2023年7月17日发(作者：)

作物学报

ACTA

AGRONOMICA

SINICA 2009, 35(7): 1217−1228

ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9

/zwxb/

E-mail: xbzw@

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01217

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

琚 铭 王海棠 王立科 李飞飞 吴慎杰 朱华玉 张天真 郭旺珍*

南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095

摘 要: 以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料, 研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系, 为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量, 结果表明, 虽然遗传背景完全不同, 但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达; GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达; 而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示, GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关, 其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关, 而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关, 与伸长率呈极显著正相关; GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关; GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关; GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关; GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关, 与马克隆值呈显著负相关, 在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关, 与伸长率达到极显著正相关, 与比强度呈显著负相关, 与长度和整齐度呈极显著负相关; GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。

关键词: 棉花; 纤维品质; 棉纤维发育相关基因; 荧光实时定量PCR

Associated Analysis between Temporal and Spatial Expression of Fiber Deve-

lopment Genes and Fiber Quality

JU Ming, WANG Hai-Tang, WANG Li-Ke, LI Fei-Fei, WU Shen-Jie, ZHU Hua-Yu, ZHANG Tian-Zhen, and

GUO Wang-Zhen*

National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract: Ten genes expressed preferentially in fiber development period reported previously and 14 cotton cultivars (strains)

with distinctly different fiber quality were selected in this paper. To test the relative expression values of the genes in six different

fiber developmental stages, 0 day post anthesis (DPA), 5DPA, 10DPA, 15DPA, 20DPA, 23DPA, by real-time quantitative RT-PCR

(qRT-PCR), and the data of fiber qualities from 14 cotton varieties (strains). The expression profile showed that GhExp1,

GhCIPK1, GhSus1, GhSusA1, and GhPL genes were expressed preferentially during fiber elongation; GhACT1, GhRacA, and

GhRacB genes all had high expression level in earlier stage of fiber elongation and the thickening period of secondary cell wall.

Two cellulose synthase genes (GhCelA1 and GhCelA3) were expressed predominantly during late stage of fiber elongation and the

thickening period of secondary cell wall. For most genes, the expression value in low expression level period had significant cor-relation with fiber quality, while no significant correlation was detected in preferential expression stage of these genes with an

exception of GhRacA gene. The expression level of GhExp1 in 20DPA fiber of 14 cotton varieties (strains) had a significant nega-tive correlation with fiber strength and uniformity and a significant positive correlation with fiber elongation percentage; the ex-pression level of GhPL gene in 23DPA had a significant negative correlation with fiber length; the expression level of GhRacA

gene in 5DPA and 23DPA both had a high significant positive correlation with fiber elongation percentage; the expression level of

GhRacB gene in 10DPA had a significant negative correlation with fiber length and uniformity; the expression level of GhCelA1

gene in 5DPA had a significant positive correlation with fiber length and a significant negative correlation with micronaire value;

the expression level of GhCelA1 gene in 10DPA had a significant negative correlation with fiber length, a significant positive cor-

本研究由国家自然科学基金重点项目(30730067)，国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z111)，教育部111项目(B08025)资助。

*通讯作者(Corresponding author):

郭旺珍, E-mail: moelab@

Received(收稿日期): 2008-10-10; Accepted(接受日期): 2009-03-20. 1218

作 物 学 报

第35卷

relation with micronaire value, and a high significant correlation with fiber elongation percentage; the correlation between the

expression levels of GhCIPK1, GhACT1, GhSus1, GhSusA1and GhCelA3 gene and fiber quality indexes had not been detected.

