2024年4月1日发(作者：)

摘 要

曲霉型豆豉是我国一种历史悠久的调味副食品，具有抗氧化、降血压、溶血

栓等多种功效。当前曲霉型豆豉一些生产环节仍采用粗放式工艺，这将导致豆豉

品质的不稳定并加大污染风险。而开展科学的人工复配发酵之前，首先应对原工

艺豆豉品质特征及微生物变化规律具有全面的认识，而过去相关研究对其规律认

识仍不太深入。因此，本文先对曲霉型豆豉不同发酵阶段的品质特征及关键酶活

性的变化进行比较；而后借助分子鉴定技术从绝对丰度和相对丰度深入探索了豆

豉微生物在发酵过程中的变化；最后对优势微生物进行了环境耐受及发酵潜力的

初步评价。具体过程与结果如下：

1. 豆豉6个发酵阶段的发酵池温度为先升后降，大多数阶段在45˚C上下，

pH持续下降至结束时4.86。豆豉发酵中含盐量维持在6%左右，氨基氮及总酸呈

稳步上升的趋势，而还原糖及总糖的含量呈持续下降的趋势。发酵中豆豉颜色逐

步变黑，硬度变小，以酱香为主体的风味在第15天基本形成并于第21天进一步

加强。发酵中的中性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力较高，而纤维素酶、脂肪酶、β-

葡萄糖苷酶的酶活力均比上述两种主要的酶低2~3个数量级，各关键酶的酶活力

总体上均为持续下降的趋势。

2. 通过可培养法发现,豆豉发酵阶段细菌占绝大多数，细菌、乳酸菌及真菌

的丰度均呈下降趋势。分离得到18种菌株中12种为细菌，优势种为贝莱斯芽孢

杆菌、鸡葡萄球菌、咸海鲜魏斯氏菌。基于实时定量PCR试验，发现细菌及真

菌的绝对丰度随着发酵的进行明显下降，细菌绝对丰度始终领先真菌2~3个数量

级，葡萄球菌属绝对丰度自第10天起急剧下降，芽孢杆菌属整体的波动不明显。

对细菌进行高通量测序发现，厚壁菌门为主要优势门，而葡萄球菌属是唯一全程

优势属，其丰度呈先增后降的趋势，最高达93.6%；芽孢杆菌在发酵中后期占比

逐渐上升；以魏斯氏及乳酸杆菌属为代表的乳酸细菌主要分布于发酵初期及末

期。进一步分析发现，细菌结构整体发生了较大变化，注释到核酸代谢、膜运输、

复制与修复的通路呈连续下降趋势，冗余分析则表明pH与温度是造成豆豉细菌

群落演替的重要环境因子。

3. 对优势菌进行胁迫环境试验，发现魏斯氏菌、乳酸杆菌胁迫环境耐受性

较弱，4种菌属高温耐受能力均不强，而对盐分、低pH等因子均具有一定耐受

性，其中葡萄球菌属在6%盐分生长基本不受影响，而平板培养的菌落数目更少

且形态更小。豆豉的纯菌发酵试验表明，魏斯氏菌与乳酸杆菌发酵后主体风味为

乳香，而芽孢杆菌及葡萄球菌发酵豆豉的特征性气味分别为豉香与酱香味。各菌

I

属发酵中的以中性蛋白酶为代表的多种酶活力较自然发酵豆豉明显更高，而脂肪

酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶的酶活力全程均很低。

总的来看，本文通过从豆豉发酵阶段的品质及酶系等指标切入，结合多种工

具从绝对及相对丰度两个角度，阐明了造成豆豉品质指标改变的重要源头即微生

物的变化规律，并结合培养试验对优势微生物的环境耐受及发酵潜力完成初步评

价。这将为更深入地探索曲霉型豆豉的发酵规律提供了研究思路，并为下一步复

配发酵建立了试验基础。

关键词：曲霉型豆豉；品质特性；可培养微生物；高通量测序；实时定量PCR

II

Abstract

Aspergillus-type douchi is a kind of seasoned non-staple food with a long history

in China, with functions such as anti-oxidation, lowering blood pressure, and

thrombolysis. Nowadays, extensive production processes were still used in stages of

Aspergillus-type douchi, which may caused instability and increased risks of

venenation. Prior to develop scientific artificial fermentation, it need to own

comprehensive insights on quality properties and microbial succession rules to douchi

wth original process, while previous researches still not investigate its rules in-depth.

