2024年5月3日发(作者：测距仪软件免费下载)

276 中国医药生物技术 2018年6月第13卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2018, Vol. 13, No. 3

DOI: 10.3969/.1673-713X.2018.03.015

·

技术与方法

·

贝伐珠单抗仿制药生物活性测定方法的

开发与应用

王静斋，肖莉杰

贝伐珠单抗是一种人源化的抗血管内皮生长因子

（vascular endothelial growth factor，VEGF）重组单克隆抗

体，其人类免疫球蛋白 G（IgG）片段占 93%，其余的

是鼠源结构，人源化部分可以使该药的 t

1/2

延长和免疫

原性降低

[1]

。VEGF 是血管生成的重要调控因子，

VEGF-A/VEGFR2 信号由 PLC-γ1 通过促进其激动激酶 C

和 Raf-MEK 信号通路，最终通过 ERK1/2 促进血管内皮

细胞的增殖

[2]

。原位杂交研究表明，多种人实体肿瘤中均存

在 VEGF mRNA 的表达

[3]

。肿瘤新生血管的生成是肿瘤与

其周围环境中血管生长因子相互作用的结果

[4]

，贝伐珠单抗

可以与 VEGF 特异性结合，从而阻断其与受体结合，使血

管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）无法活化，从而发挥

抗血管生成的作用。因 VEGF 能促进异常肿瘤血管内皮细

胞增殖、迁移、新生和增加肿瘤血管通透性，故贝伐珠单抗

结合 VEGF 后，异常肿瘤血管得到改善，肿瘤血管通透性

变得正常，肿瘤部位的血管出现退化，肿瘤体积变小。同时，

组织间隙的压力下降，最终使化疗药物更多更顺利地到达肿

瘤部位

[5]

。

单克隆抗体药物的生物活性检测是指依据单克隆抗体

的预期、潜在的作用机制和工作模式（可能不限于一种），

采用相应的生物学测定方法和数据分析模式，在体外建立相

应的细胞评价模型，模拟其作用机制，产生客观的全程量效

反映，并将供试品与参比品进行比较，供试品测定结果应在

规定的范围内。目前对于生物仿制药生物活性检测的方法主

要是基于细胞检测方法，其优点是特异性高、变异度小，但

其受到一些条件的限制，该方法也存在操作过程较为复杂、

实验周期长、人为操作误差等缺点。而基于表面等离子共振

技术建立的活性检测方法，是近几年被广泛应用于小分子制

药和生物制药领域的新型检测技术，它是一种物理光学特性

的分析技术，近几年也有很多这方面的报道

[6-10]

，该技术操

作简便、实验周期短、样品消耗量低，一般仅有微克级，除

了可以获得一般的亲和力信息外，还能够给出对阐述分子间

结合机制更为宝贵的动力学信息，在分析测定核酸、蛋白质

等大分子方面显示出了巨大的应用潜力

[11-12]

。本实验根据

《人用重组 DNA 制品质量控制技术指导原则》和《中国

药典》三部（2015 版）的要求

[13-14]