Keywords: Cotton; Fiber quality; Genes related with fiber development; Real-time quantitative RT-PCR

棉花纤维是一种重要的天然纺织材料。但是随着纺织工业的发展, 对棉纤维的长度、强度、整齐度等方面都提出了更高的要求。因此, 通过分析棉纤维发育相关基因时空表达调控与棉纤维品质形成关系可为研究棉纤维发育机理和改良纤维品质提供重要的理论基础[1]。

前人已从棉花中分离了许多棉纤维发育相关基因。Harmer等[2]从陆地棉基因组文库中筛选出6个α-expansin基因序列, 有4个(GhExp1、GhExp2、GhExp4和GhExp6)在伸长的纤维细胞中表达, 其中GhExp1在纤维细胞伸长发育期特异表达, 它的表达高峰出现在6DPA, 在20DPA后开始下降; Gao等[3]鉴别出一些在纤维细胞中优先或特异表达的基因,

其中一个被命名为GhCIPK1, 进一步研究发现该基因包含CIPK蛋白的特征区域, 并且在纤维伸长阶段高表达, 其基因产物是一个功能蛋白激酶; Li等[4]将棉花肌动蛋白基因依据在不同组织中的表达差异分为4组, 其中一组是以GhACT1为代表的,

GhACT1在纤维细胞中优势表达, 对棉花纤维的伸长起着重要的作用, 但对棉纤维的起始无作用; 郭媖[5]首次在棉花中克隆出果胶裂解酶(pectate lyase,

GhPL)基因, 它在根、茎、叶中都不表达, 仅在纤维发育细胞中表达, 是一个棉纤维特异表达基因; 李先碧等[6]从棉花纤维中扩增并克隆了2个棉花Rac蛋白的cDNA 序列, 分别命名为GhRacA和GhRacB,

推测2个基因在棉花纤维的早期发育中可能有重要的功能; Ruan等[7]从棉纤维中分离出一个编码蔗糖合酶的全长cDNA(GhSus1), 该基因可能在纤维发育中有重要作用, 在2006年本实验室克隆了另一个属于蔗糖合酶家族的基因GhSusA1(未发表); Pear等[8]筛选出GhcelA1和GhcelA2在次生壁纤维素合成活跃期高量表达的两个基因, 而Laosinchai等[9]也已经分离出第3个棉花纤维素合成酶基因GhcelA3。上述基因均在纤维发育时期优势或特异表达, 但多数基因在纤维发育过程中的确切功能尚不清楚, 纤维发育相关基因与棉纤维品质的关联关系也少见报道。

实时荧光定量PCR准确和灵敏度高, 不要求扩增后电泳等处理, 可以节省时间, 有效消除实验室PCR 产物紫外检测带来的污染, 是研究基因表达定量分析的一种有效快捷方法[10]。

本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了10个棉纤维发育相关基因在不同棉花材料中的表达趋势, 以及这些基因时空表达与纤维品质的相关性。以期研究基因的表达与纤维品质形成的关系, 进而为揭示棉纤维发育的复杂分子调控机制并将之应用于棉纤维品质遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 棉花材料

根据近几年我室棉花资源材料的纤维检测结果,

选取14个纤维品质不同的棉花品种或品系, 即海7124(H7124)、7235、J415、PD6992、HS427, 渝棉1号(YM1)、TM-1、泗棉3号(SM3)、川棉56(CM56)、

新陆早2号(XLZ2)、湘棉11(XM11)、石短5号(SD5)、

01525和01533。其中海7124为海岛棉, 其余为陆地棉。将所有材料种植于南京农业大学江浦试验站。分别取0DPA和5DPA的胚珠和纤维混合物, 10DPA、15DPA、20DPA和23DPA的纤维作为研究材料。由于所选材料01525和01533结铃性较差, 没有取到这两个材料15DPA的纤维。

1.2 基因来源及荧光定量PCR引物合成

10个在纤维发育过程中优势表达的基因中, 9个从已经报道的棉纤维发育相关基因中选取, 1个编码蔗糖合酶是本实验室克隆的。

10个基因的相关信息及用于定量分析的特异引物被列于表1。利用这10个基因cDNA序列设计的引物符合荧光定量PCR 检测反应特异性要求。所用内参基因为真核生物中组成性表达的EF1a基因,