Therefore, the paper compared the quality properties and vital enzyme activities of

Aspergillus-type douchi at different microbes succession were explored

from absolute and relative abundance using molecular identification technology.

Finally, preliminary evaluation of environmental tolerance and potential of dominant

microbes was performed. The specific process and results were as follows:

1. During six fermentation stages of douchi, the fermentation tank temperature

rose and then fell, and around 45˚C mostly, with pH values steadily dropping to 4.86

at the end. The salt content remained at around 6%, and the amino nitrogen and total

acid showed a steady upward trend, while a steady downward trend for reducing and

total sugar. The color and hardness of douchi turned black and smaller respectively,

the main flavor with maotai began to form on day15 and strengthened on day21. The

activities of neutral protease, alpha-amylase were higher, while those of cellulase,

lipase and beta-glucosidase were lower by two to three orders of magnitude, the

activities of all vital enzymes were continuous decline.

2. By culturable method, it found that bacteria accounted for the vast majority

during fermentation, and the abundance of bacteria, lactic acid bacteria and fungi all

showed a downward trend. Twelve of the eighteen isolated strains were bacteria, the

dominant species were Bacillus velezensis, Staphylococcus gallinarum, and Weissella

jogaejeotgali. Absolute abundance of bacteria and fungi was significantly decreased

using real-time quantitative PCR, the bacteria was two to three orders of magnitude

ahead of fungi. Absolute abundance of Staphylococcus has fallen sharply since day10,

while roughly stable for Bacillus. High-throughput sequencing of bacteria showed that

Firmicutes were dominant phylum, and Staphylococcus was the only dominant genus

wholly, its abundance increased first and then decreased, with a maximum of 93.6%.

III

The proportion of Bacillus increased gradually in the latter stages, and Lactic acid

bacteria, represented by Weissella and Lactobacillus, were mainly distributed in the

initial and last stages. Further analysis found that the overall bacterial structure had

undergone major changes, and the pathways to nucleotide metabolism, membrane

transport, replication, and repair showed a continuous downward trend. The

redundancy analysis indicated that pH and temperature were the main environmental

factors for succession of the bacterial community in douchi.

3. The stress environment test on the dominant bacteria found that Weissella and

Lactobacillus were less tolerant to stress factors, four species were weak in high

temperature tolerance, which were resistant to salinity, low pH and other factors.

Among them, Staphylococcus was hardly affected by 6% salt growth, and colonies

cultured on the plate was much less with smaller morphology. For fermentation test of

each bacterium, the flavor produced by Weissella and Lactobacillus was frankincense

mainly, while the characteristics of Bacillus and Staphylococcus were strong soy and

maotai flavor respectively. The activity of neutral protease in the fermentation of

various bacteria was significantly higher than that in the natural fermentation of

Douchi, while the activity of lipase, beta-glucosidase and cellulase were all low.

Overall, the paper taking the changes of quality properties and enzyme

compositions in douchi as pointcuts, from the perspective of absolute and relative

abundance with various tools, the change rules of microbes was clarified, which was

the fundamental factor to quality properties alterations of douchi. By culture

experiments, the environmental tolerance and fermentation potential of dominant

microbes were evaluated preliminarily, so as to provide opinions to explore further

rules for Aspergillus-type douchi, and establish the experimental basis for further

steps of strain combination fermentation.

