2024年4月13日发(作者：)
第
27
卷第
1
期
圆园23
年
2
月
生命科学研究
蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡
灾燥造援27晕燥援1
Feb.圆园23
DOI:10.16605/.1007-7847.2022.05.0146
技术与应用
窑窑
催化发夹自组装技术用于miRNA检测的研究进展
(
中国医科大学生命科学学院
,
中国辽宁沈阳
110122)
摘要
:
微RNA(microRNA,miRNA)是一类小分子RNA,参与了众多的细胞过程,在生命体的生长发育过程
中起到了关键作用。鉴
于
miRNA的重要性和结构特殊性,其对于疾病的预测与评估有着深刻的意义
。
当前,
miRNA检测技术迅猛发展,其中,催化发夹自组装(catalytichairpinassembly,CHA)是一项新型核酸恒温扩增
技术,具有反应过程无需酶催化、检测灵敏度高特异性强、操作简单方便等优点,在miRNA的检测领域有着巨
大潜力。本文将着重阐述CHA技术的检测原理,从靶标识别、信号扩增、信号输出3个方面对基于CHA技术
的miRNA检测策略进行介绍,并提出该技术当前面临的挑战及前景,旨在为医学、生物信息等相关领域的研究
提供进一步参考
。
关键词
:
微RNA(miRNA);催化发夹自组装(CHA);检测
中图分类号
:
Q503文献标志码
:
A文章编号
:
1007-7847(2023)01-0086-09
龙禹同
,
万里
,
赵国杰
*
ResearchProgressofCatalyticHairpinAssemblyTechniquefor
miRNADetection
(CollegeofLifeSciences,ChineseMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)
LONGYutong,WANLi,ZHAOGuojie
*
Abstract:MicroRNAs(miRNAs)areaclassofsmallRNAmoleculesthatareinvolvedinnumerouscellular
proheimportanceand
structuralspecificityofmiRNAs,theyhaveprofoundimplicationsforthepredictionandassessmentofdi-
apiddevelopmentofmiRNAdetectionmethods,catalytichairpinassembly(CHA)isanovel
thermostaticnucleicacidamplificationtechnology,withhighsensitivity,highspecificity,simpleandconve-
nientoperation,ore,ithasgreatpotentialinmiRNA
,theprincipleofCHAtechnology,andtheCHA-basedmiRNAdetectionstrategyintarget
identification,signalamplificationandsignaloutputwereintroduced,andthecurrentchallengesandpros-
pectsofthistechnologywerealsodiscussed,aimingtoprovidesomeideasandreferenceforrelatedresearch.
Keywords:microRNA(miRNA);catalytichairpinassembly(CHA);detection
（LifeScienceResearch，2023，27（1）：086-094）
微
RNA(microRNA,miRNA)
是一类小分子非
编码
RNA,
仅由几十个碱基序列构成
,
主要调节
凋亡以及癌变
基因表达
,
参与了细胞增殖、迁移
、
等基本细胞生命过程
,
生物体所患有的很多疾病
已被证实与
miRNA
的异常表达密切相关
[1-2]
。
mi-
RNA
凭借稳定地存在于人的外周血液中这一优
势
,
被认为是液体活检的重要标志物
,
临床意义
重要。
miRNA
在不同细胞中的表达是异质性的
,
研究单细胞
miRNA
的表达对研究
miRNA
介导的
调控通路以及
miRNA
相关疾病的复杂性和异质
性具有重要价值
[3-5]
。此外
,
在面对庞大而复杂的
准确有效的
miRNA
临床样本时
,
研发出快捷简单
、
收稿日期
:2022-05-11;
修回日期
:2022-08-11;
网络首发日期
:2022-09-30
基金项目
:沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目(RC190235);中国医科大学大学生创新创业项目(X2)
作者简介