正向引物为5′-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-

3′(Y347F); 反向引物为5′-CCACCAATCTTGTACA

CATCC-3′(Y347R), 所有引物由上海英骏公司合成。

1.3 实时荧光定量PCR

用CTAB法提取14个棉花品种(或品系)胚珠和纤维混合物0DPA和5DPA的RNA[11], 用改进的热硼酸法提取10DPA、15DPA、20DPA、23DPA纤维的RNA[12], 用Dnase I消化DNA, 反转录成cDNA。各cDNA样品分别利用各对应基因和EF1α基因引物进行定量PCR反应且每个反应重复3次, 荧光种类为SYBR Green1(原液稀释1 000倍后使用), 反应体系为25 μL含cDNA模板1 μL, 10×PCR buffer 2.5 第7期

琚 铭等: 棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

表1 基因名称及荧光定量PCR所用的引物

Table 1 Gene and qRT-PCR primers used in this study

1219

基因名称

Gene name

登录号

Accession number

参考文献

Reference

引物序列

Primer sequences

引物编号

Primer number

GhExp1

AF043284

Harmer et al., 2002[2] F: 5′-CTGCCCATGCCACCTTCTAC-3′

R: 5′-GCACTTGCTCGCCTATTTCA-3′

Li et al., 2005[4] F: 5′-CATCCTCCGTCTTGACCTTG-3′

R: 5′-ACTTCCCGCACATAAACCAG-3′

Gao et al., 2007[3] F: 5′-ATGGTATGGCTTTGGAGGTG-3′

R: 5′-GCTTCGTACCCTTTGTTGAG-3′

Li et al.,2005[6] F: 5′-ATGAATCCGCACCCTCTAAG-3′

R: 5′-TGTACGCAATATCCAAACCC-3′

Li et al.,2005[6] F: 5′-GTTGTAGGTGGTGATAGGCG-3′

R: 5′-ACCGTTACAGGTTGCGAATG-3′

Ruan et al., 1998

[7] F: 5′-GACCAGACCGCTGAACTCCT-3′

R: 5′-CCTCGCAATCAACCAGAACC-3′

Y3023

GhACT1

AY305723

Y3024

GhCIPK1

EF363689

Y3026

GhRacA

DQ667981

Y3027

GhRacB

DQ315791

Y3028

GhSus1

U73588

Y3029

GhSusA1

No accession

No publication

F: 5′-CAACAATAAACAGCCAAGGG-3′

R: 5′-GCCGAGGTTGTAATCGTCAT-3′

Y3030

GhCelA1

GHU58283

Pear et al., 1996[8] F: 5′-ACAAGTAACAAGTTCCCGACAG-3′

R: 5′-TTAGCATCCGAATTAAAGCGTA-3′

Laosinchai et al., 2000[9] F: 5′-CCCTGGTGTTCCGATAGTTCTT-3′

R: 5′-CTGGCAGTTGGTTCCATCTTTT-3′

Guo et al., 2005[5] F: 5′-TTGTTGCCTCTACACTTATGG-3′

R: 5′-AGAACTTTGAGAAGCCCTTG-3′

Y3033

GhCelA3

AF150630

Y3034

GhGhPL

DQ073046 Y3058

μL, 10 mmol L−1

dNTP 0.5 μL, 25 mmol L−1

MgCl2

1.5

μL, 10 μmol L−1

Primer F 1 μL, 10 μmol L−1

Primer R

1 μL, SYBR Green1稀释样1 μL, 5 U μL−1

rTaq

polymerase 0.2 μL, ddH2O 16.3 μL。在荧光定量PCR仪(iQ5型, BIO-RAD, USA)上完成测定。

以最小的样本阈值循环数(Ct值)和最高的荧光值为标准。扩增程序为95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 55℃ 30

s; 72℃ 30 s, 40个循环; 72℃下延伸5 min。反应完成后, 得到所有样本的记录点曲线, 默认分析模式称为background substrated, 选择PCR base line

substrated 模式进行数据分析。

用公式2–ΔCt计算出每个基因在14个棉花品种(或品系) 6个发育时期的相对表达量。采用相对定量2–ΔCt[13]分析基因表达量。即分别测定目的基因和参比基因的Ct值, 再求出相对于参比基因的目的基因的相对量, 最后再进行品种间相对量的比较。