Keywords: Aspergillus-type douchi; Quality characteristics; Culturable microbes;

High throughput sequencing; Real-time quantitative PCR

IV

目 录

摘 要 .........................................................................................................................I

Abstract ........................................................................................................................ III

目 录 ....................................................................................................................... V

1 绪论 ............................................................................................................................ 1

1.1 发酵豆制品的种类及其发展概况 ................................................................. 1

1.2 豆豉概述 ......................................................................................................... 2

1.2.1 豆豉的分类及其生产工艺 .................................................................. 2

1.2.2 豆豉的功能活性物质 .......................................................................... 4

1.2.3 豆豉生产中重要的生化反应 .............................................................. 5

1.3 豆豉微生态的研究进展 ................................................................................. 6

1.3.1 发酵食品微生态研究的常用方法 ...................................................... 6

1.3.2 豆豉微生物分布特征的研究现状 ...................................................... 8

1.4 研究目的及意义 ........................................................................................... 10

1.5 研究内容及路线 ........................................................................................... 11

2 曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及关键酶的酶活力变化 .................................. 12

2.1 材料与仪器 ................................................................................................... 12

2.1.1 主要药品试剂 .................................................................................... 12

2.1.2 主要溶液及其配制 ............................................................................ 13

2.1.3 主要仪器 ............................................................................................ 14

2.2 实验方法 ....................................................................................................... 15

2.2.1 豆豉采集及主要环境因子的测定 .................................................... 15

2.2.2 豆豉基本品质指标的测定 ................................................................ 15

2.2.3 豆豉感官指标的评价 ........................................................................ 16

2.2.4 豆豉发酵关键酶的酶活力测定 ........................................................ 16

2.3 结果与讨论 ................................................................................................... 18

2.3.1 豆豉发酵过程中重要环境因子的变化 ............................................ 18

V

2.3.2 豆豉发酵过程中基本品质指标的变化 ............................................ 19

2.3.3 豆豉发酵过程中主要感官特征的变化 ............................................ 19

2.3.4 豆豉发酵过程中关键酶的酶活变化 ................................................ 21

2.4 本章小结 ....................................................................................................... 22

3 曲霉型豆豉发酵过程中微生物结构的变化 .......................................................... 23

3.1 材料与仪器 ................................................................................................... 23

3.1.1 主要药品试剂 .................................................................................... 23

3.1.2 主要溶液和培养基及其配制 ............................................................ 24

3.1.3 主要仪器 ............................................................................................ 24

3.1.4 引物序列 ............................................................................................ 25

3.2 实验方法 ....................................................................................................... 26

3.2.1 豆豉发酵过程中微生物的分离培养与鉴定 .................................... 26

3.2.2 豆豉发酵过程中微生物宏基因的提取 ............................................ 26

3.2.3 荧光定量PCR监测主要微生物类群的绝对丰度 ........................... 27

3.2.4 高通量测序监测细菌群落的相对丰度 ............................................ 27

3.2.5 PICRSt功能注释及关联分析 ............................................................ 28

3.3 结果与讨论 ................................................................................................... 29

3.3.1 可培养微生物的丰度及种类变化 .................................................... 29

3.3.2 宏基因提取及主要微生物类群的绝对丰度变化 ............................ 31

3.3.3 细菌群落的相对丰度变化 ................................................................ 33

3.3.4 PICRUSt功能注释及关联分析 ......................................................... 37

3.4 本章小结 ....................................................................................................... 39

4 曲霉型豆豉发酵过程优势菌应用潜力的初步评价 .............................................. 41

4.1 材料与仪器 ................................................................................................... 41

4.1.1 主要药品试剂及菌株 ........................................................................ 41

4.1.2 主要溶液和培养基及其配制 ............................................................ 41

4.1.3 主要仪器 ............................................................................................ 42

4.2 实验方法 ....................................................................................................... 42

4.2.1 优势菌不同胁迫环境下的培养试验 ................................................ 42

4.2.2 优势菌发酵豆豉的感官指标评价 .................................................... 42

VI

4.2.3 优势菌发酵豆豉的关键酶系测定 .................................................... 42

4.3 结果与讨论 ................................................................................................... 43

4.3.1 优势菌不同胁迫环境下的培养状况差异 ........................................ 43

4.3.2 优势菌发酵豆豉的感官指标差异 .................................................... 45

4.3.3 优势菌发酵豆豉的关键酶系差异 .................................................... 46

4.4 本章小结 ....................................................................................................... 47

5 结论与展望 .............................................................................................................. 49

5.1 结论 ............................................................................................................... 49

5.2 展望 ............................................................................................................... 50

参考文献 ...................................................................................................................... 51

致 谢 ...................................................................................................................... 63

在读期间公开发表论文（著）及科研情况 .............................................................. 65

