2023年12月29日发(作者：win10系统安装)

酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

丁洁，臧清，王然，马翌婷，马雪梅*

(北京工业大学，生命科学与生物工程学院，生物化学技术实验室，北京 100022)

摘 要: 采用SDS 抽提法从酵母中提取蔗糖酶，在SDS 摩尔浓度0.5 mmol/L，温度40℃，提取时间10 h，pH值5.5的提取条件下，进行抽提得到粗酶，经质量分数50 %的乙醇分级沉淀、Mono Q 阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。利用考马斯亮蓝法测定不同浓度梯度的标准酵母蔗糖酶溶液的吸光度值，并绘制标准曲线，然后测定酵母蔗糖酶样液的吸光度值，从而得出该蔗糖酶样液的浓度，分别为：A样液279.53 μg /mL； B样液873.18 μg

/mL。最后利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定酵母蔗糖酶的相对分子质量是60kDa。

关键词: 酵母蔗糖酶；SDS法提取；考马斯亮蓝法；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

Study on Purification and Properties of Invertase from Yeast

DING Jie, ZANG Qing, WANG Ran, MA Yi-ting, MA Xue-mei*

(Beijing University of Technology, College of Life Science and Bio-engineering, Laboratory of

Biochemical technology, Beijing, China, 100022)

Abstract：The experiment extracted invertase from brewer’s yeast using SDS extraction. Under the

condition of the SDS concentration 0.5mmol/L, temperature for 40 ℃, time for 10h, pH value for

5.5

to get coarse enzyme extraction. Then the purified invertase was obtained by precipitatation with

50％ethyl alcohol and Mono Q chromatography. The absorbance of yeast invertase solution can be

determined by Coomassie Brilliant Blue, then draw the standard curve of yeast invertase solution so

that we can know the concentration of yeast invertase solution:

A samples of 279.53 μg /mL, B

samples of 873.18μg /mL. The relative molecular mass of the yeast invertase was determined by

SDS polyacrylamide gel electrophoresis.

Key words : Yeast Invertase ; SDS Extraction; Coomassie Brilliant Blue; SDS Polyacrylamide gel

electrophoresis

作者简介：丁洁(1992一)，女，北京人，学生。

通讯作者：马雪梅，女，教授，致力于病毒性疾病，遗传性疾病、肿瘤相关疾病的诊断等方面的研究工作。E-mail:xmma@

蔗糖酶( Sucrase , EC 3. 2. 1. 26) 又称转化酶( Invertase)。可作用于β-1 ,2 糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1. 36～1. 60 倍，在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法[1]。

本文以SDS抽提法从酵母中提取蔗糖酶，经乙醇分级沉淀、Mono Q 阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。利用标准曲线对其进行浓度分析，最后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的方法得到酵母蔗糖酶的相对分子量。

1材料与仪器

1.1 材料

酵母（市售）。

1.2主要化学试剂和仪器

十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva 公司提供；等电点标准品，Amersham 公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。

牛血清蛋白标准溶液、考马斯亮蓝G-250、30%聚丙烯酰胺储存夜、1.5M Tris-HCl、AP、TEMED、溴酚蓝、生理盐水、去离子水、无水乙醇等。

UV22201 型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters 650 型高级蛋白

纯化系统，Waters 公司制造；Phast System 全自动快速水平电泳仪，Amersham 公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco 公司制造；电泳仪，Bio2Rad

公司制造；精密酸度计，Orion 公司制造。

2方法

2.1酵母蔗糖酶的提取与纯化

2.1.1 酵母提纯

酵母离心（8 000 r/min）15 min 后收集菌体。将收集到的菌体用蒸馏水洗涤，离心，再洗涤，重复数次，直到菌体呈白色，倾出上清液，将不含杂质的干净的酵母保存待用。

2.1.2 粗酶液的制备

准确称取离心分离后的酵母10g，加入60mL 0.5mmol的SDS溶液溶解，在pH为5.5、40℃水浴中加热10h后取出，4℃、12000r/min离心15min。清液即为粗制酶液。4℃保存。

2.1.3乙醇分级纯化

在粗酶液中加人乙醇使其质量分数达30％，4℃放置过夜，4℃、12000 r/min离心15 min，取上清液，再追加乙醇使其终质量分数达50％。4℃放置1 h．4℃、12000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4℃保存。经SDS抽提法提取，质量分数50％的乙醇沉淀所碍的酶液对透析液(pH 7.3、0.05mol/L，Tris-HCl缓冲液)充分透析，所得透析液4℃保存。