:龙禹同(2000—),女,辽宁鞍山人,学生;龙禹同和万里对本文的贡献相同,为本文共同第一作者;
*
通信作者:赵国杰(1978—),
男,辽宁沈阳人,博士,中国医科大学教授,主要从事核酸及核苷酸衍生物的生物化学、核酸相关酶学、核酸扩增等方面的研究,E-mail:
**************.cn。
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第
1
期
龙禹同等：催化发夹自组装技术用于
miRNA
检测的研究进展
87
检测方法也尤为重要。
传统的
miRNA
检测方法包括实时荧光定量
PCR
、
Northern
印迹杂交等
,
这些方法存在耗时
设备要求较高等问
长、价格昂贵、检测灵敏度低
、
题。新型检测方法中极具代表性的是恒温无酶扩
增法。恒温无酶扩增包括杂交链式反应
(hybridi-
催化发夹自组装
(ca-zationchainreaction,HCR)
、
的序列从而打开
H2,
依据反应动力学及碱基互补
配对原则
,
形成
H1-H2
的双链复合物
,
替换出靶
标
DNA;
替换出的靶标
DNA
进入下一个循环
,
打
开新的
H1
结构
,
经反复利用
,
产生大量的
H1-
H2
双链复合物
[15]
。发卡结构上标记的信号分子可
该技术具有
50~100
随该反应过程实现信号放大。
倍的信号放大效应。
随着科学技术的发展
,miRNA
的检测已逐渐
成为
CHA
技术应用最为广泛的领域之一
。目前
,
信号扩增、信号输出
3
个
CHA
技术在靶标识别、
talytichairpinassembly,CHA)
等
,
该类方法因为不
需要特定的酶
,
恒温下即可反应
,
应用广泛
[6]
。
其
中
,CHA
技术可以实现目标链的连续利用
,
在降
低成本的同时缩短了级联反应时间
[7-10]
。目前
,
研
究者们常将
CHA
技术与
HCR
技术结合用于靶标
物的大量扩增
,
这种级联扩增与荧光、磁矩和电化
学相结合
,
可以实现靶标序列的特异性检测
[11-12]
。
环节都有不同程度的改进
,
衍生出了多种新的检
测策略。
1基于催化发夹自组装(CHA)技术检测
miRNA
CHA
是
Yin
等
[13]
在
2008
年提出的一种新型
核酸探针信号放大等温扩增技术
,
根据放大方式
不同可分为线性与指数两种扩增形式。该技术具
灵敏度高、重复
有无酶恒温扩增、结果特异性强
、
性好、操作简单方便、易于自动化等优点
,
有效避
免了试剂昂贵、修饰过程复杂、易受污染、易受环
境因素影响等问题
,
可以在无酶条件下将目标信
号循环放大进行检测
[14]
。
CHA
技术的靶标循环原理如图
1
所示
:
特异
的发夹型结构使发夹未打开时
H1
与
H2
自身稳
定
,
可同时存在于溶液中
;
在靶标
DNA
引发链存
在的条件下
,
靶标
DNA
作用于探针
H1
的立足点
使茎环状
H1
打开呈链状
,H1
暴露出与
H2
互补
3
4
4
1
6
5
1.1靶标识别
1.1.1启动方式
目前
,CHA
技术的启动方法分为
miRNA
直
接启动和
miRNA
转换为特定的
DNA
序列启动两
种
,miRNA
直接启动的原理与检测
DNA
的原理
类似
,
而转换为特定
DNA
序列启动可以有效地
克服
miRNA
的不稳定性和降解问题
[16]
。
miRNA
直
接启动最初是在设计的分子信标
(molecularbea-
con,MB)
环中加入目标
miRNA
的互补结构域
[17]
,
靶
标
miRNA
与
MB
结合后
,
暴露出引发序列
,
扩增
反应随即开始
;miRNA
转换为特定的
DNA
序列
启动是
miRNA
与双链
DNA
结合后替换出“替代
DNA
”
,
进而引发扩增反应
(
图
2A)
[16]
。部分研究者
通过引入序列依赖性酶如双链特异性核酸酶
(du-
核酸外切
plex-specificnuclease,DSN)(
图
2B)
[16]
、
酶
芋
等来将
miRNA
转化为
DNA,
以提高检测敏
感性
[16]
。
DSN
是一种特异性核酸酶
,
仅能降解双链
DNA
或者是
DNA-RNA
杂交双链中的
DNA
链
,
3
2
H2
23
23
于
H2combineswith
H1-target
盂
4
3
12343
1
34
3
2
2
3
2
5
6
H1
淤
123
4
123
123
TargetDNA
H1-H2replacesthetargetDNA
图1CHA靶标循环的简要原理示意图
[15]
淤探针H1与靶标DNA结合,H1茎环结构被打开;于探针H2与H1-靶标复合物结合,形成H1-H2复合物;盂替换出
的靶标DNA进入下一个循环
。
Fig.1BriefschematicdiagramofCHAtargetcycle
[15]
淤H1combineswiththetargetDNA;于H2combineswithH1-targetandformsH1-H2;盂TargetDNAgoesintothenextcycle.
