2024年4月4日发(作者：)

分子标记与遗传图谱

AFLP的原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限

制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段

的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。 限制性片段用

二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。 选择特定的片段进

行PCR扩增，由于在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与

接头互补的但3’端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那

些与3’端严格配对的片段才能得到扩增。 再在有高分辨力的测序胶上分开这

些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 该技术包括三个

步骤： DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头 adapter 连接； 利

用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过

多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg； 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩

增的DNA片段。 利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一

次单个反应中检测到大量的片段。 由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA

谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生； 这种通过引物诱导及DNA扩增后得

到的DNA多态性可作为一种分子标记； 所以说AFLP技术是一种新的而且有很

大功能的DNA指纹技术。 简单序列长度多态性 Simple Sequence Length

Polymorphisms,SSLP 限制性片断长度或PCR产物长度因为小卫星或微卫星随

机重复数量的变化形成的差异。 SSLP具有多等位性，有两种SSLP常用于作图：

小卫星序列：又称可变串联重复，其重复单位为数十个核苷酸。 微卫星序列：

或简单重复序列，其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成。

微卫星序列的应用比小卫星序列的应用普遍的多，原因有二： 小卫星序列大多

集中在染色体的端部；而微卫星序列在整个基因组中分布广密度高； 微卫星序

列PCR分析：PCR扩增的DNA长度少于300bp时，反应既快速又精确。 微卫星

序列的多态性信息量（PIC）一般大于0.75。 PIC可定义为某一标记在群体中出

现多态性的频率。 单核苷酸多态性 （Single nucleotide polymorphism，

SNPs） 单核苷酸多态性 SNPs 基因组中单个核苷酸的突变称为点突变。 某些

群体在特定的单核苷酸位置只有2个或3个SNP，这些位点称为双等位或三等位。

在基因的编码顺序中，SNP大多位于密码子的摇摆位置，表现为沉默突变而被大

量保存下来。 大多数SNP必须采取测序或寡聚核苷酸杂交检测。 SNP在同一个

体中常以纯合态存在，它在基因组中的数量极大，人群中几乎任何两个个体的基

因组都有SNP。 序列标记位点 （Sequence-tagged sites, STS） 序

列标记位点，是根据单拷贝DNA片段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组

DNA产生的一段长度为几百碱基对的特异序列，在基因组中往往只出现一次，从

而能够界定基因组的特异位点。 用这些标记物来测试整个基因组，包含同一STS

的两个或多个克隆必然相互覆盖。 最富信息和多态性的STS标记可能是扩增含

有微卫星重复序列的DNA区域所得到的。 在人类基因组作图中已用STS作为将

遗传图谱与物理图谱整合的共同位标，这在基因组作图上具有非常重要的作用。

跨叠片段图谱 Contig Maps ，通常是以STS为标记的物理图谱。 其构建过程是：

先用基因组DNA建立含重叠 Overlapping 克隆的基因组文库，然后通过重叠克

隆间所共有的核苷酸序列将所有的克隆沿染色体排成连续的跨叠系列

Contigs 。 3. 物理图 由于遗传图分辨率有限，精确性较低，

在进行大规模的DNA测序之前，对大多数真核生物的遗传图必须进行验证，并利

用其他作图技术予以校正和补充。 这里我们要介绍另一种基因组作图，即直接

检测DNA标记在染色体上的实际位置。 物理作图技术最有用的方法有以下４类：

3.1 限制性作图 restriction mapping 它是将限制性酶切位点标定在DNA分

子的相对位置。 3.2 基于克隆的基因作图 clone-based mapping 根据克隆的

DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群 contig ,绘制物理连锁图。 3.3 荧光标记