，结合产品的特点，将

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，

HUVEC）增殖抑制法及表面等离子共振（surface plasmon

resonance，SPR）技术相结合，对贝伐珠单抗生物仿制药生

物活性检测方法进行开发和建立，使其生物活性检测结果可

信度更高，为贝伐珠单抗生物仿制药临床研究提供有力的数

据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

实验检测用 HUVEC 细胞株、基础培养液

（HUVEC-004B）、完全培养基（HUVEC-004）、FBS、生

长因子添加剂购自澳赛尔斯生物技术（上海）有限公司；

DMSO、明胶购自美国 Sigma 公司；PBS、0.25%

Trypsin-EDTA（1 ×）购自美国 Gibco 公司；VEGF

165

购自

美国 Sino Biological 公司；Alarm Blue 和酶标仪均购自美

国 Thermo 公司；Sensor Chip CM5 传感芯片、HBS-EP +

buffer（10 ×）、Biacore 仪器购自美国 GE 公司；标准品

及样品由东竺明生物技术有限公司提供；二氧化碳培养箱购

自美国 Shell AB 公司。

1.2 方法

1.2.1 基于 HUVEC 增殖抑制法活性方法的开发

1.2.1.1 HUVEC 细胞培养 复苏细胞前一天用 0.25%

的明胶溶液包被细胞培养瓶，明胶均匀分布在培养瓶底面，

置 37 ℃ 培养箱中，放置过夜（至少放置 2 h），37 ℃ 水

浴预热完全培养基（HUVEC-004）。从液氮中取出细胞

冻存管，快速将其置于 37 ℃ 水浴中解冻，放入生物安

全柜中，将细胞转移至加好培养基的细胞培养瓶中后，置于

37 ℃、5% CO

2

培养箱内培养。待复苏后的细胞汇合度达到

80% 左右的时候，消化细胞并对细胞进行传代、冻存或者

铺板。

1.2.1.2 VEGF 最适作用浓度的优化 确定合适的

VEGF 的作用浓度，使得在这种条件下，VEGF 对细胞具

有最大的刺激生长的作用，药物作用效果也更加明显。

实验过程如下：1% FBS HUVEC 基础培养基，调

整 HUVEC 活细胞密度至 1 × 10

5

个/ml，100 μl/孔，加入

96 孔细胞培养板；接着用 1% FBS HUVEC 基础培养基

稀释 VEGF 终浓度分别至 5、10、15、20、25、30、35、

40 ng/ml，每个浓度 4 个复孔，100 μl/孔加入到细胞培养板

中。37 ℃，5% CO

2

培养箱培养 96 h，加入 20 μl/孔 Alarm

作者单位：163316 大庆，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院

通信作者：肖莉杰，Email：371579562@

收稿日期：2017-11-25

中国医药生物技术 2018年6月第13卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2018, Vol. 13, No. 3 277

Blue 检测液，5% CO

2

培养箱中孵育显色 6 h，在 530 nm

激发光和 590 nm 发射光下，读取荧光读数（RFU），软件

分析得到曲线。

1.2.1.3 样品作用浓度、稀释倍数、梯度的优化 需要确

定合适的样品最佳起始浓度、稀释倍数及稀释梯度，使得

在这种条件下，通过实验结果绘制的标准曲线的窗口差值、

抗体作用浓度点的分布最为理想，同时使实验结果的可信度

更高。

实验过程如下：1% FBS HUVEC 基础培养基，调整

HUVEC 活细胞密度至 1 × 10

5

个/ml，100 μl/孔，加入 96 孔

细胞培养板；接着用 1% FBS HUVEC 基础培养基稀释

VEGF 至适宜浓度，作为 A液。用 A 液按以下条件稀释

单抗样品：样品起始浓度 80 μg/ml，3 倍稀释，12 个梯度；

样品起始浓度 3 μg/ml，2 倍稀释，9 个梯度；样品起始浓

度 3 μg/ml，3 倍稀释，8 个梯度；样品起始浓度 3 μg/ml，

5 倍稀释，8 个梯度。每个浓度 3 个复孔，100 μl/孔加入

到细胞培养板中。37 ℃，5% CO

2

培养箱培养 96 h，加入

20 μl/孔 Alarm Blue 检测液，5% CO

2

培养箱中孵育显色

6 h，在 530 nm 激发光和 590 nm 发射光下，读取荧光读

数（RFU），软件分析得到曲线。

1.2.1.4 专属性验证实验 取抗 TNF-α 单抗、抗

RANKL 单抗、基础培养液（HUVEC-004B）、抗 VEGF 单

抗作为四种检测样品，按照以上优化好的条件进行实验，验

证贝伐珠单抗仿制药与 VEGF 的剂量线性关系。

1.2.1.5 线性及重复性验证实验 按照确定的方法配置标

准品和样品，连续进行 6 次检测，读取荧光读数（RFU），

曲线拟合，得到 r

2

值及 EC

50

值，计算 6 次实验 EC

50

的

RSD 值。

1.2.1.6 准确性及中间精密度验证实验 按照确定的方法

配置标准品和样品，由 3 名检测人员分别在三天实验，每

天两次检测，曲线拟合得到 EC

50

值，计算 6 次实验 EC

50

的 RSD 值，同时，计算其相对生物活性值，相对生物活性

值 = 标准品 EC

50

/样品 EC

50

。

1.2.2 基于表面等离子共振技术活性方法的开发 表面等

离子共振（SPR）技术是一种基于物理光学特性的分析技

术，Biacore 仪器是基于 SPR 技术开发的新型生物传感分

析仪器

[15]