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88
生命科学研究
圆园23
年
但对单链核酸分子几乎没有作用
,
将
DSN
酶的这
种特异性与
CHA
技术结合起来用于
miRNA
的检
测
,
可以精确到单个碱基
,
有效地区分同源性较
高的
miRNA
[18]
。
1.1.2识别靶标分子
miRNA
是多种疾病的新型生物标志物
,
在转
录后基因调控中发挥了关键作用。当前
,
针对不
同的靶标分子
miRNA,
检测策略有所差异
。
检测限低至
26fmol/L
[21]
。
1.1.2.2miRNA-155
miRNA-155
在各类免疫细胞的发育分化、
免疫应答调控中发挥着重要作用
,
其主要来自活
化的淋巴细胞及单核
/
巨噬细胞内高表达的非编
码转录产物
,
通过调控相关靶基因的表达参与免
疫、炎症、肿瘤及心血管系统疾病等众多病理生
理过程
,miRNA-155
信号通路与系统性硬化病的
有文献报道了一免疫损伤和纤维化密切相关
[22-23]
。
种基于
CHA
靶标回收并结合了超声和纳米材料
的方法
,
以增强鲁米诺
-O
2
(luminol-O
2
)
系统的电
化学信号
,
该方法可实现
miRNA
的高灵敏度检
测。这种新设计的生物传感平台可在
0.1fmol/L
至
1nmol/L
范围内对
miRNA-155
进行灵敏检
测
,
检测限为
0.057fmol/L
[24]
。
一
,
研究者将
CHA
和滚环扩增
(rollingcircleam-
plification,RCA)
集成到电化学生物传感器中
,
用于
miRNA-21
的灵敏度和特异性检测
[19]
。相关研究
还设计了一种局域化催化发夹自组装技术
(loca-
lizedcatalytichairpinassembly,LCHA),
通过独特
的
DNA
骨架将
H1
和
H2
发夹探针诱导入细胞
,
实现了活细胞内动态检测
miRNA
的突破
;
而且
,
将荧光共振能量转移
(fluorescenceresonanceenergy
transfer,FRET)
与
LCHA
结合
,
可以有效地避免假
阳性结果的产生
[20]
。此外
,
一项结合了
MXene-MoS
2
(
一种二维过渡金属碳化物
/
氮化物
-
二硫化钼复
合物
)
异质结构的新型电化学生物传感器
,
可用
于
miRNA-21
的无标记检测。
MXene-MoS
2
的高
度折叠结构和较好的反应面积增强了通过碰撞提
高分子杂交效率的能力
,
实现了在
100fmol/L
到
100nmol/L
的宽动态范围对
miRNA-21
的检测
,
1.1.2.1miRNA-21
miRNA-21
参与人体多种生理病理过程
,
例
周围神经损伤
(peripheralner-
如
:
神经再生的调控、
veinjury,PNI)
等
[19]
。作为最热门的生物标志物之
量子点
(quantumdot,QD)
的发光特性
,
结合多种类
型核酸和化学信号技术
,
开发了磁性纳米颗粒
(magneticnanoparticle,NP)
和滤波辅助分离多模传
感策略
[19]
。该策略采用
miRNA-141
作为代表性靶
标
,
可以触发催化的发夹组装和杂化链反应无核
酸信号扩增
,
从而产生长双链
DNA
。随后
,
释放大
量
Ag
+
的银
NP(AgNP)
进行化学扩增并被引入系
统
,
利用
CdTeQD
和
Ag
+
之间的阳离子交换反应
淬灭
CdTeQD
的荧光
,
释放游离的
Cd
2+
,
最后
,
结
合视觉
/
荧光
/
化学蒸汽生成
-
原子荧光光谱法
/
电
H1
H2
H1-H2
1.1.2.3miRNA-141
miRNA-141
在多种癌细胞中表达
,
如
MDA-
有研究利用
CdTe
MB-231
细胞
(
乳腺癌细胞系
)
[19]
。
Complement
DNAtrigger
miRNA
DNAtrigger
(A)
TandemDNAtrigger
miRNA
SDA
DSN’sshearingaction
H1
H2
H1-H2
(B)
DNAtrigger
图2CHA检测miRNA原理图
[16]
(A)从miRNA到DNA探针介导的miRNA生物传感器的转化;(B)miRNA介导的miRNA生物传感器转化。
