2024年4月1日发(作者：)

Hereditas (Beijing)

2018年5月, 40(5): 390

―

401

研究报告

N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神

经元迁移

沈秀莲，逯宜超，甲芝莲，吴强

上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学研究中心，系统生物医学教育部重点实验室，上海 200240

摘要:

在大脑皮层发育过程中，神经元迁移是一个动态的复杂过程，与细胞骨架构建和重塑的调控息息相关。

N-WASP蛋白是Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族(WASP-WAVE family)的一个重要成员，又名WAS-like蛋白

(WASL)，直接参与细胞骨架中肌动蛋白丝状分支的动态调控。本研究通过蛋白免疫印迹检测发现N-WASP表

达于小鼠胚胎发育时期(E12.5~E18.5)的大脑皮层中，并且其表达水平随着发育逐渐降低。利用在体子宫内胚胎

电转实验，结果发现过表达或者敲低N-WASP均会造成不同程度的大脑皮层神经元迁移障碍，说明N-WASP

在大脑皮层神经元迁移中起到关键作用。N-WASP蛋白主要包含4个结构域：WH1、GBD、polyPro和VCA。

为进一步研究N-WASP各结构域在神经元迁移中的调控功能，设计了一系列的显性负性突变实验。通过过表达

结构域删除的N-WASP蛋白，发现polyPro、VCA和WH1均能造成神经元迁移障碍。但是，过表达不能结

合Cdc42的N-WASP蛋白(H208D突变体)却不能造成明显的神经元迁移障碍。另外，单独过表达N-WASP的

结构域polyPro或VCA能够造成神经元迁移障碍，而过表达WH1结构域却不能影响迁移。最后，通过过表达

polyPro和VCA结构域同时删除的N-WASP (WH1-GBD)，发现WH1-GBD结构域对神经元迁移没有明显影响。

上述结果表明N-WASP蛋白主要是通过polyPro和VCA两个结构域调控大脑皮层神经元的迁移过程。

关键词:

大脑皮层神经元迁移；N-WASP；子宫内胚胎电转技术；肌动蛋白细胞骨架动态

N-WASP regulates cortical neuron migration through its polyPro

and VCA domains

Xiulian Shen, Yichao Lu, Zhilian Jia, Qiang Wu

Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Center for Comparative Biomedicine, Institute of Systems

Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Abstract:

Cortical neuron migration in the developing mouse forebrain is a complex process, which contains several

steps related to cytoskeleton dynamics and remodeling. Neural Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP), a member of

收稿日期: 2018



03



15; 修回日期: 2018



04



19

基金项目:国家自然科学基金(编号：91519302，31171015)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 91519302,

31171015)]

作者简介: 沈秀莲，硕士研究生，专业方向：发育神经生物学。E-mail: shenxiulian92@

通讯作者:吴强，博士，教授，研究方向：基因表达调控及神经发育。E-mail: qiangwu@

DOI: 10.16288/.18-066

网络出版时间: 2018/5/4 16:31:54

URI: /kcms/detail/

第

5

期

沈秀莲等: N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移 391

the WASP-WAVE family, regulates actin cytoskeleton reorganization through the binding of its VCA domain to the

Arp2/3 complex. Here we report expression patterns of N-WASP gene in the mouse developing embryonic cortex (E12.5~

E18.5)

and find its expression levels are decreased during embryonic development

. By using in utero electro-

poration (IUE) method, we find that either N-WASP overexpression or knockdown impairs cortical neuron migration, and

the defects of cortical neuron migration caused by N-WASP overexpression are much more severe than that by its knock-

down. N-WASP protein contains four domains: WH1, GBD, polyPro, and VCA. We generated a series of dominant negative

N-WASP mutants by modifying these domains. Overexpression of N-WASP mutant lacking domain polyPro, VCA, or WH1,

impairs cortical neuron migration. However, overexpression of N-WASP with the H208D point mutation, which abolishes

the Cdc42 binding to N-WASP, causes only a marginal defect of cortical neuron migration.

Finally,

overexpression of the

individual domain polyPro or VCA, but not WH1, can recapitulate the defects by N-WASP overexpression.

However,

overexpression of WH1-GBD fragment has no apparent effect on cortical neuron migration. In conclusion, our data demon-

strate that N-WASP regulates cortical neuron migration mainly through its polyPro and VCA domains.