，本实验以 Biacore 为检测仪器，以贝伐珠单抗

标准品为配体，以 VEGF 为分析物，分别按照以下条件进

行稀释：配体浓度 1 μg/ml，分析物浓度 2.5 mg/ml；配体

浓度 0.5 μg/ml，分析物浓度 2.3 μg/ml；配体浓度 0.25 μg/ml，

分析物浓度 2.3 μg/ml，所有单循环进样 120 s，再生液为

3 mol/L 氯化镁。根据以上实验确定最佳多循环条件，多循

环实验时，分别稀释配体及分析物至最佳浓度，分析物

VEGF 以最佳浓度为起始浓度，2 倍稀释，7 个梯度。其

中，设置中间浓度及零浓度，进样 120 s，解离 800 s，再

生液为 3 mol/L 氯化镁。

1.2.3 贝伐珠单抗仿制药样品生物活性检测 按照以上基

于 HUVEC 增殖抑制法建立的活性检测方法对贝伐珠单抗

仿制药样品进行检测，读取荧光读数（RFU），曲线拟合，

得到其 r

2

值及 EC

50

值，并计算其相对生物活性值。同时

按照以上基于 SPR 技术建立的活性检测方法对贝伐珠单

抗仿制药样品进行检测，得到其抗原抗体亲和力（KD）值，

以及动力学曲线。

2 结果

2.1 基于 HUVEC 增殖抑制法活性方法的开发

所有实验结果都通过 Graph Pad Prism 5 软件分析并拟

合曲线。

2.1.1 VEGF 最适作用浓度优化 为了确定最佳的 VEGF

的作用浓度，使其对 HUVEC 的刺激效果最为明显，本实

验选取了 8 个浓度点进行检测，结果显示，VEGF 30、35、

40 ng/ml 的点都处于指数期，对 HUVEC 细胞都具有最大

的刺激生长作用，同时出于成本考虑，选用 VEGF 30 ng/ml

作为实验的最适作用浓度（图 1）。

1400

1300

数

1200

读

光

1100

荧

1000

900

800

0.5 1.0 1.5 2.0

lg C

VEGF

（ng/ml）

图 1 VEGF 刺激 HUVEC 细胞增殖曲线

2.1.2 样品作用浓度、稀释倍数、梯度的优化 通过对样

品最适起始浓度，最佳稀释倍数及梯度等条件进行优化，确

定样品的浓度作用范围在 3 ~ 0.0013 μg/ml 之间，8 个浓度

作用点，曲线拟合度较好。同时，样品起始浓度 3 μg/ml，

3 倍稀释，8 个梯度曲线各浓度点分布较为理想，曲线拟合

度最好，所以该检测方法最终确定样品起始浓度为 3 μg/ml，

3 倍稀释，8 个梯度（图 2）。

1600

1500

数

1400

读

光

1300

荧

1200

1100

1000

–4 –3 –2 –1 0 1

lg C

抗体

（μg/ml）

图 2 抗 VEGF 单克隆抗体抑制 HUVEC 细胞增殖曲线

278 中国医药生物技术 2018年6月第13卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2018, Vol. 13, No. 3

