫体系中的关键组分，是昆虫抵御病原微生物入侵的必要防线。昆虫的抗微生物肽种类丰富，在不同的昆虫中所存在的这些功能多肽也有所不同[12,13]。同时，抗微生物肽以其耐热、对高等动物细胞无损伤等特点，已被视作未来可能的新的抗菌、抗真菌药物的新来源。目前，学者们对蝇类的抗微生物肽的研究较多，其中，对抗细菌肽的研究较为广泛和深入，而对抗真菌肽的分离纯化及其克隆表达的研究报道相对较少。

由于昆虫等生物体中的抗微生物肽含量低且纯化困难或纯化的成本较高，用基因工程技术构建表达系统获得抗微生物肽已成为目前常用的方法。Yuan Y等将Drosomycin基因转入大肠杆菌进行了表达研究，结果显示表达产物具有抗真47 贵阳医学院2012届博士研究生论文

菌作用[21]。Lamberty M 等对Heliomicin基因进行了分析，发现其序列结构属于昆虫defensin家族，将其进行酵母内的重组表达，表达产物仍具有抑制细菌与真菌的作用[25]。Kim DH等建立了tenecin Ⅲ的表达体系，可大量制备具有抗ns活性的重组tenecin Ⅲ[27]。国内也有报道昆虫抗真菌肽基因的原核表达及在酵母中的表达，表达产物均具有抑制真菌生长的作用[28-30]。大肠肝菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短、可带有易于纯化的标签蛋白等特点，是最早被应用于表达抗微生物肽的表达系统。利用原核表达系统异源表达抗微生物肽的技术目前已较为成熟，但常需借助融合蛋白来增强抗微生物肽的稳定性[67]。pET载体系列是用于蛋白或多肽高水平表达和纯化的一组表达载体，我们选用的pET-28a(+)载体，可使异源基因与His标签融合表达，使得到的重组融合蛋白易于纯化，并在一定程度上增加了重组蛋白的免疫原性和稳定性。

应用His²Bind Purification Kit对pET-28a(+)-MAF-1重组质粒转化菌菌液上清中可溶性的重组MAF-1融合蛋白进行纯化时，在未变性的条件下直接上柱纯化，重组蛋白未能挂柱。目前常见的加入His标签的重组蛋白不挂柱的原因为His标签无游离性，折叠到蛋白内部或以化学键等与蛋白本身粘附，因此不能与Ni柱亲和而挂柱。变性剂尿素可以打断蛋白质分子内或分子间的共价键、离子键、疏水作用及静电作用等，使多肽链伸展[68]。经过实验，我们在转化菌菌液上清中加入尿素并使其终浓度达到1M时，重组融合蛋白便能挂柱纯化，收集洗脱液进行透析既能除去尿素使蛋白复性，同时也将样品中的Ni离子除去。在细胞质内高表达的外源蛋白质，尤其是来自真核生物的蛋白质，常会形成不溶性的聚合物，即包涵体[69]。我们在进行重组表达时，转化菌菌液中也形成了含有重组MAF-1融合蛋白的包涵体。一般而言，包涵体中蛋白质表达量高，但是其纯化需要变性和复性的过程。用尿素融包涵体后，我们采用先将蛋白复性再挂柱纯化的方法。复性过程采用透析，并使样品中尿素浓度逐步降低，考虑到菌液上清中可溶性的重组蛋白也需加入尿素，我们在复性时使尿素终浓度降至1M时挂柱纯化，纯化条件与菌液上清一致。通过此方法，我们将转化菌菌液中的可溶性重组蛋白和包涵体中的重组蛋白均纯化回收，提高了重组蛋白的得率。

抗真菌活性检测结果显示，虽然重组MAF-1融合蛋白N端的His标签未除去，48