Keywords:

cortical neuron migration; N-WASP; in utero electroporation; actin cytoskeleton dynamics

意义

[1]

。

原钙粘蛋白介导的细胞粘连与神经元迁移和神

经细胞多样性密切相关

[11~14]

。原钙粘蛋白家族在神

经元树突和轴突发育中也起到关键作用

[15~20]

。最近

的研究发现原钙粘蛋白可能与WASP-WAVE (Wiskott-

Aldrich syndrome protein and WASP-family verprolin-

homologous protein)信号通路有关

[13,21]

。WASP是

该疾病

Wiskott-Aldrich综合征(WAS)的致病基因

[22]

，

是一种包括湿疹(eczema)在内的性染色体连锁的隐

性免疫缺陷疾病

[23,24]

。WASP蛋白家族共包含11个

成员，该家族与肌动蛋白的动态调控有关

[25]

，在各

种生理和病理过程中对诸如胞吞(endocytosis)、胞吐

(exocytosis)、丝状伪足(filopodia)、板状伪足(lamel-

lipodia)、侵袭伪足(invadopodia)等细胞形态的调控

起到关键作用

[26]

。细胞接收外界信息通过复杂的信

号传递通路最终汇集到Arp2/3复合体(actin-related

protein 2/3 complex)上，然后调控肌动蛋白丝状分支

的动态组装，此动态组装对于神经元迁移以及神经

细胞的形态发生也是非常重要的

[27,28]

。

N-WASP(neural-Wiskott-Aldrich syndrome pro-

tein)是WASP-WAVE家族成员之一

[25]

，最初发现于

牛(Bos taurus)的脑提取物中，因其与WASP氨基酸

序列的高度相似性，故命名为N-WASP(神经性

WASP)

[29]

。它是一个广泛表达的蛋白，不仅在大脑

中有丰富的表达，而且在心脏、肺等其他组织中也

人类大脑皮层是进化上最晚出现、结构上最为

复杂的脑部结构

[1]

，其在脑的高级认知或执行功能

(cognition or executive function)中发挥着重要作用。

大脑皮层的发育涉及一系列复杂的过程，包括神经

元的增殖(proliferation)、迁移(migration)和分化(dif-

ferentiation)等。大脑皮层是由出生于脑室区(vent-

ricular zone, VZ)的兴奋性神经元前体和出生于皮质

下区(subpallium)的抑制性神经元前体，分别通过放

射状(radial migration)和切线状(tangential migration)

并以先到内侧后到外侧(inside-out)模式迁移形成的

板层结构(laminar structure)

[2~7]

。其中，兴奋性神经

元前体放射状迁移模式是一个非常复杂的动态协同

调控过程：首先，脑室区(ventricular zone, VZ)的神

经祖细胞通过不对称分裂产生中间祖细胞(transit

amplifying intermediate neuronal progenitor cells)；然

后，这些祖细胞在脑室下区(subventricular zone, SVZ)

继续分裂1~3次后，再以多极状态在中间区(inter-

mediate zone, IZ)中迁移；最后，祖细胞转变成双极

状态沿着神经胶质细胞纤维以放射状迁移的方式到

达皮质区(cortical plate, CP)

[8~10]

。该过程需要多种信

号通路协同调控细胞骨架的动态平衡来完成

[4]

，其

正常进行对于后续神经元回路以及神经系统功能的

正常发挥起着重要作用。而且，人们发现神经元迁

移异常能够导致多种神经精神疾病，因此研究其分

子调控机制对于了解精神疾病的发生原因有着重要

392 Hereditas (Beijing)

2018

第40卷

有表达

[29]

。N-WASP蛋白主要含有4个功能性结构

域：WH1 (WASP homology 1)、GBD (GTPase-binding

domain)、polyPro (proline-rich SH3-adaptor-binding

region)和VCA (verprolin and cofilin homology re-

gions and the acidic domain)

[30]

。研究已证实，WH1

结构域与N-WASP被招募到肌动蛋白组装的位点有

关

[31]

，而GBD、polyPro和VCA这3个结构域主要

调控N-WASP蛋白的活性状态

[25,30]

。N-WASP主要

通过构象转换(conformational change)释放出VCA结

构域激活Arp2/3复合体来调控肌动蛋白的组装

[32]

。具

体来讲，N-WASP有激活和未激活两种构象状态：

在未激活构象状态下，N-WASP的GBD结构域和

VCA结构域相互作用而使VCA结构域被掩藏，不

能与肌动蛋白单体和Arp2/3复合体相互作用；在激

活构象状态下，VCA结构域被暴露出来并与Arp2/3

复合体相互作用，verprolin结构域上结合的肌动蛋

白单体输送到肌动蛋白丝状分支，从而促进肌动蛋

白的组装

[30,33]