VII

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

1 绪论

1.1 发酵豆制品的种类及其发展概况

豆类作为一类高蛋白的作物，在满足人们旺盛的植物蛋白需求的同时，也因

其不含胆固醇且拥有异黄酮、皂苷等多种功能成分而成为食品开发的热点，而发

酵豆制品则是重要分支之一

[1]

。首先就分布区域就看，发酵豆制品与亚洲国家的

饮食文化联系紧密、主要分布于中国、韩国、日本、印度，印度尼西亚等国，其

中我国的发酵豆制品尤为丰富（图1-1）

[2]

。就最终的产品形态来看，可分为液

态、半固态、固态三大类，液体主要包括酱油、发酵豆乳、Meju等，半固态包

括豆酱、Miso等，而固态的典型代表则为豆豉、腐乳、Tempeh等豆制品。

就基本定义来看，发酵豆制品是指以大豆为代表的豆类为重要原料，借助微

生物发酵并辅以各类加工工艺而制成的一类食品。虽然各类发酵豆制品因生产工

艺及微生物种类各异，它们的形态特征、营养风味、保健功效等方面也存在一定

差异，但与粗加工相比，在微生物的酶系作用下，发酵原料被进一步分解，原料

基质被进一步分解小分子物质，发酵豆制品的营养由此也更易被人体吸收，如游

离的氨基酸及不饱和脂肪酸等

[3, 4]

，以血管紧张素转化酶抑制肽，纤维蛋白溶解

酶等为代表的活性物质也更为丰富

[5, 6]

，已有研究结果表明，发酵豆制品具有较

好的抗氧化作用

[7]

、改善肠道菌群结构

[8]

、促进机体免疫调节等多种功效

[9]

。

就国内外发酵豆制品发展对比来看，国外一些发酵豆制品如纳豆、Tempeh

等的生产工艺已较为成熟，上世纪90年代就开展了很多功能成分与结构、代谢

机理、加工稳定性的研究，并得以在实际生产应用

[10, 11]

，而国内各类发酵豆制

品的发展整体处于不均衡的状态。具体来看，酱油的生产工艺已较为成熟，菌株、

工艺及延伸产品的工业化生产已较为系统化，而以豆豉为代表的其他发酵豆制品

部分仍采用半开放的自然发酵，这将给不同批次发酵风味品质稳定性的控制带来

一定难度，也增加了杂菌污染的可能性。另一方面，与纳豆、Tempeh等无盐发

酵不同，国内腐乳、豆豉等发酵豆制品均采用拌盐发酵，在健康食品理念的主流

背景下，可能因高盐标签限制了其受众面。此前已有研究者通过测定多种腐乳盐

醅含盐量，发现其最高含盐量达18.61%

[12]

，这无疑将增加食用后患高血压等慢

性病的患病风险，然而国内当前对低盐发酵豆制品产品的开发还不多见

[13, 14]

。

最后，就发酵豆制品的食品风险控制来看，更多学者则将研究焦点置于发酵

过程有害物质及有害微生物的控制。发酵中往往会因含氮化合物的不完全代谢而

产生某些有害物质，发酵豆制品的有害物主要为生物胺、氨基甲酸乙酯两类

[15]

。

其中，微量水平的生物胺对机体有益，但摄入过量时则会引发一系列不良反应，

1

硕士学位论文

而足量的氨基酸及微生物产生的氨基酸脱羧酶是生成生物胺的基本条件

[16]

。当

前，针对各类发酵豆制品的各类生物胺测定方法及发酵中的演变趋势已有较多报

道

[17-19]

，有研究者还对乳酸菌、酵母菌等发酵常用菌进行了产生物胺的评估

[20,

21]

，而针对消除生物胺的工艺研究相对不多

[22, 23]

。另一类即氨基甲酸乙酯主要由

食品微生物代谢产生的尿素和乙醇的自发反应生成，其内在的生成机制相对更为

复杂

[24]

。当前降低氨基甲酸乙酯的基本思路为设法降低发酵中尿素的生成，其

为氨基甲酸乙酯的主要前体物质，虽然利用代谢过程策略从源头控制该物质具有

较好应用前景，但目前消除氨基甲酸乙酯积累的应对手段仍然较为缺乏

[25]

