2023年7月17日发(作者：)

江苏医药2010年3月第36卷第6期　JiangsuMedJ,March2010,Vol36,No.6・669・・论著・ELK21miRNA干扰质粒构建及鉴定姚林华　李玉琴　马士杰　张国新【摘要】　目的　设计及构建ELK21微小干扰核糖核酸(miRNA)质粒,最终鉴定出有效干扰质粒。方法　设计及构建4对ELK21的pcDNATM6122GW/EmGFPmiRmiRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒,通过测序鉴定。将干扰质粒用脂质体法转染293T细胞,通过顺时转染获得细胞系。通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,RT2PCR检测4对干扰质粒、阴性对照质粒ELK21的mRNA的表达水平。结果　测序表明,ELK21干扰序列及读框完全正确,干扰质粒瞬时转染的293T细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光达90%以上。RT2PCR结果显示,MR22、MR23干扰质粒对ELK21mRNA有较好的抑制效果。结论　成功构建了ELK21干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究ELK21在肿瘤细胞中的作用提供参考。【关键词】　　ELK21;微小干扰核糖核酸【中图分类号】　R734　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　025323685(203ConstructionandidentificationofmiRNArecombinanteukaryoticexpressionvectorsofELK21　YAOLinhua,LIYuqin,MAShijie,mentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,CHINA【Abstract】　Objective　Ts　MicrointerferenceRNA(miRNA)nucletidesofELK21werechemicallysynthesizedandinsertedintopcDNATM6122GW/EmGFPmiRvector,whichwereconfirmedbysequencing,thentherecombins　SequencingsuggestedthatmiRNAieukaryoticexpressionvectorstargetingELK21possessecorrectreadframeandnucleotidesequence,andgreenfluoresceneofthetransienttransfected2PCRresultsshowedthattheseqsion　miRNAeukaryoticexpressionvectorstargetingELK21weresuccessfullyconstructedandtheeffectivelyinterferenceRNAwereidentified,whichmaybeusedforunderstandingtheeffectofELK21inthetumorcells.【Keywords】　　ELK21;miRNA[JiangsuMedJ,March2010,36(6):6692671.]　　转录因子ELK21作为ETS家族(得名于禽类白血病病毒基因E26)成员之一,虽然不像癌基因及抑癌基因一样与细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤形成有直接对位关系,但研究显示转录因子ELK21的磷酸化可能是恶性肿瘤发生发展的重要环节及细胞侵袭转移的调控通路[1]。目前发现促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在多种因素刺激下经过一系列MAPK信号通路磷酸化ELK21,引起ELK21构象α)的目前,在人肝癌细胞中发现蛋白激酶Cα(PKC表达会受到ELK21的调节,而PKC是信号传导分子家族中的重要成员,与细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生相关[2]。本研究拟采用微小干扰核糖核酸(miRNA)技术,通过设计针对转录因子ELK21的干扰序列,构建能在真核细胞中表达miRNA序列的载体,并导入293T细胞,筛选出特异性针对ELK21的干扰质粒,为进一步观察其转染到肿瘤细胞后对各种有针对的靶基因功能变化奠定实验基础。材料与方法一、材料11试剂　总RNA抽提试剂Trizol购自美国Invitrogen公司,RNA逆转录试剂盒、Taq酶、改变,从而增强各靶基因启动子区DNA结合活性,并激活转录活性,上调生长分化相关基因,抑制凋亡相关基因,已成为肿瘤基因治疗中的一个新靶点。　　基金项目:国家自然基金项目资助(30770992,30672397)作者单位:210029　南京医科大学第一附属医院消化病科责任作者:张国新　E2mail:guoxinz@・670・江苏医药2010年3月第36卷第6期　JiangsuMedJ,March2010,Vol36,No.6dNTPmix均为美国Fermentas公司产品,ELK21和β2actin引物有上海申能博彩公司合成。