2024年3月15日发(作者：)

2021

年

6

月

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

June

2021

第

41

卷第

6

期

Vol.41

No.6

文章编号

：

1001-6325

(

2021)

06-0825-06

研究论文

全转录组测序分析精子发生中

RNA

结合蛋白质的动态表达

李

凯

，

邙新雨

，

邹定峰

，

李梦真

，

缪时英

，

王琳芳

，

宋

伟

*

*

(中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系

医学分子生物学国家重点实验室

，

北京

100005)

摘要

：

目的系统解析

RNA

结合蛋白质

(RBPs)

在小鼠精子发生中的动态表达全貌

、

阶段特异性及协同表达模式

，

并预测其潜在调控作用

。

方法整合

6

种类型生精细胞的全转录组测序数据

，

分析精子发生全程差异表达的

RBPs

；

利用时间序列分析软件

(

STEM)

分析差异表达

RBPs

动态表达模式

；利用加权基因共表达网络分析

(WGCNA)

鉴定精子发生中协同表达的

RBPs

；

通过

ClusterProfiler

工具分别对差异表达以及协同表达的

RBPs

进行

GO

功能富集分析

。

结果精子发生中共鉴定

519

个阶段特异表达的

RBPs,

并具有

7

种动态表达模式

，

其中减数分

裂时期的

RBPs

占比最高

；

GO

分析显示

RBPs

主要参与

mRNA

选择性剪接

、

加工或翻译过程;

WGCNA

分析获得

246

个共表达

RBPs,

其中减数分裂时期共表达

RBPs

占比最高

。

结论

RBPs

在精子发生中呈现阶段特异性

，

并且以协

同表达模式发挥调控作用

。

其在精子发生早期阶段参与

RNA

加工或剪接等过程

，

而在后期阶段参与核糖体组装

或

RNA

翻译等过程

。

关键词

：

RNA

结合蛋白质;转录组;共表达;精子发生

中图分类号:

Q28

文献标志码:

A

Dynamic

expression

of

RNA-binding

proteins

in

spermatogenesis

based

on

RNA-seq

LI

Kai,

MANG

Xin-yu,

ZOU

Ding-feng,

LI

Meng-zhen,

MIAO

Shi-ying,

WANG

Lin-fang,

SONG

Wei

*

(State

Key

Laboratory

of

Medical

Molecular

Biology

,

Department

of

Biochemistry

and

Molecular

Biology,

Institute

of

Basic

Medical

Sciences

Chinese

Academy

of

Medical

Sciences,

School

of

Basic

Medicine

Peking

Union

Medical

College

,

Beijing

100005,

China)

Abstract

:

Objective

To

systematically

characterize

the

dynamic

expression

pattern

,

stage

specificity

and

co-ex

­

pression

pattern

of

RNA-binding

protein

(

RBPs)

and

to

predict

their

potential

regulatory

role

in

mouse

spermato

­

genesis

・

Methods

The

whole

transcriptome

sequencing

data

of

six

spermatogenic

cells

types

were

integrated

for

an

­

alyzing

the

differentially

expressed

RBPs

during

spermatogenesis

；

STEM

was

used

to

analyze

the

dynamic

expression

pattern

of

RBPs

；

WGCNA

was

used

to

identify

the

RBPs

co-expressed

pattern

；

The

differentially

expressed

and

co

­

expressed

RBPs

were

analyzed

by

the

ClusterProfiler

tool

for

GO

function

enrichment

analysis.

Results

A

total

of

519

stage-specific

RBPs

were

identified

during

spermatogenesis

,

and

there

were

7

dynamic

expression

patterns

,

of

which

RBPs

at

the

meiotic

stage

accounted

for

the

highest

proportion

；

GO

enrichment

analysis

showed

that

RBPs

were

收稿日期

：

2021-03-29

修回日期

：

2021

・

04-

16

基金项目

：

国家自然科学基金

(

31970794,32000586)

*

通信作者(

corresponding

author

)

:

songwei@

ibms.