各指标进行Pearson双尾相关性分析。分析软件为SPSS 16.0。

2 结果与分析

2.1 10个基因在不同棉花品种(或品系)中的表达谱

在不同棉花品种(或品系)中, GhCIPK1有两种表达谱(图1), 一种是在5DPA表达量达到最高, 另外一种是在10DPA表达量达到高峰, 同时在一些棉花品种中在23DPA也有相对高的表达。总体来说是纤维伸长期优势表达基因。GhACT1在10DPA和23DPA都有较高的表达水平, 而在其他3个时期的表达相对较低。说明该基因在纤维伸长期和次生壁加厚期优势表达(图2)。GhSus1和GhSusA1两个基因都出现两种趋势(图3和图4)。GhSus1基因在纤维伸长早期和次生壁加厚期优势表达; GhSusA1的表达优势主要集中在0~5DPA。GhCelA3在伸长后期至次生壁加厚期优势表达, 在15DPA和23DPA出现两个表达高峰(图5)。

GhExp1在7235、TM-1、新陆早2号、石短5号、湘棉11、J415和泗棉3号中于5DPA、15DPA出现表达高峰; 在其余品种(或品系)中于10DPA出现表达高峰(图6)。由此可以看出GhExp1基因在纤维发育伸长阶段优势表达, 但在不同遗传背景下其表达高峰存在于不同发育时期。GhPL的表达谱有两种(图7), 第1种趋势是在5DPA达到表达高峰; 第2种是在10DPA 时有相对高的表达, 说明此基因在

1.4 14个棉花品种(或品系)纤维品质检测分析

收获14个棉花品种(或品系)株行吐絮期中部铃籽棉样品, 送中国农业科学院棉花研究所农业部棉花品质监督检验测试中心进行纤维品质HVI900

(ICC标准)测试。每个样品重复3次。

1.5 多重比较及相关性分析

对14个棉花品种(或品系)的纤维长度、比强度、马克隆值、伸长率和整齐度各指标在1%水平上进行多重比较; 对于每一个基因, 以14个棉花品种(或品系)每个时期的相对表达量与对应的成熟纤维品质1220 作 物 学 报

第35卷

纤维伸长的早期优势表达。GhRacA在10DPA和23DPA纤维中有相对高的表达; 从整体上看GhRacA基因在纤维伸长的前期及次生壁增厚期较其他时期有高的表达水平(图8)。GhRacB高表达集中在起始期至伸长的前期和次生壁加厚期(图9); 在7235中5DPA表达量最高, 15DPA和23DPA也有较

图1 GhCIPK1在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 1 Expression profile of GhCIPK1 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

图2 GhACT1在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 2 Expression profile of GhACT1 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

图3 GhSus1在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 3 Expression profile of GhSus1 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

图4 GhSusA1在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 4 Expression profile of GhSusA1 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA 第7期 琚 铭等: 棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析 1221

图5 GhcelA3在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 5 Expression profile of GhcelA3 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

图6 GhExp1在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 6 Expression profile of GhExp1 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

图7 GhPL在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 7 Expression profile of GhPL in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

高的表达; 在新陆早2号15DPA的表达量最高。GhCelA1在伸长后期至次生壁加厚期优势表达, 在15DPA和23DPA 达到两个表达高峰(图10), 但是总体上GhCelA1的表达量明显高于GhCelA3。

因为没有取到01525和01533这两个材料15DPA的纤维, 所以图1至图10中缺少10个基因在这两个材料纤维发育15DPA的相对表达量。

2.2 14个棉花品种(或品系)纤维品质检测分析

根据14个棉花品种(或品系)的纤维品质测定结果, 选择纤维长度、比强度、马克隆值、伸长率和整齐度5个指标对14个棉花品种(或品系)纤维品质在1%水平上进行差异显著性分析(表2)。