2.1.3 专属性验证实验结果 该方法下共设计 4 种专属

性溶液：抗 TNF-α 单抗、抗 RANKL 单抗、基础培养液

（HUVEC-004B）、抗 VEGF 单抗，其中仅在抗 VEGF 单

抗溶液中呈现剂量关系的曲线，其他对照组 MAX/MIN ≈

1600

1500

1400

荧

光

读

数

1300

1200

1100

1000

–3 –2 –1 0 1

lg C

抗体

（μg/ml）

1，没有任何与 VEGF 结合的活性（图 3）。

2.1.4 线性及重复性验证实验结果 按照以上优化的实验

方法，连续进行 6 次实验，实验结果见表 1，所有 6 次检

测的 r

≥

97%，满足线性验证可接受标准。6 个重复实验

之间样品 EC

50

的 RSD < 25%。

2.1.5 准确性及中间精密度验证实验结果 3 人所做

6 次检测，相对生物活性的值均在 70% ~ 130% 之间，符

合准确性验证标准。6 次实验之间样品 EC

50

的 RSD <

25%（表 2）。

序号

r（%）

1

2

3

4

5

6

97.50

97.59

98.48

97.84

98.25

97.62

2

2

图 3 专属性验证实验曲线

表 1 线性及重复性实验

样品

EC

50

（μg/ml）

0.0794

0.1081

0.1119

0.1081

0.1074

0.1157

RSD（%）

12.37

r

（%）

98.62

97.48

98.14

97.21

97.29

98.71

2

标准品

EC

50

（μg/ml）

0.0877

0.0890

0.1010

0.0949

0.0982

0.0954

RSD（%）

5.47

表 2 准确性及中间精密度实验

序号

r（%）

第1天

第2天

第3天

1

2

1

2

1

2

98.45

97.86

98.65

98.82

98.18

97.61

2

样品

EC

50

（μg/ml）

0.0871

0.0952

0.0869

0.0923

0.1032

0.0965

RSD（%）

6.64

r（%）

97.55

97.01

98.95

97.97

97.83

97.98

2

标准品

EC

50

（μg/ml）

0.0903

0.0894

0.0887

0.0964

0.0894

0.0832

RSD（%）

4.70

相对生物活性

（

%

）

103.71

93.88

102.10

104.43

86.65

86.19

图 4 标准品动力学和亲和力拟合曲线

中国医药生物技术 2018年6月第13卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2018, Vol. 13, No. 3 279

2.2 基于表面等离子共振技术活性方法的开发

实验中，对配体以及分析物的浓度进行了摸索和优化，

使分析物流过芯片表面所产生的响应值在 50 RU 左右为

宜，最终确定配体浓度 0.5 μg/ml，分析物浓度 2.3 μg/ml 为

最佳实验条件。同时以此条件的多循环动力学曲线见图 4，

该实验结果的结合速率常数 Ka（1/Ms）值为 5.38E+05，

解离速率常数 Kd（1/s）值为 1.27E-04，亲和力 KD 值为

2.36E-10，最大响应值 Rmax（RU）值为 38.24。

2.3 贝伐珠单抗仿制药样品生物活性检测结果

以原研药作为标准品，取贝伐珠单抗生物仿制药研发阶

段的候选药样品，利用以上经过条件优化并且经过验证的基

于 HUVEC 增殖抑制法建立的活性检测方法，对其进行抗

VEGF 的活性检测，四参数拟合图结果见图 5，其中候选

药样品的 r

2

值为 97.74%，标准品 r

2

值为 97.93%，候选

药的相对生物活性为 98.47%。同时按照以上基于 SPR 技

术建立的活性检测方法对该候选药进行检测，得到其结合速

率常数 Ka（1/Ms）值为 8.46E+05，解离速率常数 Kd（1/s）

值为 1.61E-04，亲和力 KD 值为 1.90E-10，最大响应值

Rmax（RU）值为 66.91，动力学曲线见图 6。

1400

1200

荧

光

读

数

1000

800

600

–4 –3 –2 –1 0 1

lg C

抗体

（μg/ml）

3 讨论

贝伐珠单抗已经被批准用于治疗转移性结直肠癌

[16]

、

乳腺癌

[17]

、肺癌

[18-19]

、多形性成胶质细胞瘤等

[20-22]

。2010 年

1 月贝伐珠单抗在国内获批上市。2015 年 7 月，肺癌适应

证正式在中国获批，用于晚期、转移性或复发性非鳞非小细

胞肺癌的一线治疗。肺癌已经成为我国乃至世界发病率和死

亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell

lung cancer，NSCLC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤，占

肺癌的 80% 以上，死亡率很高

[23]