根据humanELK1基因序列2002设计并合成4对miRNA及1对无效miRNA干扰序列:MR21上游,TGCT2GAATGCTAGGAGGCAGCGAGCTGTTTTGG2CCACTGACTGACAGCTCGCTCTCCTAGCATT;MR21下游,CCTGAATGCTAGGAGAGCGAG2CTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCTCGCT2GCCTCCTAGCATTC;MR22上游,TGCTGAT2AGTAGTACCGCAAGMR22GCCCGGTTTTGGCCA2CTGACTGACCGGGCCTTGGTACTACTAT;合,按说明给出体系进行退火。然后将4份序列混合物在95℃加热5min,然后放置室温自然冷却20min,形成双链序列。(2)连接,将退火的双链序列继续稀释成10nM浓度,按说明给出体系在室温连接30min。(3)每个转化平板分别挑取3个克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的序列一致。21细胞培养　人胚肾细胞株293T复苏后于含10%的胎牛血清DMEM培养液中,37℃,5%CO2条下游,CCTGATAGTAGTACCAAGGC2件下培养。31转染　操作按Lipofectamine2000转染手册进行,具体步骤:(1)将状态良好,处于对数生长期的细胞用0125%胰酶,完全培养基悬浮成单细胞悬液,细胞计数后,按照每孔5×105个细胞接种于6孔板中;(2)补充完全培养液至2ml,细胞生长状态稳定并达到细胞贴壁覆盖率70%～80%左右时,进行转染实验;(3)用无血清DMEM轻洗孔底细胞2次,加入115mlDMEM;(4)分别用250μlDMEM稀释4μg干扰质粒MR21、MR22、MR23、MR24以及阴性对照质粒,轻轻混匀;(5)用250μlDMEM稀释10μlLipofectamine2000试剂,轻轻混匀,室温孵育5min;(6)轻轻混合已稀释质粒(由第4步)和Lipo2fectamine2000稀释液(由第5步),室温放置20min;(7)将每管500μl脂质体质粒复合物慢慢加入到各CCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGGCCTT2GCGGTACTACTATC;MR23上游,TGCTG2CAAACTTGTAGACGAACTTCTGTTTTGGC2CACTGACTGACAGAAGTTCCTACAAGTTTG;MR23下游,CCTGCAAACTTGTAGGAACT2TCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGAAGTTC2GTCTACAAGTTTGC;MR24上游,TGCTG2TACTCGTTCCGGCTGCTGCGTGTTTTGGCCACTGACTGACACGCAGCACGGAACGAGTA;MR24下游,CCTGTACTCGTTCCGTGCTGCGT2GTCAGTCAGTGGCCAAAACACGCAGCAGCC2GGAACGAGTAC;Negative2上游TGCTGAAAT2GTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTG2ACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT;Nega2tive2下游,CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCAC。载细胞孔中,轻轻混匀;(8)在37℃,5%的CO2的培养箱中培养4～6h后,换上完全培养液(不含抗生素),放置在37℃,5%的CO2的培养箱中继续培养过夜;(9)第2天观察是否有荧光表达。41RT2PCR　质粒转染细胞48h后,按TriblueKit说明书提取细胞总RNA,琼脂糖凝胶电泳进行体构建试剂盒BLOCK2iTTMPolIImiRRNAiExpressionVectorKitwithEmGFP及lipofectamine2000试剂(Invitrogen公司)。21细胞　人胚肾细胞株293T由本实验室冻存。二、方法11质粒构建　将4对序列退火成双链,然后用载体构建试剂盒BLOCK2iTTMPolIImiRRNAiExpressionVectorKitwithEmGFP进行重组克隆,将4对双链的miRNA序列分别插入到miRNA表达载体pcDNATM6122GW/EmGFPmiR中(载体图谱见内页4图1),构建4个miRNA干扰表达质α。退火和连接的具粒,并转化至感受态细胞DH5体方法如下:(1)序列退火,将4对合成好的序列用超纯水溶解成100μM,互补单链各取5μl两两混确证。按FirstStrandcDNASynthesisKit说明书合成cDNA。PCR扩增条件:取反应体系50μl,内含10×PCR缓冲液、20mmol/LdNTP、引物20pmol、cDNA、DNA聚合酶215μl,余量用超纯水补足,分别经95℃5min,后94℃1min,65℃3min,β72℃1min共35个循环最后72℃10min。2actin分别经95℃5min,后95℃15s,65℃30s,58℃30s,共35个循环最后72℃10min,ELK21上游引物:5′2TTCTCTCAGACAGCTTATCCTT23′,下游引物5′2GCCTAGAATAGAGACAGGACAG2β3′。2actin上游引物:5′2TGCGTGACATTAAG2GAGAAGC23′,下游引物:5′2GCCAGGGTACAT2GGTGGTG23′。