Fig.2SchematicdiagramofmiRNAdetectionbyCHA
[16]
(A)EquivalenttransformationfrommiRNAtoDNAtriggersmediatedmiRNAbiosensor;(B)NumerousDNAtriggersconvertedfrom
miRNAmediatedmiRNAbiosensor.
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第
1
期
龙禹同等：催化发夹自组装技术用于
miRNA
检测的研究进展
89
1.1.2.4miRNA-721
miRNA-721
是一种新的急性心肌炎诊断生
物标志物
[25]
。有研究提出了一种非酶三重放大电
化学生物传感器
,
用于定量检测
miRNA-721
[26]
。
该传感器基于分子信标样
CHA
电路、双放大纳米
酶和传感界面的协同效应
,
可以实现目标物质微
量水平的准确检测
,
这可能为检测
miRNA-721
以早期诊断急性心肌炎提供了一种潜在的方法
。
分子信标样
CHA
电路是指将每个目标转换放大
并使信号探针固定在传感接口上
,
从而产生增强
的电化学信号。结合了分子信标样
CHA
电路、双
放大纳米酶的用于信号放大的传感接口
,
可使该
生物传感器具有
0.25fmol/L
的低检测限和高特
异性
[26]
。
1.1.2.5
其他种类
miRNA
miRNAlet-7a
是较早被发现的一种肿瘤抑
制
miRNA,
其高表达可导致神经功能评分降低
[27]
。
有研究开发了一种磁珠
/DNA
系统来构建逻辑门
库
,
用于传感多重靶标
miRNA
[28]
。通过
CHA
技术
构建的极其具有特异性的串联逻辑电路
,
可以在
逻辑功能控制下区分单个目标
miRNA,
从而实现
对
miRNAlet-7a
等的检测
,
在快速智能检测领域
的发展前景广阔
[28]
。
miRNA-133
在心肌细胞中可
特异性表达
,
有
a
和
b
两种类型
,
其中
miRNA-
133a
可作为急性心肌梗死相关的生物标志物
[29]
。
有文献报道了一种超敏表面增强拉曼散射
(sur-
faceenhancementofRamanscattering,SERS)
生物
传感器
,
其将可调节的中空
Ag/Au
纳米球
SERS
探针与
CHA
技术结合
,
以实现信号放大。通
过这
种方式
,
靶标
miRNA-133
可以在宽的线性范围
内被检测到
,
检测限为
0.306fmol/L
[30]
。
感耦合等离子体质谱方法进行
miRNA
分析
[19]
。于核酸检测领域
[6]
。将
HCR
与
CHA
相结合的新型
级联放大策略
,
可以使信号放大效率大幅提升。例
如
,
肽核酸
(peptidenucleicacid,PNA)
和双级联核
低成本、
酸电路相结合的扩增策略
,
可以实现方便
、
灵敏、特异并定量检测癌症相关
miRNA
的目的。血
清中的
miRNA-155
触发
CHA
反应后
,
产物被
PNA
探针特异性捕获并触发
HCR
反应
,
导致转化酶
的局部富集。
转化酶底物
(
蔗糖
)
的引入导致葡萄
糖的产生
,
而后者可通过个人血糖仪检测
。凭借
CHA
和
HCR
之间的协同等温放大反应
,
该传感
器可实现宽动态范围
(
从
1fmol/L
到
10nmol/L),
检
测限低至
0.36fmol/L(
比没有
HCR
的情况低
3
个
数量级
),
同时能够区分单碱基失配序列
[31]
。此外
,
有研究团队设计了一种创新的可视化方法
,
该方
法结合了
CHA
和
HCR
放大信号
,
可用于
miRNA
的无标记定量
(
图
3)
[11]
。
miRNA-21
存在时
,
可以
打开发夹结构的
DNA
探针
(H1),
形成复合物
H1-
T,
然后复合物
H1-T
通过
CHA
打开发夹
H2,
形
成复合物
H1-H2,
同时释放靶标以进行下一次循
环。在
CHA
反应后
,H1-H2
复合物与
H3
和
H4
杂交
,
进一步启动
HCR
扩增
,
导致大量
G-
四联
体的形成。
G-
四联体与血红素
(hemin)
结合形成过
氧化物酶
,
该酶可以用于模拟
DNAzyme
与
H
2
O
2
产生一系列试纸条显色反应。少量的