。一些上游的信号分子可以激活N-

WASP，使其释放出VCA结构域。例如，Cdc42 (cell

division cycle 42)通过结合GBD结构域而释放出VCA

结构域；Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2)，

Nck(non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor

protein)等含有SH3(Src homology 3)结构域的接头蛋

白(adaptor proteins)则通过与polyPro结构域相互作

用，从而解除这种自抑制状态，释放VCA结构域

[34~38]

。

最后，N-WASP通过形成二聚体或寡聚体进一步激

活Arp2/3复合体，从而达到最大的活性

[30,39]

。

N-WASP敲除会导致小鼠(Mus musculus)胚胎致

死并伴随神经管形成缺陷

[40]

，在小鼠大脑中条件性

敲除N-WASP会导致脑积水的症状

[41]

，说明N-WASP

在小鼠大脑的发育中起着重要作用。此外，之前有报

道称mDab1 (mouse disabled homologue1)基因突变

会导致小鼠大脑皮层发育异常，造成皮层的异位，与

摇晃蛋白Reelin基因敲除小鼠表型一致

[42]

。而体外

细胞实验显示mDab1可与N-WASP相互作用诱导丝

状伪足(filopodia)的生成

[43]

，说明N-WASP可能在神

经元迁移中起重要作用，但至今未见有直接的证据。

本研究利用蛋白免疫印迹(Western blot, WB)检

测发现N-WASP在小鼠大脑皮层的发育过程中持续

表达并且呈现逐渐下降的模式，然后采用在体子宫

内胚胎电转技术在E14.5的小鼠大脑皮层神经元中

过表达与敲低N-WASP，实验结果均表明会造成神

经元迁移障碍，而且过表达N-WASP所导致的神经

元迁移障碍会比敲低N-WASP产生的影响更严重。

此外，通过在体子宫内胚胎电转技术过表达显性负

性突变蛋白，发现过表达VCA，polyPro或者

WH1突变体，以及VCA或者polyPro结构域均会

导致神经元迁移障碍，而过表达WH1，WH1-GBD

结构域以及H208D突变体却对神经元迁移没有明显

影响。这些实验结果表明N-WASP主要是通过

polyPro和VCA结构域的协调作用来调控大脑皮层

的神经元迁移。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠(南方模式动物中心)；HEK293T

细胞(上海细胞库)；N-WASP抗体(Abcam公司，英

国)；-actin抗体、抗鼠以及抗兔二抗(Proteintech

公司，美国)；DNA质粒中抽试剂盒Compactprep

Plasmid Midi Kit(25)(Qiagen公司，德国)；固绿FCF

(Fast Green FCF)、戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)；

Stbl3大肠杆菌菌株、脂质体Lipofectamine

TM

3000

以及Prolong

TM

Gold antifade reagent(Invitrogen公司，

美国)；逆转录试剂盒Reverse Transcription System

(Promega公司，美国)；电转仪(Bio-Rad，美国)；自

动震荡切片机(Leica，德国)；共聚焦显微镜(Leica，

德国)；Western blot全套装置(Bio-Rad，美国)；荧

光显微镜(Zeiss，德国)。

1.2 质粒构建

全长的N-WASP cDNA (GenBank 318416)

是通过提取小鼠大脑总RNA再经过逆转录PCR

(RT-PCR)获得，并被克隆到pCAG-Myc载体中，其

突变体WH1, WH1,WH1-GBD, H208D, VCA,

VCA, polyPro, polyPro通过设计突变引物由全长

N-WASP突变得到。用于敲低实验的短发夹环RNA

(shRNA)编码序列是克隆到pLKO.1载体(Sigma)上

的。实验所用引物序列列于表1。

第

5

期

沈秀莲等: N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移 393

表1 本研究使用的引物

Table 1 Primers used in this study

引物

N-WASP shRNA1-F

N-WASP shRNA1-R

N-WASP shRNA2-F

N-WASP shRNA2-R

N-WASP_EcoRI_F

N-WASP_HindIII_R

N-WASP_H208D_F

N-WASP_H208D_R

N-WASP_VCA_R

VCA_EcoRI_F

WH1_HindIII_R

N-WASP_WH1_F

N-WASP_polyPro_R

N-WASP_polyPro_F

polyPro_EcoRI_F

WH1_GBD_HindIII_R

SCR_F

SCR_R

序列(5→3)