。每年每位患者治疗费用

约 38 万元，昂贵的治疗费用无疑给普通家庭带来了极大的

经济负担。降低治疗成本，可以使患者更好地享受平等医疗

的权利。因此，贝伐珠单抗生物仿制药的研发工作具有极高

的社会价值及临床价值。随着一些国家和地区贝伐珠单抗生

物制品专利保护的相继到期，在国际上掀起贝伐珠单抗生物

类似药仿制的热潮。

生物仿制药的生物活性是评价药品质量安全的关键属

性之一，目前，抗体药生物活性测定方法主要有基于细胞的

生物活性测定法、基于新技术的生物活性测定法以及基于转

基因的细胞生物活性测定方法，其中基于细胞的生物活性测

定法因其高效、特异性高、可操作性强等优点，是目前应用

最广的一种抗体药的生物活性检测方法，但该方法受仿制药

自身的研发环境、统计学模型的选择、操作人员等方面的影

响，要建立一套稳定的、准确的生物活性检测方法，存在一

定的难度；基于新技术的生物活性测定法具有灵敏度高、方

法简便、选择性高等优点，是近几年应用非常广泛的新型检

测技术，但也因其仪器设备、试剂耗材价格昂贵，在实际的

应用中受到了一定的限制；基于转基因细胞的生物活性测定

方法具有简单、快速、灵敏等优点，近几年在一些生物仿制

药的研发中也经常被用到，但也因该方法构建转基因细胞株

困难，需要对其稳定性、信噪比等参数进行优化和评价，在

图 5 候选药抑制 HUVEC 细胞增殖曲线

图 6 候选药动力学和亲和力拟合曲线

280 中国医药生物技术 2018年6月第13卷第3期 Chin Med Biotechnol, June 2018, Vol. 13, No. 3

实际应用中也存在一定的困难。所以在实际研发工作中，在

充分了解产品的作用机制和属性的情况下，要基于新思路、

新技术开发出一套可靠的生物活性检测方法，以确保该产品

有效、质量可控。

本研究中贝伐珠单抗生物仿制药生物活性检测方法的

开发主要应用了基于细胞的生物活性检测方法（HUVEC 细

胞测定法）以及基于新技术（SPR 技术）的生物活性测定

方法，两种方法相结合增加了贝伐珠单抗生物仿制药的质量

可靠性。在 HUVEC 增殖抑制法实验中，采用反应性较好

的 HUVEC 细胞作为检测用细胞，最大程度地模拟了贝伐

珠单抗生物仿制药在体内抑制新生血管生成的过程，对

VEGF 的作用浓度、药品（仿制药样品及原研药）的浓度、

稀释倍数、稀释梯度等条件进行了优化，建立检测方法并进

行了方法学的验证，证明其特异性高、线性及重复性好、不

同实验之间的相对生物活性值高度一致，并运用该方法对贝

伐珠单抗生物仿制药研发阶段的样品进行了检测，检测结果

的相对生物活性值为 98.47%，在可接受的标准范围之内。

同时，在基于表面等离子共振技术建立的活性检测方法中，

通过前期的实验条件的摸索确定配体浓度 0.5 μg/ml，分析

物浓度 2.3 μg/ml 为最佳实验条件，并以此条件进行标准品

及候选药样品的 Biacore 检测，最后得到标准品及候选药

样品的亲和力 KD 值极为接近，动力学曲线几乎相同。为

了加快生物仿制药快速发展的步伐，更多快速、简便、准确

的生物活性检测方法需要在进一步的研究中摸索和建立。

此研究建立的两种贝伐珠单抗生物仿制药生物活性检

测方法高效、稳定、可靠性强，可作为该药研发以及药品稳

定性评价阶段的生物学活性检测方法。

参考文献

[1] Presta LG, Chen H, O'connor SJ, et al. Humanization of an

anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the

therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Res, 1997, 57(20):

4593-4599.

[2] Takahashi T, Yamaguchi S, Chida K, et al. A single

autophosphorylation site on KDR/Flk-1 is essential for

VEGF-A-dependent activation of PLC-gamma and DNA synthesis in

vascular endothelial cells. Embo Journal, 2001, 20(11):2768-2778.

[3] Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, et al. Discovery and development of

bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev

Drug Discov, 2004, 3(5):391-400.

[4] Greillier L, Tomasini P, Barlesi F. Bevacizumab in the treatment of

nonsquamous non-small cell lung cancer: clinical trial evidence and

experience. Ther Adv Respir Dis, 2016, 10(5):485-491.

[5] Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med, 2003,

9(6):685-693.

[6] Frasconi M, Mazzarino M, Botrè F, et al. Surface plasmon resonance

immunosensor for cortisol and cortisone determination. Anal Bioanal

Chem, 2009, 394(8):2151-2159.

[7] Altintas Z, France B, Ortiz JO. Computationally modelled receptors

for drug monitoring using an optical based biomimetic SPR sensor.