。此

外，由于国内很多发酵豆制品采用粗放式发酵，许多生产环节均易引入杂菌。例

如有研究者采用静止法和翻转法进行腐乳发酵试验，发现豆腐坯中存在金黄色葡

萄球菌、大肠杆菌以及蜡样芽孢杆菌等多种致病菌

[26]

；而Zhou等人针对引发中

毒的污染豆豉调研后发现，豆豉上分离的蜡样芽孢杆菌在42˚C仍能够产毒素进

而导致溶血风险

[27]

，这侧面凸显了豆豉等发酵豆制品关于食品风险防控的重要

性及人工发酵技术发展的必要性。

图1-1 国内主要发酵豆制品及其研究方向

Figure 1-1 Primary fermented bean products and their research directions in China

1.2 豆豉概述

1.2.1 豆豉的分类及其生产工艺

豆豉，曾名“幽菽”，起源于我国的先秦时代，距今已有两千余年的历史。

伴随着佛教文化传播或移民等因素，在唐代之后陆续流入日本、印度尼西亚等地，

从而衍生出纳豆、Tempeh等发酵豆制品，它们与豆豉某种程度上属同源关系

[28]

。

2

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

因当前豆豉的生产与消费绝大部分均在我国，故仅就国内豆豉分类来看，可根据

含水量、食盐添加量、产品形状、制曲微生物等进行划分（表1-1）

[28, 29]

。除无

盐豆豉经发酵另炮制入药，豆豉主要充当仍是调味副食品的角色。常见为三大类

型（曲霉型、毛霉型、细菌型）豆豉，就具体发酵工艺来看，各地域豆豉则普遍

存在一定程度差异（表1-1）。

(1) 曲霉型豆豉。主要在分布在南方许多省份，以湖南浏阳豆豉及广东阳江

豆豉为代表。在生产过程中，微生物参与的为制曲及（后）发酵阶段，其中制曲

阶段优势菌为曲霉菌，以米曲霉或黑曲霉工业菌为主（如AS 3.042、AS 3.951），

制曲温度一般在25~32˚C，制曲时长一般不长于7天，大部分包含洗曲环节，通

过降低蛋白酶活力避免苦味肽的过多产生

[30]

。洗曲后一般拌盐（大都还包含白

酒、辣椒）继续进行发酵，不同产地豆豉工艺在发酵阶段的差异尤为明显。

(2) 毛霉型豆豉。主要分布于西南地区，以重庆永川及四川潼川豆豉为代表。

作为另一类霉菌型豆豉，毛霉型豆豉与曲霉型豆豉类似，亦包含制曲与发酵两个

阶段。制曲主要由毛霉属（如总状毛霉、放射毛霉，匍枝根霉）完成。就西南地

域来看，传统毛霉型豆豉制曲及发酵的温度均比曲霉型豆豉低，故产品发酵周期

相应更长，有研究者采用人工混菌发酵工艺，生产周期亦可缩短至约三周

[31]

。

(3) 细菌型豆豉。一般称为“水豆豉”，主要分布于贵州、云南、山东等地。

细菌型豆豉不含制曲过程，与日本纳豆的相关工艺稍相似，菌株主要为纳豆芽孢

杆菌(Bacillus subtilis natto)，在人工接种制曲（前发酵）48~72 h后，待布满黏液

可牵拉成丝并有一定氨味后，加入盐及其他拌料，继续发酵5~7d即完成

[32]

。

此外，作药用的豆豉被称为“淡豆豉”，通过将一些药材煎液滤过煮大豆，

晾干，另加入药材制曲，洗曲再发酵闷制，另需脱水干燥等步骤即为成品

[33]