从多重比较结果可知, 按照差异的显著性, 14个品种(或品系)在纤维长度和伸长率上有5个差异水平, 在比强度上有4个差异水平, 在马克隆值上有3个差异水平, 而在整齐度上呈现2个差异水平。

2.3 10个基因与棉纤维品质各指标的相关性分析

对10个基因在14个棉花品种(或品系)不同发育时期的表达量和相应的棉纤维品质指标相关性分析

1222

作 物 学 报

第35卷

图8 GhRacA在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 8 Expression profile of GhRacA in 0DPA, 5DPA, 10DPA, 15DPA, 20DPA, and 23DPA

表明, 检测到伸展蛋白基因(GhExp1)、果胶裂解酶基因(GhPL)、RacA蛋白基因(GhRacA)、RacB蛋白基因(GhRacB)和纤维素合酶基因(GhCelA1)有相关性,

与纤维长度相关的基因是GhPL、GhRacB 和GhCelA1; 影响纤维比强度的基因是GhExp1和GhCelA1; 对马克隆值有影响的基因是GhCelA1; 与纤维伸长率相关的基因是GhExp1、GhRacA和GhCelA1; 与纤维整齐度相关的基因是GhExp1、GhRacB 和GhCelA1。未检测到GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhcelA5个基因的表达和纤维品质相关。

2.3.1 伸展蛋白基因(GhExp1)与棉纤维比强度、整齐度和伸长率的关系 GhExp1与纤维比强度、整齐度和伸长率均显著相关, GhExp1在20DPA表达量与纤维比强度、伸长率和整齐度的相关系数为–0.590*、0.772*和–0.557*。即GhExp1基因在20DPA的高表达引起了棉纤维比强度和整齐度变差, 而使伸长率变大(图11)。说明成熟纤维的比强度、整齐度和伸长率性状的形成对于纤维发育20DPA时GhExp1基因表达量是敏感的。

2.3.2 果胶裂解酶基因(GhPL)与长度的关系

GhPL在23DPA的表达量与纤维长度的相关系数为–0.569*, 呈显著负相关。在长度较长的品种(品系)其纤维发育23DPA时, GhPL基因的表达量较低(图12)。说明在23DPA GhPL基因的低表达对纤维长度的形成有利。

2.3.3 棉花Rac蛋白基因(GhRacA和GhRacB)与伸长率、整齐度和长度的关系 GhRacA在5DPA表达量与纤维伸长率的相关系数为0.524**, 在23DPA的相关系数为0.525**, 均呈正相关。而在纤维发育的其他时期与纤维品质没有显著相关性。从图13可以看出, 在大部分的棉花品种或品系中, GhRacA基 第7期

琚 铭等: 棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析 1223

图10 GhcelA1在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 10 Expression profile of GhcelA1 in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

因的相对表达量较集中且与纤维伸长率呈正相关。

对于具有最大伸长率的材料, GhRacA基因在5DPA和23DPA的表达量达到最高。GhRacB在10DPA的表达量与纤维长度和整齐度的相关系数分别为–0.683*和–0.560*。从图14看出, GhRacB的表达特

图9 GhRacB在0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、23DPA的表达谱

Fig. 9 Expression profile of GhRacB in 0DPA, 5DPA, 10DPA,

15DPA, 20DPA, and 23DPA

表2 14个棉花品种(或品系)棉纤维长度、比强度、马克隆值、伸长率和整齐度差异显著性检测

Table 2 Analysis of significant difference for fiber length, strength, micronaire value, elongation rate, and uniformity in

14 varieties (or strains) in cotton

长度

Length (mm)