CCGGAAGACGAGATGCTCCAAATGGCTCGAGCCATTTGGAGCATCTCGTCTTTTTTTG

AATTCAAAAAAAGACGAGATGCTCCAAATGGCTCGAGCCATTTGGAGCATCTCGTCTT

CCGGCAGATACGACAGGGCATTCAACTCGAGTTGAATGCCCTGTCGTATCTGTTTTTG

AATTCAAAAACAGATACGACAGGGCATTCAACTCGAGTTGAATGCCCTGTCGTATCTG

TGGAATTCGACACCATGAGCTCGGGCCAGCAG

CCCAAGCTTGCGTCTTCCCACTCATCATC

TCCAGGACATTGGGCATGTTG

CCAATGTCCTGGAAATTACTTGG

CCCAAGCTTGCGTCACCATCAGAAGGCAGGC

TGGAATTCGACACCATGGACCATCAAGTTCCAGC

CCCAAGCTTGCTAGATTGGGACCATTTGGAGCAT

TGGAATTCGACACCATGCTACCCATGGCTACAGTTG

CTTGATGGTCTGGTGCTTGTCTTCGGAGTTC

ACAAGCACCAGACCATCAAGTTCCAGC

TGGAATTCGACACCATGAGACAAGCACCACCACCACCT

CCCAAGCTTGCTGGTGCTTGTCTTCGGAGTTC

CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG

AATTCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTG

1.3 细胞培养、转染

HEK293T细胞的培养基是DMEM(10% FBS,

100 g/mL青霉素/链霉素双抗)，首先使用不含抗生

素的培养基培养HEK293T细胞，待细胞密度达

到70%~90% (大约24 h)即可使用Lipofectamine

TM

3000进行细胞转染，24 h后换液，48 h后裂解细胞

收取蛋白，进行Western blot实验。

蛋白转至NC膜上；转膜完毕后，将膜放入适量的

封闭液(5%的脱脂牛奶)中，室温孵育1 h；倒掉封闭

液，加入一抗，4℃孵育过夜；将膜加入1×TBST溶

液中，室温下洗膜5 min，重复4次；加入二抗，室

温孵育1 h；将膜放入

1×TBST溶液中，室温下洗

膜5 min，重复4次；最后用Odyssey双色红外激光

成像系统扫膜成像。

1.4 蛋白免疫印迹

配制10%分离胶(10 mL)：3.97 mL MilliQ水，

3.33 mL 30%Arc-Bis，2.5 mL 1.5 mol/L Tris-HCl(pH

= 8.8)，100 L 10%SDS，100 L 10%过硫酸铵，4 L

四甲基乙二胺(TEMED)；4%浓缩胶(4 mL)：2.39 mL

MilliQ水，0.53 mL 30%Arc-Bis，1 mL 0.5 mol/L

Tris-HCl (pH = 6.8)，40 L 10% SDS，40 L 10%过

硫酸铵，4 L四甲基乙二胺(TEMED)；将样品与

SDS-PAGE上样缓冲液按比例混合好，95℃变性5

min后加入上样孔中；电泳：80 V，30 min；110 V，

120 min；电泳完毕后，根据蛋白Marker大小，将

包含目的蛋白的PAGE胶切下：110 V，105 min将

1.5 小鼠饲养

C57BL/6J小鼠的饲养环境为23℃恒温，12 h (7：

00~19：00)光照和12 h (19：00~7：00)黑暗。所有

的小鼠实验均符合Institutional Animal Care and Use

Committee的规定。取成年的雌性与雄性小鼠于下午

16：00后进行合笼，第二天上午12：00前检查雌

鼠有没有阴道栓，如果有阴道栓就将时间记为胚胎

期(embryonic day 0.5: E0.5)。

1.6 胚胎电转

E14.5时，向怀孕的母鼠腹腔注射0.6%的戊巴

比妥钠进行麻醉，期间配制注射的质粒混合物[pCAG-

394 Hereditas (Beijing)

2018

第40卷

Myc质粒(2.5 g/L)或者pLKO.1质粒(4 g/L)、

eGFP质粒(0.5 g/L)以及0.3% Fast green]。

将母鼠放在加热板上，用剪刀将母鼠腹部的毛

剃干净，再用酒精与碘酒进行消毒。将母鼠腹部剪

开一个口子，再将一块灭菌的纱布剪开一个口子并

将其放于母鼠腹部开口处，将子宫取出放在纱布上，

并加0.9%的NaCl溶液于胚胎上。然后向胚胎脑室