。

表1-1 国内部分豆豉的发酵工艺

Table 1-1 The fermentation process of partial douchi in China

制曲优势

名称

微生物

阳江豆豉

浏阳豆豉

稻香园豆豉

仙源豆豉

永川豆豉

潼川豆豉

水豆豉

淡豆豉

曲霉

曲霉

曲霉，横梗霉

曲霉

毛霉

毛霉

芽孢杆菌

曲霉、毛霉

时长

4~5天

2~4天

5~7天

2~3天

10~12天

15~21天

2~3天

5~7天

温度

26~30˚C

28~32˚C

25~30˚C

28~30˚C

15~18˚C

15~18˚C

40~50˚C

28~32˚C

洗曲

是

是

是

否

否

否

否

是

时长

约40天

约7天

约3周

30~40天

10~12个月

10~12个月

5~7天

15~20天

及方式

30~45˚C，保温发酵

35~55˚C，保温发酵

35~50˚C，保温发酵

42~45˚C，保温发酵

20˚C，自然/保温发酵

20˚C，自然/保温发酵

37˚C，保温发酵

30˚C，保温发酵

含量

17%

8.5%

6~7%

13%

18%

18%

12%

无

含量

约35%

20~25%

30~35%

30~35%

约35%

约35%

大于50%

约5%

制曲 制曲 是否 发酵 发酵温度 食盐 水分

3

硕士学位论文

1.2.2 豆豉的功能活性物质

豆豉作为一种药食两用的发酵豆制品，其内在原理即微生物对大豆中的大分

子有机物分解和重组,并借助多类型的生化作用,形成许多功能代谢产物和活性

物质。它们通过独立或协调发挥作用，这使得豆豉不仅具有开胃消食等功效，还

可发挥抗癌、抗氧化、降血压、溶血栓等多种功能。

(1) 大豆异黄酮。作为一类黄酮类化合物，大豆异黄酮被誉为“植物中的雌

激素”，具有清除自由基、抗真菌及其毒素、抗血管收缩及溶血因子等多种生物

活性，可发挥抗肿瘤、抗氧化、预防并治疗毛细血管脆弱等作用

[34]

。由于大豆

中异黄酮含较大比例的结合型糖苷和较小比例的游离型苷元，但研究表明可在人

体发挥生理活性的仅为游离型苷元

[35]

，而豆豉发酵后游离苷元含量比发酵原料

高得多，其内在机制即大豆异黄酮通过β-葡萄糖苷酶的作用，进而大都转化为游

离型大豆异黄酮

[4]

。尽管许多真菌及部分细菌均具有产β-葡萄糖苷酶的能力，但

典型β-葡萄糖苷酶高活力菌株为豆豉制曲阶段的霉菌（如米曲霉）

[36]

。

(2) 大豆低聚糖。豆类中包括蔗糖、棉籽糖、水苏糖等低聚糖，但因为人类

缺乏α-半乳糖苷酶，导致完整的棉籽糖、水苏糖不能被消化吸收，转而进行厌氧

发酵引发胀气反应

[37]

。豆豉发酵可显著改变低聚糖的组成，一方面利用微生物

（如曲霉、乳杆菌、酵母等）分泌的α-半乳糖苷酶水解棉籽糖和水苏糖

[38]

，另

一方面还借助微生物的糖基转移酶与内切半纤维素酶（如半乳聚糖酶、甘露聚糖

酶）将大豆糖类通过转糖基或水解作用转化为低聚糖，其中目前豆豉中包含的低

聚糖主要包括低聚果糖、蔗果三糖(具3种异构体)、低聚半乳糖等

[39]

。

(3) 豆豉纤溶酶。日本学者于1987年在纳豆中首先发现具有纤维蛋白溶解

活性的酶即纳豆激酶

[40]

，其测得其溶解血栓速度为尿激酶的近20倍，这启发国

内学者就豆豉来源的纤溶酶开展研究。有研究者将豆豉粗提液对比发现，细菌型

豆豉的溶栓效果为最佳

[41]

。一些学者则经过筛选、鉴定或酶纯化等步骤

[42, 43]

，

发现豆豉中分泌纤溶酶的菌群主要为芽孢杆菌，分子量在30 kDa附近，最适pH

与温度约为6和40˚C。值得注意的是，有研究者借助体外溶栓试验，即通过对

小鼠注射枯草芽孢杆菌来源的豆豉纤溶酶，发现其能有效溶解血栓且对小鼠无明

显的毒害效应

[44]