826

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

2021.41(6)

mainly

involved

in

the

selective

splicing

,

processing

or

translation

of

mRNA

；

WGCNA

analysis

showed

that

246

RBPs

were

co-expressed

,

among

which

RBPs

at

the

meiotic

stage

accounted

for

the

highest

proportion.

Conclusions

RBPs

exhibit

stage

specificity

and

play

a

regulatory

role

in

spermatogenesis

with

a

coordinated

expression

mode.

It

functions

mainly

in

the

process

of

RNA

processing

or

splicing

in

the

early

stage

of

spermatogenesis

,

and

is

have

sig

­

nificant

impact

on

the

process

of

ribosome

assembly

or

RNA

translation

in

the

later

stage.

Key

words

:

RNA-binding

proteins

;

transcriptome

;

co-expression

；

spermatogenesis

精子发生是从精原细胞发育成为成熟精子的一

个复杂有序的连续细胞分化过程

，

主要分为

3

个时

期:精原细胞有丝分裂期

、

精母细胞减数分裂期和精

子形成期⑴

。

该过程众多阶段特异性基因的表达

与调控是维持精子发生正常进行的分子基础

。

目

前

,

大量单细胞组学研究高精度解析了精子发生中

生精细胞有序性发生的转录图谱

26]

,

然而,在转录

后水平如何操控这些转录生成物的命运和功能进而

影响生精细胞的增殖或分化仍未详细阐明

。

RNA

结合蛋白质

(

RNA-binding

proteins

,

RBPs

)

是一类通过其功能结构域与

RNA

互作并操控

RNA

命运和功能的蛋白质⑺

。

RBPs

在转录后水平以多种

方式参与调控

RNA

命运

，

例如

mRNA

选择性剪接

、

运

输

、

编辑和翻译等

,

这些方式均会引起相应的基因表

达变化⑻

。

目前

，

在精子发生中已发现部分

RBPs

在

转录后水平发挥关键的基因表达调控作用

a®

撚而

有关

RBPs

在精子发生全程的动态表达图谱仍缺乏

完整认识

。

本研究整合小鼠

6

种类型生精细胞的全

转录组测序数据

，

系统分析

RBPs

在精子发生中的动

态表达全貌

、

阶段特异性及协同表达模式

,

并对其潜

在功能进行预测

，

为阐释精子发生的分子机制及诊治

男性不育相关疾病提供新的科学依据

。

1

材料与方法

1.1

材料

小鼠睾丸组织

6

种类型生精细胞的全转录组测

序数据

(

Bulk

RNA-seq)

来源于本实验室前期的研究

成果[⑴

。

该数据可从美国国立生物信息中心的基

因表达综合数据库

GEO

下载

(

https

：

//www.

ncbi.

nlm.

nih.

gov/geo/

)

，

其登录号为

GSE145130

o

6

种

类型生精细胞分别为原始

A

型精原细胞

(

primitive

type

A

spermatogonia

,

priSG-A)

、

B

型精原细胞

(

type

B

spermatogonia

,

SG-B)

、

前细线期精母细胞

(

prelep-

totene

spermatocytes

,

plpSC

)

、

粗线期精母细胞

(

pachy

­

tene

spermatocytes

,

pacSC

)

、

圆形精子

(

round

sperma

­

tids,

rST)

和长形精子

(

elongating

spermatids,

elST)

o

1.2

方法

1.2.

1

RNA-seq

数据处理

：

6

种类型生精细胞

RNA-seq

的文库构建

、

测序数据质控

、

基因组比对及

基因表达分析方法见参考文献

[

11]

O

1.

2.

2

基因表达热图:利用

R

语言

pheatmap

工具

包展示

RBPs

在

6

种类型生精细胞中的基因表达水

平

(

Fragments

Per

Kilobase

of

transcript

sequence

per

Millions

base

pairs

mapped

,

FPKM

Ml)

。

1.

2.

3

RBPs

差异表达分析及功能预测:利用

R

语

言

DESeq2

工具包分析

6

种类型生精细胞差异表达

的

RBPs,

筛选标准为

：

I

log

2

FoldChange

丨

M

1.