miRNA
即可
通过
CHA
和
HCR
有效触发级联放大反应
,
产生
大量血红素
/G-
四联过氧化物酶
,
实现低丰度
miRNA
的定量检测
[11]
。
DNAzyme
是一种具有催化性能的单链核酸
,
能够催化剪切
RNA
或
DNA,
是一种很有潜力的
信号放大器
[6]
。近年来
,
结合
DNAzyme
的
CHA
扩
增策略在
miRNA
的检测中受到了广泛关注
。
Yan
团队
[32]
设计了一种简单且通用的比色策略
,
该策
略基于分子信标引发的链置换扩增
(stranddispla-
cementamplification,SDA)
、
CHA
以及
DNAzyme
可
以对
miRNA
实现超灵敏和特异性检测
。靶标
miRNA
触发
SDA,
释放缺口
DNA
触发器
,
启动
CHA,
产生大量
CHA
产物。这些
CHA
产物可以
与血红素结合形成
G-
四联体
/
血红素
DNAzyme,
用以催化比色反应。该生物传感器在
5fmol/L
到
5nmol/L
动态响应范围内显示出高灵敏度和高选
1.2信号扩增
鉴于
CHA
技术单一检测目前仍存在着一定
的局限性
,
研究者尝试将该技术与其他扩增技术
相结合
,
旨在改善单一检测技术的缺陷与不足。
其中
,CHA
与其他无酶反应相结合的新型扩增策
略现已成为研究热点。这些新型策略可以实现靶
标信号的大量扩增
,
在降低检测限的同时可提高
检测灵敏度与准确度
,
在
miRNA
的检测方面显
现出巨大潜力
,
为临床微量生物标记的检测提供
了新方向。
HCR
的概念是由
Driks
和
Pierce
在
2004
年
提出的
,
现作为一种无酶扩增技术已被广泛应用
择性
,
检测限低至
1.7fmol/L
。此外
,
其通过改变
miRNA
的识别序列
,
可以检测不同的
miRNA;
通
过
SDA
混合物的纯化
,
可以消除基质干扰
,
减少
非特异性
CHA
产物
,
提高检测结果的准确度。有
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90
3忆
2忆
1忆
4
3
2
5
6
生
H1
H1-T
1
2
3
1忆
2忆
3忆
4
3
2
5
6
3
2
命
H2
7
4
2
3
4忆
3忆
1忆
2忆
3忆
4
3
2
5
6
科学研究
圆园23
年
3忆
4忆
4
7
H1-H2
3忆
miRNA
123
H3
HCRamplification
H4
5忆
CHAamplification
Hemin
n
G-quadruplexDNAzyme
图3CHA启动HCR检测miRNA的反应过程
[11]
Fig.3CHAinitiatesthereactionprocessofHCRformiRNAdetection
[11]
研究报道
,
将
SDA
与
CHA
技术结合起来
,
可以有
效区分序列略有不同的干扰
miRNA
[33]
;
将
CHA
策
略与
DNAzyme
介导的催化信号放大和金修饰磁
纳米粒表面上的多层
DNA
结合
,
构建的比色生
物传感器
,
虽然样品处理过程耗时且复杂
,
但拥
有优异的单碱基错配鉴别能力
[34]
。
此外
,Wang
等
[35]
在
2019
年提出了一种恒温
核酸串联扩增体系
,
其将上述两种无酶扩增策略
(HCR
、
DNAzyme)
同时与
CHA
反应结合在一起
,
实
现了更为敏感的
miRNA
检测。该体系由起始的
中间的
HCR
扩增及末端的
DNAzymeCHA
反应、
放大单元组成。上游的靶标检测物触发
CHA
反应
后
,
形成的产物进一步触发
HCR
反应
,
最终得到
含有
DNAzyme
结构的长串联纳米线。最后
,
经
Mg
2+
活化的扩增单元催化裂解被荧光团
/
淬灭剂修
饰的底物
,
产生相应的扩增荧光信号。这种
CHA-
HCR-DNAzyme
方案已被证实可以显著增强单项
检测技术的检测性能
,
可以对
miRNA
进行放大
分析并实现细胞内成像。
1.3信号输出
1.3.1基于电化学信号的CHA输出策略
CHA
可结合化学反应
,
对目标产物进行特异
性检测。在目标物
miRNA-21
上
,
研究者分别对
5-
氨基
-2,3-
二氰基
-1,4-
萘醌
(ADNQ)
和
3(2-
呋
喃
)
丙酸
(FPA)