H7124

7235

J415

PD6992

SD5

TM-1

HS427

YM1

SM3

CM56

XLZ2

XM11

01525

01533

34.29±0.36 A

31.91±0.95 B

31.53±0.85 B

30.51±0.38 BC

29.48±0.70 C

29.13±0.94 C

28.81±0.61 CD

28.39±0.68 CD

28.31±0.19 CD

27.53±0.36 CD

27.26±0.51 D

26.97±0.57 D

22.17±0.62 E

21.04±0.51 E

比强度

Strength (cN tex−1)

J415

7235

YM1

H7124

HS427

PD6992

TM-1

SD5

SM3

XLZ2

XM11

CM56

01533

01525

40.95±0.05 A

38.75±0.59 AB38.57±0.83 AB37.25±0.93 B

35.64±0.91 B

34.36±0.81 B

28.94±0.95 C

28.21±0.17 CD28.20±0.30 CD27.41±0.84 CD27.07±0.81 CD24.80±0.20 D

22.95±0.25 D

21.05±0.32 D

马克隆值

Micronaire value

01533

01525

XM11

TM-1

CM56

SM3

HS427

YM1

XLZ2

J415

7235

SD5

PD6992H7124

5.53±0.06 A

5.24±0.15 A

5.20±0.20 AB5.20±0.14 AB5.05±0.13 AB4.97±0.06 AB4.81±0.37 B

4.74±0.18 B

4.67±0.06 BC4.40±0.22 BC4.30±0.10 C

4.20±0.01 C

4.16±0.18 C

4.07±0.07 C

伸长率

Elongation rate (%)

01525

01533

CM56

XLZ2

XM11

TM-1

SD5

SM3

H7124

PD6992YM1

HS427

7235

J415

14.25±0.98 A

11.35±0.96 B

8.3±0.96 C

6.6±0.62 CD

6.53±0.45 CD

6.33±0.38 CD

6.15±0.35 CD

5.80±0.38 D

5.73±0.15 DE

5.00±0.01 DE

4.70±0.42 DE

4.47±0.47 DE

4.20±0.14 DE

3.95±0.21 E

整齐度

Fiber uniformity (%)

H7124

7235

TM-1

HS427

J415

YM1

SM3

PD6992

XLM2

SD5

CM56

XM11

01525

01533

86.13±0.92 A

85.73±1.17 A

85.63±0.50 A

84.90±1.23 AB84.78±1.71 AB84.68±1.23 AB83.70±1.49 AB83.25±1.20 AB82.98±1.19 AB82.43±1.40 AB82.10±1.53 B

81.98±1.07 B

79.78±2.23 B

79.73±0.54 B

H7124: 海7124; SD5: 石短5号; YM1: 渝棉1号; SM3: 泗棉3号; CM56: 川棉56; XLZ2: 新陆早2号; XM11: 湘棉11。数值后的大写字母不同表示在0.01水平上差异显著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.01 probability level.

1224 作 物 学 报

第35卷

图11 GhExp1 基因20DPA的表达水平与比强度、伸长率和整齐度的关系

Fig. 11 Relationship between expression level of GhExp1 gene

in 20DPA and fiber strength, fiber elongation percentage and

fiber uniformity

点和GhRacA具有相似性, 也出现了极端现象。在纤维长度最短的材料和纤维整齐度最差的材料中,

GhRacB基因在10DPA的表达量是最高的, 而且在纤维发育的其他时期与纤维品质无显著相关性。

2.3.4 棉花纤维素合酶基因(GhCelA1)与纤维品质各指标的关系 GhCelA1与纤维品质多项指标显著相关, GhCelA1在5DPA的表达量与纤维长度和马克隆值的相关系数为0.533*和–0.540*。亦即5DPA的高表达引起纤维长度的增加及马克隆值的降低;