2.1.4 MonoQ阴离子交换柱层析

酵母蔗糖酶经上步纯化后，上

MonoQ(10/10)阴离子交换柱(用pH7.3、0.05

mol/L。Tris-HCl缓冲液充分平衡过)，然后用0～l mol/L、60 min线性梯度的NaCl溶液(内含pH 7.3、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱。体积流量为0.5mL/min，每管收集3 mL。，紫外检测波长为280 nm。测定各管洗脱液的蔗糖酶活性与蛋白质含量，合并蔗糖酶活力高的若干管洗脱液，经过对水透析脱盐，冷冻干燥后即为纯化的酵母蔗糖酶。

2.1.5 蔗糖酶活性的测定

稀释酶液0.5 mL，加入0.3 mL pH值为

4.6、0.1 mol/L的NaAc-HAc缓冲液，0.2 mL

0.1 mol/L的蔗糖溶液，37℃准确反应15min后，加0.125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反应。用DNS法在540 nm波长下测定形成的还原糖量。在该条件下，蔗糖酶液1 min转化底物蔗糖生成1μg葡萄糖定义为1个活力单位[2]。

2.2考马斯亮蓝法测定酵母蔗糖酶的浓度

2.2.1蛋白质标准曲线的绘制表2.1 蛋白质标准溶液配制表

管号

蛋白质母液/μL

生理盐水/μL

考马斯亮蓝G250/μL

总体系/μL

蛋白质浓度/(μg/mL)

1

0

150.00

2850

3000

0

2

18.75

131.25

2850

3000

100

3

37.50

112.50

2850

3000

200

4

56.25

93.75

2850

3000

300

5

75.00

75.00

2850

3000

400

6

93.75

56.25

2850

3000

500

7

112.50

37.50

2850

3000

600

母液

800

根据表2.1，配制7份梯度浓度的蛋白质标准溶液，室温静置3min，在595nm波长处比色，绘制标准曲线。

2.2.2酵母蔗糖酶样液浓度的测定

取一支干净试管，加入样品液1.0mL及考马斯亮蓝染液4.0mL，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线，即可求出含量。

2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酵母蔗糖酶的相对分子量

2.3.1 酵母蔗糖酶样品的处理

2.3.1.1 低相对分子质量标准蔗糖酶样品的制备

分装标准蔗糖酶样品，即每个包装加入200 μL去离子水充分溶解，然后分装于200个小塑料离心管。分装后每份体积10 µL，每种标准蛋白质的含量为2µg，-20 ℃保存。用

时加入等体积的样品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热3min，待电泳时用于上样。

2.3.1.2 待测蔗糖酶样品的制备

取蛋白样品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）1mL溶解。加入等体积的样

品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热3min，待电泳时用于上样。

2.3.2 凝胶的制备

2.3.2.1 分离胶的制备表2.2 10%的SDS-PAGE分离胶6mL体积配方表

试剂

30%

聚丙烯酰胺储存夜

2.4

ddH2O

1.5M

Tris-HCl（PH8.8）

1.5

1%SDS 1%AP TEMED

用量/mL

1.98 0.06 0.06 0.007

根据表2.2，配制分离胶于一烧杯中，混匀，用移液枪将混匀的溶液缓慢沿板角注入两块玻璃板之间，至2/3的位置。注入完毕后，

封上一层水加速聚合，当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。

2.3.2.2 浓缩胶的制备表2.3 5%的SDS-PAGE浓缩胶2mL体积配方表

试剂

30%

聚丙烯酰胺储存夜

0.33

ddH2O

1.4

1.5M

Tris-HCl（PH6.8）

0.25

100g/L

SDS

0.02

100g/L

AP

0.02

TEMED

用量/mL

0.002

用滤纸吸干水后，根据表2.3，配制浓缩胶于一烧杯中，混匀，用移液枪将混匀的溶液缓慢沿板角注入两块玻璃板之间并溢出，迅速插入梳子，待浓缩胶凝固。

2.3.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

待浓缩胶凝固后，向电泳槽中倒满电泳液，小心地取出梳子，向凹槽中分别注入5μLMarker溶液和5μL加过溴酚蓝指示剂的

蔗糖酶样液。连接好电泳仪后，接通电源，调节电压为50V（约8V/cm），当溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调至120V，待溴酚蓝下行到距胶末1cm停止电泳。

2.3.4 凝胶的染色、脱色及照相

电泳结束后，将凝胶板取下，切去浓缩胶，并进行方位标记，剥胶，放入已装有染色液的培养皿中，染色0.5-1h。染色完毕后，

倒出染色液，并换脱色液2-3次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止，最后在进行照相观察。

3.1.1标准曲线的绘制

将配制好的不同浓度梯度的蛋白质标准溶液放到分光光度计上测吸光度值，得到一系列数据。

3 结果

3.1 考马斯亮蓝法测定酵母蔗糖酶的浓度

表3.1 不同浓度梯度的蛋白标准溶液和对应的吸光度值及蔗糖酶样液的吸光度值

蛋白质标准溶液/(μg /mL)