进行修饰
,
通过
CHA
反应破坏
AD原
NQ
的化学结构
,
使其发生第尔斯
-
阿尔德反应
(Diels-Alderreaction),
导致电化学反应信号减弱
,
基于此过程
,
研究人员可检测
miRNA-21
的浓
度
[36]
。基于碳球
-MoS
2
(CS-MoS
2
)
和
CHA
策略的靶
向回收扩增
,
研究人员开发了一种三明治型电化
学生物传感平台
,
用于
miRNA
的超灵敏测定。该
检测方法得益于夹层式结构的优势
、
CS-MoS
2
良
好的电化学性质和
CHA
靶标回收扩增策略
,
对
miRNA-21
具有
1.6伊10
-17
mol/L
的低检测限
[6]
。另
外一种结合
SDA
的扩增策略
(
图
4),
同样通过电化
学信号进行输出
[37]
。靶标
miRNA-21
与双链
DNA
聚合
,
在限制性内切酶作用下产生切口
,SDA
在
此切口释放大量与靶标
miRNA-21
相关的触发
DNA,
引发
CHA
反应
,
所得的
H1-H2
复合物裸
露出的一端与金电极表面的辅助探针杂交
。研究
者利用生物素与链霉亲和素的特异性识别作用
,
将含有链霉亲和素的碱性磷酸酶固定在修饰电极
表面
,
获得电化学信号
,
实现了靶标
miRNA-21
的高灵敏定量检测
[37]
。
1.3.2基于荧光显色的信号输出策略
DNAAg
纳米团簇
(nanocluster,NC)
是一种新
型荧光纳米材料
,
其因独特的优点即超小尺寸
、
可增强光致发光、低毒和优良的生物相容性等而
备受关注。有研究团队提出了一种无酶等温
CHA
荧光传感策略
,
该策略通过点亮荧光
DNAAgNC
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第
1
期
龙禹同等：催化发夹自组装技术用于
miRNA
检测的研究进展
Endonucleasesite
Biotin
91
Thechainofthe
substrate
H1hairpin
H2hairpin
TargetofmiRNA
Klenowfragment
DNApolymerase
Thetriggerchain
CHA
estriction
enzyme
Chain
replacement
amplification
琢-Naphtholphosphate
琢-Naphthol
Auxiliaryprobe
Streptavidinalkaline
phosphatase
Electrochemical
analysis
Voltage/V
图4基于SDA和CHA级联放大策略构建电化学生物传感器高灵敏检测miRNA-21的原理示意图
[37]
Fig.4TheschematicdiagramoftheelectrochemicalbiosensorconstructedbasedonSDAandCHAcascadeamplifi-
cationstrategyforhighlysensitivedetectionofmiRNA-21
[37]
6-Mercapto-1-
hexanol
对
miRNA
进行灵敏检测。在该平台中
,AgNC
被
设计为组装元件
,
它们可以在没有靶标的情况下
保持稳定
;
在添加靶标分子
miRNA
后
,CHA
反应
得以启动
,AgNC
被转化为多聚鸟嘌呤延长的双
链
DNA
产物
,
从而产生放大的荧光信号
。该策略
检测
miRNA-21
的检测限低至
38pmol/L
[38]
。
1.3.3基于纳米颗粒的信号输出策略
有研究团队将金纳米
(AuNP)
材料作为“信号
转换物质
”
,
与
CHA
检测策略结合起来
,
用以检
测
miRNA
。他们通过在
AuNP
表面组装两种荧光
素
(fluorescein,FAM)
标记的发夹探针
(H1
和
H2),
设计了一种基于
LCHA
的
3DDNA
步行器
,
该装
置处于非活动状态时
,AuNP
通过表面能量转移
进行荧光猝灭产生的荧光信号可以忽略不计。
该
传感平台的检测限低至
6.1pmol/L
。而且
,
由于其
自供电和无酶特性
,
极其适用于原位监测癌细胞
另外
,
还有一种利用
AuNP
对发卡中的
miRNA
[39]
。
进行修饰
,
构成探针
,
同时结合试纸条生物传感
器的定量检测方法
,
该方法通过生物素和链霉亲