Sensors Actuators B Chem, 2016, 224(3):726-737.

[8] Livnat Levanon N, Vigonsky E, Lewinson O. Real time measurements

of membrane protein:receptor interactions using Surface Plasmon

Resonance (SPR). J Vis Exp, 2014, 93(11):e51937.

[9] Brzozowska E, Koba M, Śmietana M, et al. Label-free Gram-negative

bacteria detection using bacteriophage-adhesin-coated long-period

gratings. Biomed Opt Express, 2016, 7(3):829-840.

[10] Liang YH, Chang CC, Chen CC. Development of an Au/ZnO thin film

surface plasmon resonance-based biosensor immunoassay for the

detection of carbohydrate antigen 15-3 in human saliva. Clin Biochem,

2012, 45(18):1689-1693.

[11] Li YH. A new method for rapid detection point mutation of surface

plasmon resonance biosensor. Chongqing: Chongqing Medical

University, 2014. (in Chinese)

李娅慧. 表面等离子共振生物传感器快速检测点突变的新方法研

究. 重庆: 重庆医科大学, 2014.

[12] Pol E, Roos H, Markey F, et al. Evaluation of calibration-free

concentration analysis provided by Biacore™ systems. Anal Biochem,

2016, 510:88-97.

[13] Bi H, Fan WH, Han CM, et al. Study on quality control methods and

standards of recombinant humanized rabbit anti-VEGF mAb. Chin

J Pharm Anal, 2012, 32(6):1054-1058, 1075. (in Chinese)

毕华, 范文红, 韩春梅, 等. 重组人源化兔抗VEGF单克隆抗体质

控方法与质量标准研究. 药物分析杂志, 2012, 32(6):1054-1058,

1075.

[14] Fan WH, Tao L, Li X, et al. Development of standardized methods for

quality control of humanized monoclonal antibody HcHAb18 and

structure confirmation of its reference substance for physicochemical

analysis. Chin J New Drugs, 2014, 23(20):2360-2365. (in Chinese)

范文红, 陶磊, 李响, 等. 美妥珠单抗(HcHAb18)质量标准的建立

及理化对照品结构确证. 中国新药杂志, 2014, 23(20):2360-2365.

[15] Wilson WD. . Analyzing biomolecular interactions. Science,

2002, 295(5562):2103-2105.

[16] Jin XF, Ran ZH. Progress in clinical research on targeted treatment of

colorectal cancer with bevacizumab. Chin J Gastroenterol, 2007, 12(5):

305-307. (in Chinese)

靳西凤, 冉志华. 贝伐单抗靶向治疗结直肠癌的临床研究进展. 胃

肠病学, 2007, 12(5):305-307.

[17] Chen WL. Clinical progress in new drug bevacizumab. China Cancer,

2010, 19(8):534-539. (in Chinese)

陈万灵. 新药贝伐单抗的临床应用进展. 中国肿瘤, 2010, 19(8):

534-539.

[18] Qi C. Bevacizumab as the first-line chemotherapy in the treatment for

non-small cell lung cancer. J Oncol, 2011, 17(4):294-297. (in Chinese)

戚川. 贝伐单抗一线治疗非小细胞肺癌研究进展. 肿瘤学杂志,

2011, 17(4):294-297.

[19] Zhu B, Liu CS. Application of bevacizumab in the treatment of

advanced non-small cell lung cancer. Tianjin Med J, 2012, 40(9):965-

968. (in Chinese)

朱斌, 柳仓生. 贝伐单抗在晚期非小细胞肺癌治疗中的应用进展.

天津医药, 2012, 40(9):965-968.

[20] Grothey A, Galanis E. Targeting angiogenesis: progress with

anti-VEGF treatment with large molecules. Nat Rev Clin Oncol, 2009,

6(9):507-518.

[21] Kerr DJ. Targeting angiogenesis in cancer: clinical development of

bevacizumab. Nat Clin Pract Oncol, 2004, 1(1):39-43.

[22] Papadopoulos N, Martin J, Ruan Q, et al. Binding and neutralization

of vascular endothelial growth factor (VEGF) and related ligands by

VEGF Trap, ranibizumab and bevacizumab. Angiogenesis, 2012,

15(2):171-185.

[23] Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin,

2014, 64(1):9-29.