注射配制好的质粒混合物，使用含有钳片电极的电

转仪将质粒转到胚胎大脑皮层脑室区的神经祖细胞

中。电转使用的程序为电压37 V，持续时间50 ms，

间隔900 ms，5次。

将子宫放回母鼠腹腔中并加1 mL 0.9%的NaCl

溶液，缝合好伤口后将母鼠放在恒温板上，待母鼠

醒来后放回饲养笼盒，继续饲养。

1.7 取脑、切片、制片及拍片

E17.5时，将胎鼠的头部剪下，在显微镜下操作

取出大脑，放入含有4% PFA的离心管中，放于摇

床上室温孵育24 h进行固定。

使用自动震荡切片机切出50 m的脑片，用

DAPI进行细胞核染色，再用1×PBS清洗3次，然

后将脑片放在载玻片上，用封片剂封好。

使用共聚焦显微镜获取处理好的脑片图像。

1.8 数据分析

RNA-seq数据分析：数据下载于ENCODE (Enc-

yclopedia of DNA Elements)数据库

[44]

，经Cufflinks

2.1.1处理计算分析得到基因表达水平数值。文中使

用的数据Gene Expression Omnibus (GEO)序列号：

GEO:GSE82852，GEO:GSE78340，GEO:GSE78323，

GEO:GSE78374。

数据分析使用GraphPad Prism 5.0软件，各组间

平均值差异程度的检验方法用Student’s t test或者

One-way ANOVA进行检验分析。

2 结果与分析

2.1 N-WASP在小鼠胚胎期大脑皮层中呈现逐

渐降低的表达模式

已有研究报道，N-WASP蛋白的表达在出生后

的大鼠皮层中是逐渐增加的，并在出生后16周维持

稳定

[45]

，同时有文献报道其对于神经突起的延伸以

及突触发生有重要作用

[46~48]

，说明N-WASP在大脑

发育中起着重要的作用，但N-WASP在小鼠胚胎期

大脑皮层发育过程中的具体表达情况却未见相关报

道。本研究首先提取了不同时期(E12.5、E14.5、E16.5、

E18.5和P1)的小鼠大脑皮层组织进行免疫印迹实验

检测蛋白表达水平，发现N-WASP蛋白在胚胎期皮

层有表达，并随着胚胎发育呈现下降的模式(图1A)。

然后从ENCODE数据库中下载了小鼠(C57BL/6)前

脑(forebrain)在不同时期(E12.5、E14.5、E16.5和P0)

的RNA-seq数据

[44]

，使用Cufflinks 2.1.1对其进行

分析，发现N-WASP在mRNA水平上有表达并且随

着发育过程呈现下降的模式(图1B)，该结果与蛋白

免疫印迹实验一致。

2.2 N-WASP过表达或者敲低均会造成小鼠大

脑皮层神经元迁移障碍

N-WASP蛋白在小鼠大脑皮层的表达从E12.5

到P1呈现逐渐下降的模式，其表达量高的时期与大

脑皮层神经元迁移的时间段(E11~E16)吻合，预示其

可能参与调控神经元的迁移。由此，设计了2个不

同的shRNA进行在体胚胎电转敲低实验。首先，通

过WB检验了shRNA的效率，发现它们能有效敲低

N-WASP蛋白的表达水平(图2A)。然后，利用子宫

内胚胎电转技术，将shRNA表达质粒转入E14.5的

胎鼠大脑皮层神经祖细胞中，在E17.5时取脑并切

片观察。与对照组相比，发现N-WASP敲低会造成

小鼠大脑皮层神经元的迁移缺陷(图2B)。

为进一步研究N-WASP调控神经元迁移的具体

功能，构建了N-WASP真核过表达质粒，然后通过

子宫内胚胎电转技术将该质粒转入E14.5的胎鼠大

脑皮层神经祖细胞中，同样在E17.5时切片观察。

与对照组相比，发现过表达N-WASP也会造成小鼠

大脑皮层神经元的迁移缺陷(图2C)。并且，过表达

N-WASP造成的神经元迁移障碍比敲低N-WASP所

造成的神经元迁移障碍更加显著(图2：B，C)。

上述结果说明，N-WASP过表达或敲低均会造

成神经元迁移障碍，表明其在神经元迁移中起着重

要作用。

第

5

期

沈秀莲等: N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移 395

图1 N-WASP在小鼠皮层中的表达

Fig. 1 The expression profile of N-WASP in mouse cortex

A：蛋白免疫印迹检测在胚胎发育过程中N-WASP蛋白的表达量，下方是对蛋白免疫印迹进行的定量分析；B：Cufflinks 2.1.1分析

N-WASP在胚胎发育过程中mRNA水平。FPKM，fragments per kilobase of transcript per million mapped reads，每一百万个mapped reads