和素的作用
,
建立
SERS
强度与
miRNA-21
浓度
之间的定量关系
,
可以实现
miRNA-21
含量的精
确测量
[40]
。也有研究者通过将
4
个不同发夹结构
DNA
序列
1
中的一个固定到
4
个
Au/Ag
合金纳
米颗粒
(Au/AgNP)
涂层检测孔的其中一个上
,
构建
了具有
4
个不同传感单元的传感器阵列
,
当存在
靶向
miRNA
时
,SERS
标签通过重复的特异性
CHA
反应捕获到相应的传感器上
,SERS
标签与
传感器的
Au/AgNP
涂层表面之间的相互作用产
生许多“热点”基于该策
,
释放强烈的
SERS
信号。
略
,
研究人员实现了多种癌症相关
miRNA(miR原
NA-1246
、
miRNA-221
、
miRNA-133a
和
miRNA-
21)
的检测
[41]
。
1.3.4基于试纸条等的可视化信号输出策略
利用咖啡环效应
,
将纸张信号转导与
CHA
结合可实现
miRNA
的定量检测
。靶标
miRNA
一
旦出现
,
就会引发
CHA
反应
,
产生大量的
G-
四
联体
,
其与血红素结合形成血红素
/G-
四联体
DNA
酶。
DNAzyme
催化比色反应产生彩色纳米颗
粒
,
这些纳米颗粒通过蒸发驱动流动到纸张的末
端边缘
,
形成可见的彩色条带
。
miRNA
含量越高
就会产生越多的纳米颗粒
,
带有颜色的条带也就
有研越长
,
条带的长度可以简单地用尺子测量
[33]
。
究者把葡萄糖氧化酶
(glucoseoxidase,GOD)
标记
的发夹
DNA
探针作为桥梁
,
将
miRNA
与双发射
率荧光探针
(ratiometricfluorescent,RF)
的荧光猝
灭信号连接起来
,
实现了
miRNA
肉眼可见的检
测
(
图
5)
[42]
。过氧化氢
(H
2
O
2
)
是由大量
GOD
催化葡
萄糖氧化产生的
,
可以在不影响
RF
内部红色荧
光的情况下淬灭外部绿色荧光。因此
,
增加
mi-
RNA
的含量可导致
RF
探针的两种荧光强度比发
生变化
,
在紫外灯下颜色从绿色连续变为红色
,
肉眼即可识别
[42]
。
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92
3
2
1
4
3
*
2
*
生命科学研究
4
12343
*
2
*
let-7a
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5
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*
圆园23
年
Dynabeads-STV
6
*
5
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7
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*
1
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*
CHA
1234
3
*
2
*
2
*
3
*
4
*
3
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*
2
*
7
*
H2-GOD
5
*
H1-GOD
Glucose
1234
3
*
H
2
O
2
H1-GOD
**
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let-7a
H
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O
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*
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*
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Glucose
7
*
6
*
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H2-GOD
H
2
O
2
图5GOD标记的发夹DNA探针用于miRNA检测的示意图