5

且

P.

adjust

<

0.

05

o

利用时间序列分析软件

(

Short

Time-series

Expression

Miner

,

STEM)

分析差异表达

RBPs

动态表达模式

，

基因簇最大数目设置为

50

o

利用

ClusterProfiler

工具包对

6

种类型生精细胞中

差异表达的

RBPs

分别进行

GO

(

Gene

Ontology

)

功

能富集分析

(P.

adjust<0.

05)

。

1.2.4

RBPs

共表达调控网络分析:

WGCNA

(

Weighted

Gene

Co-Expression

Network

Analysis)

称为

加权基因共表达网络分析

，

通过计算基因间表达关系

鉴定表达模式相似的基因模块

(Module,ME)

,

位于同

一模块的基因共表达程度较高并且具有相似的调控

作用

。

利用该方法分析

RBPs

在精子发生中的共表

达网络

，

算法软阈值设置为

22,

其他为默认参数

。

2

结果

2.1

RBPs

在精子发生中的阶段特异性及动态表

达模式

目前小鼠物种

RBPs

的数目预计为

1

913

个⑺

。

基于

6

种类型生精细胞的全转录组测序数据分析

RBPs

在精子发生过程的全局转录图谱

，

结果显示,

在这

6

种类型生精细胞中共检测到

1

835

个

RBPs

李凯全转录组测序分析精子发生中

RNA

结合蛋白质的动态表达

(FPKMM1)(

图

1A)

。

根据差异基因筛选标准进一

827

异表达

RBPs

主要富集在核糖核蛋白复合物生成

(

ribonucleoprotein

complex

biogenesis)

和核糖体生成

(

ribosome

biogenesis

)

等(图

2D

)

；

rST

特异表达

RBPs

主要

富集在

RNA

代谢

(

mRNA

metabolic

步在精子发生中鉴定了

519

个阶段相对特异表达的

RBPs

,

其在

priSG-A

、

SG-B

、

plpSC

、

pacSC

、

rST

和

elST

中的数目分别为

71

、

102

、

97

、

134

、

80

和

35

个

，

其中

减数分裂时期

(

plpSC

与

pacSC)

的

RBPs

比例最高

(44.5%),

有丝分裂时期

(

priSG-A

与

SG-B)

RBPs

process)

和翻译

(

regulation

of

translation)

等(图

2E)

；

elST

特异表达

RBPs

主要富集在

RNA

翻译

(

regulation

of

translation)

和

RNA

代谢

(

mRNA

meta

­

比例次之

(

33.

3%)

，

精子形成时期

(

rST

与

elST)

的

RBPs

比例最低

(22.

2%)

0

STEM

软件分析结果显

bolic

process)

(

图

2F)

o

示阶段特异表达的

RBPs

在精子发生中主要具有

7

种动态表达模式

(Cluster

1-7)

(图

IB)

。

2.3

RBPs

在精子发生中的共表达网络分析

RBPs

在细胞发育过程中通常会形成互作复合

2.2

RBPs

在精子发生中的潜在调控作用

为了进一步预测

RBPs

在精子发生中的潜在调

体与

RNA

互作并操控

RNA

命运和功能

，

因此鉴定

RBPs

共表达模式将有利于进一步发现其在精子发

控作用

，

分别对阶段特异表达的

RBPs

进行

GO

功能

富集分析

(

P.

adjusKO.

01)

o

结果发现

priSG-A

特异

表达

RBPs

主要富集在

RNA

剪接

(

RNA

splicing)

和

mRNA

加工

(mRNA

processing)

等(图

2A)

；

SG-B

特

生中的重要调控作用

。

利用

WGCNA

分析阶段特异

表达

RBPs

在精子发生中共表达调控网络,结果共

获得

5

个共表达基因模块

(ME

1-5)

，

并计算各模块

间的关联性(相关系数

＞0.