在10DPA 的表达量与长度、比强度、整齐度、马克

图12 GhPL 23DPA的表达水平与长度的关系

Fig. 12 Relationship between expression level of GhPL in

23DPA and fiber length

图13 GhRacA基因5DPA和23DPA的表达水平与纤维伸长率的关系

Fig. 13 Relationship between expression level of GhRacA in

5DPA and 23DPA and fiber elongation percentage

隆值和伸长率的相关系数分别为–0.842**、–0.639*、–0.783*、0.541*和0.924**。10DPA的高表达导致纤维马克隆值和伸长率的增加以及长度、比强度和整齐度的降低(图15~图17)。推测GhCelA1在5DPA第7期 琚 铭等: 棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析 1225

和10DPA表达量对纤维品质的形成具有非常重要的影响; 然而, 此基因在优势表达时期的表达量对纤维品质无显著作用。

图14 GhRacB基因10DPA的表达水平与纤维长度和纤维整齐度的关系

Fig. 14 Relationship between expression level of GhRacB in

10DPA and fiber length and uniformity

3 讨论

棉纤维是由胚珠表皮细胞发育而成的, 经历起始期、伸长期(初生壁形成)、次生壁形成期和成熟期。徐楚年等[14]对陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉等胚珠细胞分化与伸长启动研究表明, 各棉种在纤维发育早期细胞形态变化基本相同。棉花纤维发育受遗传和环境两方面影响, 不同的棉花品种形成各自相应的纤维品质。多年来, 国内外许多棉花研究人员从遗传和环境两个方面探讨棉纤维形成机理及影响棉花纤维品质的因素[15]。本研究在尽量保证栽培条件一致的情况下, 选取了纤维品质具有差异的14个棉花材料, 重点研究了这些材料在纤维发育的6个时期(0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA和23DPA)

10个纤维发育相关基因的相对表达量与纤维品质的

图15 GhcelA1基因10DPA的表达水平与马克隆值和伸长率的关系

Fig. 15 Relationship between expression level of GhcelA1 in

10DPA and micronaire value and fiber elongation percentage

关系。由于不同棉花品种或品系存在纤维发育各个时期的时间差异, 开花至纤维成熟的过程不完全一致, 因此本研究涉及的6个纤维发育时期可能并未覆盖这10个基因在不同棉花材料中的最高/最低表达水平。我们发现, 在不同纤维品质的棉花材料中, 同一基因在同一纤维发育时期的相对表达量差异较大,

说明这些基因对于棉花纤维品质的形成具有重要的作用。

3.1 GhExp1基因对纤维品质形成的影响

通过棉纤维伸长期EST 数据库分析, 4个编码细胞膨胀素的基因在纤维细胞迅速伸长阶段表达水平较高, 在进入次生壁合成期后表达量迅速下降[16]。Expansin蛋白能够打断纤维素微丝间的氢键, 从而使细胞壁疏松延展。本试验也证明GhExp1基因在纤维伸长期优势表达, 但通过分析该基因表达与纤维品质的相关性, 发现GhExp1基因在纤维伸长期的表达量与纤维长度没有显著相关性, 而在20DPA

1226 作 物 学 报

第35卷

图16 GhcelA1 10DPA的表达水平与长度、比强度和整齐度的关系

Fig. 16 Relationship between expression level of GhcelA1 in

10DPA and fiber length, fiber strength and fiber uniformity

时的高表达导致比强度和整齐度的变差, 伸长率变大。在23DPA, GhExp1基因表达量下降的趋势已经稳定, 根据分析得知这个时期的表达水平与纤维品质的相关性不显著, 因此推测GhExp1基因从15DPA到20DPA表达量下降程度对纤维品质有影响。

3.2 GhPL基因对纤维品质形成的影响

果胶裂解酶又叫转移消除酶, 通常是由植物病原体组织分泌的, 并认为它是导致一些易腐植物细胞壁变软的因素[5]。本实验室于2006年首次从棉花中克隆出一个棉纤维特异表达的果胶裂解酶基因,