[42]
Fig.5SchematicdiagramofmiRNAdetectionusinghairpinDNAprobeslabeledbyGOD
[42]
2总结与展望
miRNA
的正常表达是人体生理过程所必须
实
的
,
其检测方法众多
,
包括
Northern
印迹杂交
、
时荧光定量
PCR
、滚环扩增、
CHA
等。
其中
,CHA
技术因无需酶扩增、操作简单方便、检测特异性强
等优势成为了人们关注的热点
,
为
miRNA
检测
和相关疾病诊断提供了重要技术手段。该技术的
优势也在于与其他领域的技术结合
,
有利于生物
传感器选择性性能的提升以及稳定性的提高
。
本文着重对
CHA
的检测策略进行介绍及分
析。目前
,CHA
技术的研究不断取得进展
,
显示出
了其在未来
miRNA
检测领域具有的巨大潜力
,
但
CHA
技术存在着序列设计繁琐
,
在检测某些
序列时会出现背景信号干扰从而造成实验结果准
确性降低等问题
,
同时该技术也面临着诸多限制
和挑战。
首先
,
当前该技术的研究和讨论重点普
遍在于灵敏度以及扩增效率
,
而对于反应条件和
反应成本的权衡少有思考
;
其次
,
该技术对于可
以检测的
miRNA
的种类存在特异性
,
通常一次
只能检测一种
miRNA,
然而在实际检测环境中常
会同时存在多种
miRNA,
就目前状况来看
,
该技
术难以实现对多种
miRNA
的同时检测。另外
,
在
样本的提取过程中
,
所检测的靶序列难免会出现
碱基对丢失、序列不完整的情况
,
这极大影响了检
测的效果。针对这种情况
,
在催化发夹的基础上
,
是否可以尝试设计多种生物素发夹
,
对含有缺失
碱基对的序列进行检测
,
从而提高检测的灵敏
度？这或许是一个值得探讨和改进的方向。
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叶
生命科学研究
曳野
高校教改研究与实践
冶
栏目征稿启事
科技部批准创办的，国内外公开发行的反映生
《生命科学研究》是由中华人民共和国新闻出版署
、
命科学领域中最新研究成果的综合性学术期刊，是中国高校优秀科技期刊、第三届湖南出版政府奖提
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中国科技论文与引文数据库、中国核心期刊（遴选）
的国内外多家重要检索数据库，并加入了“中国知网”《中国学术期刊（网络版）》（CAJ-N）网络首发出版
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。
为了交流高等学校在生物学、基础医学、农学等生命科学领域教育教学的研究成果，促进高校教师
本刊决定从
2023年开始开设
栏目，诚邀反映生命科学高
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等教育教学领域改革与创新的原创性论文，具体要求如下：
一
尧
刊登范围
高校校本课程开发和国家精品课程建设的研究成果；
新方法；
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、
高校教育教学实验的创新性设计和实践；
聚焦国家高等教育中的热点问题进行理论探讨的前沿方向性研究成果；
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6.反映高校教材理念、结构、内容等方面的创新性研究
；
研究内容可从以上几方面考虑（但不局限于此）。
二
尧
来稿要求及权益
1.
2.
3.
4.
5.
1.投稿本栏目的论文要求第一作者为具有博士学历及高级职称的全日制高等学校教学或实验人员。
字数控制在
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4.通过本刊外审和终审的稿件，电子版以最快的方式在“中国知网”网络首发平台全文出版，并予
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5.正式见刊的稿件均由本刊负责付费在同方知网平台上进行大力推广，增加曝光率和引用率。
叶
生命科学研究
曳
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