9)(

图

3A)

。

根据

RBPs

之间的表达量进行聚类绘制得到

RBPs

共表达调控

异表达

RBPs

主要富集在核糖核蛋白复合物生成

(

ribonucleoprotein

complex

biogenesis)

和核糖体生成

(

ribosome

biogenesis

)

等(图

2B

)

；

plpSC

特异表达

RBPs

主要富集在

RNA

剪接

(

RNA

splicing

)

和

网络

，

这

5

个共表达基因模块内的

RBPs

数量分别

为

285

、

145

、

219

、

77

和

76

个(图

3B)

。

将关联性得

分最高的

RBPs

作为某一

RBPs

的潜在共表达对象,

取站去掉重复后共获得

246

个共表达

RBPs

。

STEM

mRNA

加工

(

mRNA

processing

)等(图

2(^)

；

pacSC

特

丹

：

一

clusier

1

8~

r

2

o

cluster

7

A.

heat

map

showing

global

transcriptional

profile

of

RBPs

in

spermatogenesis

;

B.

STEM

showing

the

stage

specificity

and

dynamic

expression

pattern

of

RBPs

in

spennatogenesis

图

1

RBPs

在精子发生中的阶段特异性及动态表达模式

Fte

1

St^e

specificity

and

dynamic

expression

pattern

of

RBPS

in

spermatogenesis

828

基础医学与临床

enridied

GO

terms

of

KBPs

in

priSG-A

RNA

spiking

ceD

junciioi)

orgaiiiiatiun

inRNA

procxasiTkg

alicmarivc

mRNA

splicing

Basic

&

Clinical

Medicine

2021.41(6)

eriched

GO

lerins

of

RBPs

in

SG-B

libonuclcopioiciji

complex

biogenesis

ribasome

biogenesis

rRNA

processing

rRNA

metabolic

process

ncRNA

procMsing

ncRN

A

abo

I

ic

amide

mc^bolic

process

regulation

of

traiislatiuii

libunudcOprutciu

cumplcx

cell

junction

assembly

regulaiioi]

of

RNA

stailiiy

Dciiron

prcjjtuziEtHi

exicrision

RNA

caiabolic

process

cell-subs

：

hesion

P.

acljusl

5.0e-06

2.0e-05

nbosmal

small

subunii

biogenesis

nhanudcoprntcin

complex

assembly

RNA

splicing

niRNA

splicing

via

splicrosonic

iii

RNA

piucrssiiig

A

enriched

GO

terms

of

RBPs

in

plpSC

RNA

splicing

mRNA

processing

0

10

20

B

30

enriched

GO

icrms

ofRBPs

in

pacSC

ribomtdeoprotein

complex

biogenesw

rihoxomc

biogaicsis

ncRN/V

processing

ncRNA

nirtabolic

prucr&s

ribonudeoprotciis

assembly

libonu

cl

cop

rotein

organ

izaiion

rRNA

rticiabolic

process

RNA

splicing

via

訂

■anscsicrificaikH

、

mRNA

splicing

spliceosomc

regulation

of

mRNA

metaboEc

process

regulation

of

RNA

splicing

P.

adjusi

P,

adjust

-0.000

25

spliceo&omal

complex

assembly

legiilation

of

mRNA

piocessing

cellulai-

amide

metabolic

process

regulation

of

iranskiion

cellulai

response

10

oxidative

stress

*

regulation

of

mitotic

cell

cycle

I

0

0.000

75

ribosome

assembly

mRNA

processing

ribosomal

laige

subunii

biogenesis

protriri

lucalizatiun

to

dironiosornc

rib

on

udropro

tcin

complex

expon

I

0

5

3.0e-€5

9.0c-05

5

10

C

15

10

D

15

20

enriched

GO

terms

of

RBPs

in

rST

regulation

af

niRNA

metabolic

process

regulation

of

translation

enriched

GO

terms

of

RBPs

in

clS

T

regulatian

of

traii^iatiun

reguhtian

of

niRNA

metabolic

process

cellular

amide

metabolic

process

nhomiclcoproicin

complex

k

：

—

—

:

s

niRNA/-adjust

proieiti

localizaiion

of

nucleus

i

ju

deucytopla^iiiic

transport

rcguhticiti

nf

mRNA

processing

RNA

splicing

regulation

of

nucleoc

)