中map到1kb转录本上的fragments个数。FPKM=cDNA fragments/(mapped reads(millions)× transcript length(kb))。

2.3 N-WASP主要通过polyPro和VCA结构

域调控小鼠大脑皮层神经元迁移

N-WASP主要通过VCA结构域结合活化的肌动

蛋白以及Arp2/3复合体引起肌动蛋白组装

[32]

，其在

未激活的情况下处于自抑制的状态(GBD与VCA相

互作用)，需要上游信号Cdc42激活并打开这种自抑

制状态，进而引起肌动蛋白的组装

[25,33]

。N-WASP

除了通过上述经典的GTPase激活通路之外，还可以

通过polyPro结构域与含有SH3结构域的接头蛋白

结合进行激活

[25]

，而它的WH1结构域主要与WIP

(WASP-interacting protein)家族相互作用，该作用与

N-WASP招募到肌动蛋白组装的地点有关

[31]

。

为更加深入研究N-WASP调控神经元迁移的分

子机制，首先构建了VCA结构域删除(ΔVCA)、

polyPro结构域删除(ΔpolyPro)、WH1结构域删除

(ΔWH1)以及破坏了Cdc42结合位点

[34]

(H208D突变

体)的N-WASP蛋白表达质粒(图3A)。然后通过子宫

内胚胎电转技术，将这些质粒分别转到E14.5的大

脑皮层中，在E17.5时切片观察。结果发现单独过

表达ΔVCA、ΔpolyPro或者ΔWH1的N-WASP蛋白

均会造成严重的神经元迁移障碍，而过表达H208D

突变的N-WASP蛋白却没有造成明显的神经元迁移

障碍(图3B)。最后，利用构建的VCA结构域过表达

质粒(VCA)、polyPro结构域过表达质粒(polyPro)、

WH1结构域过表达质粒(WH1)、WH1-GBD结构域

(同时删除polyPro和VCA结构域)过表达质粒

(WH1-GBD)(图3A)，进行了类似的子宫内胚胎电转

实验。结果表明单独过表达VCA蛋白或polyPro蛋

白均会造成严重的神经元迁移障碍，但是过表达

WH1蛋白或WH1-GBD蛋白对神经元迁移没有明显

影响(图3C)。

综上所述，N-WASP是通过VCA结构域激活下

游信号通路来调控神经元迁移，并且主要通过

polyPro结构域接收上游信号调控神经元迁移，而

Cdc42激活N-WASP进而打开VCA的这条信号通路

只是部分参与对神经元迁移的调控。此外，WH1结

构域可能不参与N-WASP

对神经元迁移的调控。

3 讨 论

大脑皮层的正常发育对于其执行记忆、学习和

感觉的功能是非常重要的，其中神经元迁移是大脑

皮层发育中的一个重要过程。神经元迁移是一个高

度动态化的协同调控过程，通过细胞骨架中肌动蛋

白的动态组装影响神经元前体的形态进而调控神经

元迁移

[28]

。WASP家族中的WAVE蛋白和其他4个

蛋白可形成一个五聚体复合物(pentameric WAVE

396 Hereditas (Beijing)

2018

第40卷

图2 过表达和敲低N-WASP均会造成大脑皮层神经元迁移障碍

Fig. 2 Both overexpression and knockdown of N-WASP impair cortical neuron migration

A：蛋白免疫印迹检测shRNA敲低效率，右图是对蛋白免疫印迹进行的定量分析；B：子宫内胚胎电转实验观察敲低N-WASP对神

经元迁移的影响，右侧为每个区域中GFP阳性细胞所占总阳性细胞百分比的统计图，每组样本数量n≥3只小鼠胚胎，显著性表示的

是N-WASP shRNA1或者N-WASP shRNA2与SCR之间的对比，SCR：scrambled shRNA，即不靶向任何基因；C：子宫内胚胎电转

实验观察过表达N-WASP对神经元迁移的影响，右侧为每个区域中GFP阳性细胞所占总阳性细胞百分比统计图，每组样本数量n≥3

只小鼠胚胎。数据结果以Mean±SEM表示，标尺：100 m，*：P<0.05 表示有统计学差异，**：P<0.01表示有显著的统计学差异，

***：P<0.001 表示有极其显著的统计学差异。MZ：marginal zone，边缘区；CP：cortical plate，皮质区；IZ：intermediate zone，中

间区；SVZ：subventricular zone，室下区；VZ：ventricular zone，脑室区。

regulatory complex, WRC)，然后被大约120种膜蛋白

招募到细胞膜附近，进而引起肌动蛋白的组装

[21]