0

0

100

0.209

200

0.357

300

0.496

400

0.637

500

0.846

600

1.043

A

1X

0.486

蔗糖酶样液

B

1Y

1.214

蛋白质浓度/(μg/mL)

吸光值A

1/2Y

0.753

根据表3.1，绘制蛋白质浓度对吸光度值的标准曲线，得到回归方程及R2

值。

1.2

1

y = 0.0017 x + 0.0108

R² = 0.9947

液浓度为279.53 μg /mL； B样液浓度为873.18 μg /mL。

吸光度值A

0.8

0.6

0.4

0.2

0

0 200 400 600 800

3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蔗糖酶的相对分子质量

蛋白质标准溶液浓度（μg/mL）

图3.1 蛋白质浓度对吸光度值的标准曲线

3.1.2 蔗糖酶样液浓度的计算

根据图3.1所示标准曲线，将测得未知浓度的蔗糖酶样液A、B的吸光度值代入回归方程，得到A、B溶液的浓度。计算结果：A样图3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

图3.3 Maker-P7709s-NEB

图3.2中，从左至右第四条带为本人的电泳实验结果。又根据图3.3，蔗糖酶样品的电泳结果位于58kDa和80kDa之间，故可估计出蔗糖酶的相对分子质量为60kDa。

4讨论

4.1 选择SDS抽提法的原因

对于SDS 抽提法、冻融法和甲苯自溶法三种提取方法，从酶活性来看，SDS 抽提法的酶活性最高，是甲苯自溶法的1120倍和冻融法的2倍。从提取效率来看, SDS 抽提法较高，是冻融法的2倍。并且，SDS 抽提法还具有操作简便易行、生产成本低、回收率高等特点，更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产。

4.2稀释蛋白质标准溶液方法的选择

制作标准曲线时，我们选择的稀释方法是每一次都直接从母液中吸取溶液配制，而不是逐级稀释溶液。我们认为这样做的优点

有：第一，计算简单，操作方便；第二，结果的准确度比较高，不容易出错；第三，中间某一梯度稀释出现问题容易改正，不会因其导致后面的稀释出现问题。而且，我们的最终得到的标准曲线的R2值为0.9947，可见相关性较好。

4.3考马斯亮蓝法的优缺点

考马斯亮蓝法的优点：第一，灵敏度高，最低蛋白质检测量可达1mg；第二，测定快速、简便，只需加一种试剂；第三，干扰物质少。

考马斯亮蓝法的缺点：第一，由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差；第二，仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH；第三，标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

4.4浓缩胶和分离胶pH值不同的原因

在SDS-PAGE不连续电泳中，浓缩胶和分离胶的pH值不同，前者主要表现为浓缩效用，后者表现为电荷效用和分子筛效用。

制胶缓冲液使用的是Tris－HCl缓冲系统，浓缩胶的pH6.8，分离胶的pH8.8；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓

缩胶中，其pH环境呈弱酸性，而甘氨酸的等电点为5.97，因此甘氨酸仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢，而Cl离子几乎全部解离。两者之间形成导电性较低的区带，5 结语

本实验，通过SDS 抽提法提取酵母中蔗糖酶，经乙醇分级沉淀、Mono Q 阴离子交换蛋白分子就介于二者之间泳动，三类离子的迁移速率为Cl>一般蛋白质>甘氨酸，电泳开始后，Cl离子泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。甘氨酸在电场中移动很慢，造成移动离子的缺乏，于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区，在高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl离子区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，并按蛋白质所带负电荷量的多少依次排列成带，浓缩样品。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，又因为它分子小，故超过所有的蛋白质分子，直接紧随Cl离子之后。Cl离子迁移后，低离子浓度不再存在，形成了恒定的电场强度，因此，蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质，分子大小和形状，分离胶的孔径有一定大小，对不同相对质量的蛋白质来说，通过时收到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。

柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。利用考马斯亮蓝法测定酵母蔗糖酶样液的浓度，分别为：A样液279.53 μg /mL； B样液873.18 μg /mL。最后利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定酵母蔗糖酶的相对分子质量是60kDa。

参考文献（References）

[1] 李楠，庄苏星，丁益.酵母蔗糖酶的提取方法［J］.食品与生物技术报，2007，26（4）：83-87.

[2] 梁敏，李楠楠，绉东恢.蔗糖酶的提取工艺与性质研究［J］. 湖南农业科学，2010，49（9）：2218-2220.