»iaplasmic

transport

positive

regulation

of

translation

regulation

of

mRNA

catabolic

process

cellular

amide

metabolic

process

rcgiilaiion

c

「

mRNA

catabolic

process

heterocycle

catabolic

process

P.

adjust

P.

adjiisi

mRNA

catabolic

process

inRNA

procxAsing

I

0

5

10

15

2.0e-05

0.000

5

6.

0cT5

C.002

0

RNA

catabolic

process

RNA

splicing

regulation

of

niRNA

stability

regulation

of

RNA

stability

F

A-F.

enriched

GO

terms

of

stage-specific

RBPs

in

priSG-A

,

SG-B

,

plpSC

,

pacSC

,

iST

and

elST

图

2

阶段特异表达的

RBPs

在精子发生中的

GO

功能富集分析

Fig

2

GO

enrichment

analysis

of

st^e-spedfic

RBPs

in

spermatogenesis

module-trait

relationships

MEI

ME2

ME3

MEI

ME5

2

0

-2

B

A.

heatmap

showing

the

correspondence

between

co-expression

modules

;

B.

heatmap

showing

WGCNA

analysis

of

RBPs

;

C.

heatmap

showing

the

dynamic

expression

pattern

of

RBPs

co-expression

in

spermatogenesis

图

3

RBPS

在精子发生中的共表达网络分析

Fig

3

WGCNA

analysis

of

RBPs

in

spermatc^enesis

李凯全转录组测序分析精子发生中

RNA

结合蛋白质的动态表达

829

软件分析结果显示这些共表达

RBPs

在精子发生中

主要具有

7

种动态表达模式

(

Cluster

1-7)

，

每一种

生成

(

ribosome

biogenesis

)

和翻译调控

(

regulation

of

translation)

等(图

4D)

°

表达模式内的

RBPs

数目分别为

19

、

28

、

45

、

36

、

21

、

30

和

26

个

，

其中减数分裂时期

(

Cluster

3

-

5)

共表

3

讨论

根据分子生物学中心法则

，

以往被视为遗传信

息传递中间站的信使

RNA

(mRNA)

其实具有远超

达

RBPs

比例最高

(49.

8%)

，

精子形成时期

(

Cluster

6

-

7)

共表达

RBPs

比例次之

(27.

3%)

，

有丝分裂时

期

(Cluster

1

-

2)

共表达

RBPs

比例最低

(22.9%)

(图

3C)

。

人们所理解的转录后调控方式

，

例如

mRNA

选择性

剪接

、

编辑、

运输和翻译等

，

而这些调控方式主要是

2.

4

共表达

RBPs

在精子发生中的潜在调控作用

由

RBPs

介导完成

，

最终引起相应的基因表达变化

。

本研究系统描绘了

RBPs

在精子发生中的动态表达

利用

GO

功能富集分析预测共表达

RBPs

在精

子发生中的潜在调控作用

(

P.

adjust

<0.

05)

o

priSG-

A

共表达

RBPs

数量较少

，

并未富集到明显的

GO

功

全貌

、

阶段特异性及协同表达模式

，

并对其潜在功能

进行了预测

。

基因表达的转录后调控对于维持精子发生的正

能条目

。

SG-B

共表达

RBPs

主要富集在核糖核蛋

白复合物生成

(

ribonucleoprotein

complex

biogenesis

)

常进行至关重要

［

⑵

。

精子发生早期阶段基因转录

异常活跃

，

大量

mRNA

被转录生成后

，

可与

RBPs

相

互作用形成

mRNP

复合物进行存储,在精子发生后

和核糖体

RNA

代谢

(rRNA

metabolic

process)

等(图

4A)

；

plpSC

共表达

RBPs

主要富集在

RNA

剪接

(

RNA

splicing)

和

mRNA

加工

(

mRNA

processing)