推测这个基因在棉花的发育中可能起松弛细胞壁,

促进棉纤维细胞伸长的作用[5]。本研究中GhPL基因在不同材料中的表达高峰均集中在纤维伸长早期,

但其表达水平与成熟纤维的纤维长度没有显著相关,

在GhPL基因表达量较低的23DPA其表达量与纤维

图17 GhcelA1基因5DPA的表达水平与纤维长度和马克隆值的关系

Fig. 17 Relationship between the expression level of GhcelA1

in 5DPA and fiber length and micronaire value

长度相关, GhPL基因在次生壁加厚期的高表达将导致纤维长度变短。其相关机理需进一步验证。

3.3 棉花Rac蛋白基因对纤维品质形成的影响

已有研究表明, 棉花纤维在开花前后突起并迅速伸长, 这一过程包括一系列的细胞和亚细胞变化,

同时也受到植物激素的精确调控。在这一发育进程中, 一些过程可能受Rac 蛋白控制, 如激素的信号转导、次生壁的定位合成、细胞骨架重排和细胞极性决定等。棉花Rac蛋白(Rac9和Rac13)在初生壁和次生壁合成的转换时期大量表达, 通过产生H2O2引发棉纤维的次生壁合成[17]。本研究中GhRacA和GhRacB在纤维伸长早期及次生壁加厚期优势表达。两基因的表达水平对成熟纤维的品质都有影响, 且都出现了极端的现象, 这种现象可能还需要更多的棉花品种做进一步的验证。虽然两基因都属于Rac

蛋白家族, 但对纤维品质的影响却不相同。可能原因是GhRacB蛋白与同源蛋白相比, 序列差异相对较大, 且在进化树中被分为单独的分支, 很可能GhRacB蛋白代表了Rac蛋白的一个新的亚组[6]。 第7期 琚 铭等: 棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析 1227

3.4 纤维素合酶基因对棉纤维品质形成的作用

本研究表明, 两个纤维素合酶基因都是在纤维伸长后期到次生壁加厚期优势表达, GhcelA1在纤维品质的形成中有着重要的影响, 该影响主要集中于纤维伸长的早期, 其基因表达量相对于其他时期最低, 但对纤维品质的影响却最大, 而在表达水平较高的时期与纤维品质并没有显著的相关性。作为同一家族的GhcelA3基因在各个时期的表达水平与纤维品质没有相关性, 对最终纤维品质的形成没有显著的影响。目前已有研究证明, 初生、次生细胞壁形成过程中, 纤维素的合成涉及不同的纤维素合酶[18]。Holland等[19]对棉花、杨树、拟南芥及玉米的纤维素合酶的比较研究表明, 这些酶本身的某些特异性序列决定其在初生或次生细胞壁中表达, 而并非单独由启动子决定。初生与次生细胞壁中的纤维素具有不同的特征, 比如聚合度(degree of polymeriza-tion), 其特征差异可能与不同的纤维素合酶有关[20]。根据我们的研究可以推断GhcelA1基因在纤维发育进程中起着非常重要的作用, 而且极显著地影响着纤维品质的形成。

4 结论

在14个棉花品种(品系)中, GhExp1、GhCIPK1、GhACT1和GhPL基因在纤维伸长期优势表达;

GhRacA在纤维伸长的前期及次生壁增厚期较其他时期有高的表达水平; GhRacB的高表达集中在起始期至伸长的前期和次生壁加厚期; GhSus1在起始和次生壁加厚期优势表达; GhSusA1的优势表达主要集中在0~5DPA这一时期。GhCelA1和GhCelA3基因在伸长后期至次生壁加厚期优势表达。GhACT1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA1基因的表达量与纤维品质没有显著的相关性; GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度显著负相关,

与伸长率极显著正相关; GhPL在23DPA的表达量与纤维长度显著负相关; GhRacA在5DPA和23DPA的表达量与伸长率极显著正相关; GhRacB在10DPA的表达量与纤维长度和整齐度显著负相关; GhCelA1在5DPA的高表达导致纤维长度的增加及马克隆值的降低, 在10DPA的高表达导致纤维马克隆值和伸长率的增加以及长度、比强度和整齐度的降低。

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