江苏医药2010年3月第36卷第6期　JiangsuMedJ,March2010,Vol36,No.6・671・结果2个可以达到至少70%的在转录水平的降低,我们认为本次转染完全达到筛选有效干扰质粒的要求,同时RT2PCR结果也显示MR22、MR23比MR21、MR24更有效抑制293T细胞ELK21mRNA的表达,而且干扰效率确实在70%以上最好的达到9315%。ELK21作为重要的核转录因子在细胞的分化、增殖、凋亡和肿瘤发生中起作用,但是目前国内对ELK21的论文只有2篇[9,10],而且都未能深入研究ELK21的作用机制,我们的前期研究已发现ELK21在调节细胞信号通路的某个环节起到非常重要的作用(未发表的结果),本实验成功获得了ELK21miRNA的有效干扰质粒,为下一步阐明ELK21在肿瘤的作用奠定了基础。参考文献一、miRNA真核表达载体的测序通过上海英骏生物公司结果表明,所获得的重组干扰质粒目的片段与预期完全相符。表明退火形成的干扰寡核苷酸成功连接入pcDNATM6122GW/EmGFPmiR载体。二、转染细胞的荧光显微镜观察由于pcDNATM6.22GW/EmGFPmiR载体带有绿色荧光报告基因,因此、干扰载体MR21、MR22、MR23、MR24及阴性对照转染成功的细胞会发出绿色荧光(见内页4图2A～E),表明细胞中有转染的外源基因表达。三、miRNA抑制ELK21的表达采用RT2PCR技术检测MR21、MR22、MR23、MR24干扰序列对293T细胞ELK21mRNA的抑制作用。可见MR22、MR23比MR21、MR24更能有效抑制293T细胞ELK21mRNA的表达(见内页4图3)。讨论[1]　HsuT,TrojanowskaM,teinsinbiologi2calcontrolandcancer[J].JCellBiochem,2004,91(5):8962903.[2]　YiHsienh,TrangTiauW,JenHsiangtslongtsaiT,pressionregulatedbyElk21andMZF21inhumanHCCcells[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommu2nications,2006,339(1):2172225.[3]　QuigleyD,sgeneticsanalysisofcancersusceptibility:frommousemodelstohumans[J].NatRevGenet,2009,10(9):6512657.[4]　Chanan2KhanA.　Bcl22antisensetherapyinhematologicmalignancies[J].CurrOpinOncol,2004,16(6):5812585.[5]　XieX,LuJ,KulbokasEJ,aticdiscoveryofregu2latorymotifsinhumanpromotersand3′UTRsbycomparisonofseveralmammals[J].Nature,2005,434(7031):3382345.[6]　LewisBP,BurgeCB,vedseedpairing,oftenflankedbyadenosines,indicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets[J].Cell,2005,120(1):15220.[7]　LeeY,JeonK,LeeJT,NAmaturation:step2wiseprocessingandsubcellularlocalization[J].EMBOJ,2002,21(17):466324670.[8]　GregoryRI,ChendrimadaTP,CoochN,ISCcouplesmicroRNAbiogenesisandposttranscriptionalgenesilencing[J].Cell,2005,123(4):6312640.[9]　陈小军,顾立刚,李佩文,等.榄香烯乳对人宫颈癌Hela细胞肿瘤的发生是一个多步骤的过程,不仅仅是肿瘤细胞生长和存活的改变,还包括获得侵袭周围其他组织的能力。恶性肿瘤的最大特点就是具有很强的转移能力,这也是目前癌症治疗的难点[3,4]。目前对miRNA研究不断深入,发现miRNA是生物体内源长度约为19～25个核苷酸的非编码小RNA,通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。miRNA参与发育、分化、凋亡和增殖等重要生物学过程[5～7]。miRNA调控机制的研究结果还显示,以miRNA做底物的RISC对基因的调控活性是小干扰RNA的10倍。所以利用miRNA干扰技术将比shRNA及siRNA干扰带来更加好的干扰效果。本研究通过设计合成miRNA,并成功转入pcDNATM6122GW/EmGFPmiR载体中,通过测序的方法确定重组克隆中插入片段序列与设计的序列序列一致性,通过脂质体法瞬时转染293T细胞,在倒置荧光显微镜下观察到转染效率在90%以上,按照说明书在转染效率>80%的前提下,保证至少有[8]转录因子ELK1及其靶基因的影响[J].中国中医药信息杂志,2008,15(1):26227.[10]　王新朝,吴逸明,李卓炜.青石棉诱导A549细胞ERK1/2及ELK21激活的研究[J].卫生研究,2004,33(4):3982399.(收稿日期:2009208203)(供稿编辑:王丹薇)