。

这些膜蛋白包括很多原钙粘蛋白(protocadherin,

PCDH)、Celsr3 (cadherin EGF LAG seven-pass G-type

receptor 3)、Fat3 (FAT atypical cadherin 3)等

[18,21]

。原

钙粘蛋白通过抑制Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase

2)的活性而激活Rac1 (Ras-related C3 botulinum

toxin substrate 1)来调控神经元的树突与树突棘的形

态生成

[16]

。此外，N-WASP能够调节神经元突起

(neurites)以及突起的生长锥导向

[49,50]

，然而其在神

经元迁移中的功能和机制依然是不清楚的。

本研究使用在体子宫内胚胎电转技术研究

N-WASP蛋白在小鼠大脑皮层神经元迁移中所起的

作用，发现N-WASP调控神经元迁移主要依赖于

polyPro和VCA结构域。通过提取不同时期的胚胎

大脑皮层组织(E12.5、E14.5、E16.5、E18.5和 P1)

第

5

期

沈秀莲等: N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移 397

图3 N-WASP主要通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移

Fig. 3 N-WASP regulates cortical neuron migration mainly through its polyPro and VCA domains

A：实验所用质粒示意图；B：过表达删除或突变各结构域的N-WASP蛋白对神经元迁移的影响，右侧为每个区域中GFP阳性细胞所

占总阳性细胞的百分比统计图，每组样本数量n≥3只小鼠胚胎，显著性表示的是H208D与N-WASP之间的对比；C：过表达N-WASP

蛋白各结构域对神经元迁移的影响，右侧为每个区域中GFP阳性细胞所占总阳性细胞的百分比统计图，每组样本数量n≥3只小鼠胚

胎，显著性表示的是WH1或WH1-GBD与N-WASP之间的对比。数据结果以Mean ± SEM表示，标尺：100 m，*：P<0.05表示有

统计学差异，**：P<0.01表示有显著的统计学差异，***：P<0.001表示有极其显著的统计学差异。MZ：marginal zone，边缘区；CP：cortical

plate，皮质区；IZ：intermediate zone，中间区；SVZ：subventricular zone，室下区；VZ：ventricular zone，脑室区。

进行蛋白免疫印迹实验以及分析胚胎发育不同时期

前脑(E12.5、E14.5、E16.5和P0)的RNA-seq数据，

发现在胚胎时期的大脑皮层发育过程中，N-WASP

在mRNA和蛋白质水平上均有表达，并且其表达随

着大脑发育逐渐下降。然后通过在体子宫内胚胎电

转技术过表达和敲低N-WASP，发现过表达和敲低

N-WASP均造成神经元迁移障碍，说明其在调控神

经元迁移中可能起到了重要作用。本研究观察到敲

低N-WASP的表型没有过表达明显，这可能是因为

N-WASP没有被完全敲除。

398 Hereditas (Beijing)

2018

第40卷

先前研究表明，Lis1 (lissencephaly-1)过表达对

神经元迁移没有明显影响，而Lis1敲低会导致神经

元迁移障碍

[8,51]

；双皮质素(doublecortin, DCX)过表

达会促进神经元迁移，而双皮质素敲低会阻止神经

元迁移

[8,52]

。有趣的是，本研究发现过表达和敲低

N-WASP均会造成神经元迁移障碍。神经元迁移是

一个高度动态的过程，需要肌动蛋白骨架动态调控，

所以N-WASP的表达量的平衡对这一过程显得非常

重要。此外，有报道称在患有癫痫的人脑组织中

N-WASP的表达量高于正常水平

[53]

，预示N-WASP

的表达量过多产生的病理学效应可能参与了疾病的

进程。

N-WASP在未激活时通过分子内的GBD与

VCA相互作用保持自抑制状态。在激活时，其通过

接收上游信号刺激释放出VCA结构域，暴露出来的

VCA结构域通过激活Arp2/3复合体来引起肌动蛋

白的动态化组装。本研究表明在正常的大脑皮层发

育状态下，N-WASP蛋白可能参与调控神经元迁移，

而且其表达量的平衡对神经元的迁移也是至关重要

的。进一步的研究结果表明分别过表达VCA结构域

和polyPro (含有VCA结构域)突变体均会造成神经

元迁移障碍，说明VCA结构域可能竞争性抑制内源

的N-WASP蛋白发挥作用。同理，分别过表达polyPro

结构域和VCA (含有polyPro结构域)突变体均会造

成神经元迁移障碍，说明polyPro结构域也可能竞争

性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用。推测这些突

变体可能竞争性地结合了一些与内源N-WASP相互

作用的蛋白(如含有SH3功能域的接头蛋白)，从而

抑制内源的N-WASP发挥作用。与此同时，过表达

WH1-GBD结构域(不含有polyPro和VCA结构域)