等

期阶段由于染色质高度压缩

，

基因转录活性逐渐降

(

图

4B)

；

pacSC

共表达

RBPs

主要富集在蛋白质定

位

(

protein

localization

)

和核糖核蛋白复合物生成

(

ribonucleoprotein

complex

biogenesis

)

等(图

4C

);

低

。

然而

，

为了维持生精细胞的正常发育

，

早期转录

并存储的

mRNA

在此时开始进行翻译

，

该现象称为

“

转录-翻译

”

解偶联问。

目前

，

在精子发生中已发

现部分

RBPs

在转录后水平发挥关键的基因调控作

rST

和

elST

共表达

RBPs

表达模式较为相似

，

作为

一个基因集进行

GO

富集分析

，

主要富集在核糖体

用

［

g

］

。

中科院生化与细胞研究所刘默芳教授团队

enriched

GO

Lerms

of

RBPs

co-expressio]i

orSG-B

ribonuclcoprotcin

complex

biogenesis

rRNA

metabolic

process

riRosome

biogenesis

ncRNA

metabolic

process

rRNA

proves

shig

ncRNA

processing

mRNA

splicing

vis

spliccosomc

RNA

3-end

processing

rRNA

methylation

cleavage

involved

in

RNA

processing

0

enriched

GO

tenns

of

RBPs

co-expression

of

plpSC

RNA

splicing

mRNA

processing

P,

adjust

RNA

splicing

transeLerificaiion

reactions

P.

adjust

1

0.002

().006

RNA

splicing

vix

iransetenfication

reactions

0.004

wkh

bulged

adenosine

as

nucleophile

mRNA

splicing

via

spliceosome

1

0.003

0JJ05

0.001

altcmadve

mRNA

splicing

via

spliceosonie

cell

death

in

response

to

oxidative

stress

2.5

5.0

7.5

A

enriched

GO

leans

of

RBPs

co-expression

of

pacSC

enriched

GO

terms ol

RBPs

co-expression

of

亡

1ST

P.

aeljust

1

0.002

0.004

0.006

A-D.

enriched

GO

terms

of

RBPs

co-expression

in

SG-B

,

plpSC

,

pacSC

,

rST

and

elST

图

4

共表达

RBPs

在精子发生中的

GO

功能富集分析

Fig

4

GO

enrichment

analysis

of

RBPs

co-expression

in

spermatogenesis

830

基础医学与临床

Basic

&

Clinical

Medicine

2021.41(6)

发现

MIWI/piRNA

通过与翻译起始因子

eIF3f

及

AU-rich

元件结合蛋白

HuR

等相互作用

，

激活生精细

胞

mRNA

的翻译并调控生精细胞发育⑼

。

本研究发

现

RBPs

在精子发生过程呈现阶段特异性表达

，

并且

在早期阶段

（

例如

priSG-A

、

SG-B

及

plpSC

）

主要参与

调控

mRNA

加工

、

选择性剪接或稳定等过程

，

而在后

期阶段

（

例如

rST

及

elST

）

主要参与调控核糖体组装

或

mRNA

翻译等过程

，

提示这些阶段特异表达的

RBPs

在生精细胞发育过程发挥了重要调控作用

，

并

为精子发生中的

“

转录-翻译

”

解偶联提供了潜在分子

参考文献

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基础

。

此外,

RBPs

在细胞内经常以共表达形式存在

并能驱动靶标

mRNA

的协同表达

，

进而调控细胞分化

或组织发育

。

本研究发现

RBPs

在精子发生过程具

有明显的共表达特征

，

并主要参与

mRNA

代谢

、

mRNP

组装或翻译等过程

，

提示精子发生中共表达的

RBPs

是操控

RNA

命运和功能的潜在重要参与者

。

然而,这些共表达的

RBPs

需要在细胞和动物水平进

行分子生物学验证

，

深入解析

RBPs

与

RNA

的相互作

用机制

、

生化特征及生理功能可为理解

、

诊断和治疗

男性不育相关疾病提供新的线索

。

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