却对神经元迁移没有明显影响。总之，这些结果说

明N-WASP的polyPro和VCA结构域参与调控神经

元迁移，可能是通过polyPro结构域接收上游信号释

放出VCA结构域，再激活Arp2/3复合体影响肌动

蛋白的组装进而调控神经元迁移。

N-WASP的WH1结构域主要与WIP家族蛋白

相互作用，其GBD结构域主要通过与Cdc42 GTPase

结合接收上游信号。本研究发现过表达WH1结构域

对神经元迁移没有明显影响，而过表达WH1则会

造成严重的神经元迁移障碍，说明过表达WH1结构

域不能竞争性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用，

而WH1(含有polyPro和VCA结构域)依然能够竞争

性抑制内源的N-WASP蛋白发挥作用，可能是因为

N-WASP调控神经元迁移不需要WH1结构域的参与。

之前有报道称N-WASP通过WH1结构域参与调控

上皮细胞之间连接的肌动蛋白骨架，而经典的VCA

结构域并不参与其中，这种调控作用主要是通过

WH1结构域维持肌动蛋白组装后的稳定性

[54]

。此结

论与本文的研究结果相一致，因为神经元迁移是一

个时刻在变化的过程，其需要肌动蛋白组装的动态

平衡来形成合适的细胞骨架网络，而细胞骨架网络

对于神经细胞的形态至关重要。N-WASP的WH1结

构域可能更侧重于影响肌动蛋白组装后的静态稳定

性，而不是调控肌动蛋白的动态组装

[54]

。此外，本

研究还发现过表达H208D突变的N-WASP对神经元

迁移有影响，但并非像其他突变体产生明显的影响。

由于H208D突变的N-WASP不能结合Cdc42，因此

推测Cdc42激活N-WASP引起肌动蛋白的动态调控

可能参与了神经元迁移，但并不是主要的信号通路。

N-WASP在参与信号通路发挥作用时，需要从

未激活状态转变成激活状态。N-WASP的高度激活

需要两个步骤，首先通过接收上游信号分子(如Cdc42

或含有SH3结构域的接头蛋白)的激活进行变构调

节，释放出VCA结构域结合Arp2/3复合体，然后

通过连接蛋白使得N-WASP进行二聚化或者寡聚化

增加与Arp2/3复合体的亲和性来调控肌动蛋白的组

装

[39]

。结合最近的研究发现一个VCA结构域结合

Arp2/3复合体的背面而另一个VCA结构域结合该

复合体的底面

[55]

，本文提出一个可能的N-WASP调

控神经元迁移的模型：Cdc42和含有SH3结构域的

蛋白可能协同结合N-WASP蛋白使其进行变构释放

出VCA结构域，再通过多价的含有SH3结构域的

蛋白结合polyPro结构域使得N-WASP进行二聚化

或者寡聚化，最终激活肌动蛋白的组装调控神经元

的迁移(图4)。

综上所述，本研究发现N-WASP在大脑皮层神

经元前体放射状迁移中起到重要作用，并且其主要

是通过polyPro和VCA结构域动态调控细胞骨架中

肌动蛋白丝状分支的构建影响神经元迁移。

第

5

期

沈秀莲等: N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移 399

图4 N-WASP蛋白调控大脑皮层神经元迁移机制的模式图

Fig. 4 A model for N-WASP regulating cortical neuron migration

N-WASP由上游信号分子(含有SH3结构域的接头蛋白和Cdc42)激活，释放出VCA结构域，结合Arp2/3复合体，再通过含有SH3

结构域的接头蛋白进行二聚化或者寡聚化

[39]

，释放出来的两个VCA结构域分别结合Arp2/3复合体的背面和底面

[55]

，从而高度激活

Arp2/3复合体引起肌动蛋白的组装来调控神经元的迁移。 MZ：marginal zone，边缘区；CP：cortical plate，皮质区；IZ：intermediate

zone，中间区；SVZ：subventricular zone，室下区；VZ：ventricular zone，脑室区；n：neuron，神经元；R：radial glial cell，放射状

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(责任编委: 许执恒)