，表明豆豉纤溶酶未来经改造后可能具有广阔的应用前景。

(4) 褐色色素。又名类黑精或蛋白色素，在豆豉中普遍存在，是由大豆蛋白

质及它的分解产物（多肽类、还原糖）发生美拉德反应生成。其本质为弱酸高分

子物质，水溶性较好，在酸或碱条件下均易被水解，而消化酶对其无效

[45]

。由

于褐色色素分子内保持有稳定的自由基结构并具有捕获溶液中自由基的能力，因

此表现出很强的抗氧化活性

[46]

，可充当类似膳食纤维的功效、亦对胰蛋白酶与

血管紧张素转换酶(ACE)表现抑制效果

[47]

，是豆豉中一类代表性的保健成分。

4

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

1.2.3 豆豉生产中重要的生化反应

豆豉在制曲与发酵过程中，会发生各类复杂的生化反应，诸类生化反应一些

环节由酶催化而成，同时各类反应底物及（中间）产物亦通过各类化学反应产生

新化合物。换言之，生物酶催化与化学反应的效率、方向是影响发酵进程的主要

因素，而发酵进程的外在表现即为豆豉的营养、感官与及功效。

(1) 蛋白质水解及氨基酸转化。大豆原料富含约40%蛋白质，经过蒸煮后，

大豆中蛋白发生变性，而制曲与发酵阶段微生物（如曲霉、芽孢杆菌）可分泌大

量蛋白酶

[48, 49]

，其中蛋白酶中的内肽酶将变性的蛋白大分子水解为小分子肽链，

而端肽酶进行末端氨基酸逐个水解。两类不同作用机制蛋白酶在发酵中独立、协

同发生作用，从而使得多种游离氨基酸的含量增加，提升了豆豉的营养与风味。

另外，游离氨基酸通过不同复杂反应参与形成各类物质，如芳香类氨基酸（苯丙

氨酸、酪氨酸）可作为酚类化合物的前体物质，某些氨基酸发生Strecker降解后

参与醇类、脂类及酮类的形成，同时氨基酸也会发生分解代谢生成胺类

[50]

。

(2) 淀粉的糖化。碳水化合物是大豆原料中的含量仅次于蛋白质，约为30%，

原料中碳水化合物以多糖中的淀粉为主，而淀粉经多级分解后最终生成葡萄糖或

果糖的过程即被称为淀粉的糖化。淀粉的糖化主要通过淀粉酶完成，通过α-淀粉

酶及糖化酶（葡萄糖淀粉酶）两类淀粉酶，分别从淀粉内部或非还原性末端切割

α-1-4-糖苷键并最终形成葡萄糖

[51]

，较大程度满足了发酵菌群的碳源需求。而淀

粉糖化的过程，一方面增加了豆豉的甜味；另一方面，糖化后的产物可经酵母、

乳酸菌等经碳代谢生成酒精、有机酸等，这为豆豉发酵中后期复杂风味的形成提

供了一定的物质基础。

(3) 美拉德反应。羰基化合物(如还原糖、脂质以及其反应后醛类、酮类等物

质)及氨基化合物（氨基酸、蛋白质、胺类等）之间发的非酶褐变即为美拉德反

应(Maillard reaction)，该反应在食品的生产加工环节广泛存在，其内在机制复杂

[29]

。美拉德反应对豆豉发酵的贡献表现为颜色变化、滋味的提升及功能物质（如

类黑精）的形成等方面，并直接影响豆豉吡嗪类，酚类、醛类等风味物质的产生。

需要指出的是，高温及长时间的美拉德反应亦可产生致癌物质丙烯酰胺，并降低

豆豉的营养品质

[52]

。为此，若能通过设置适宜的发酵参数（pH，温度，水分）

较好地人为控制美拉德反应的进程，对豆豉发酵将具有重要的生产意义。

(4) 脂类的氧化降解。大豆中脂肪含量约为20%，而在豆豉生产过程中，脂

肪水解为脂肪酸的过程，部分由微生物（如曲霉、葡萄球菌及芽孢杆菌）脂肪酶

完成

[53]

。而脂肪酸可主要通过β-氧化代表的多级反应生成醇类、醛类及烃类物

质；而产物甘油在转化为有机酸物质后，可与豆豉中醇类生成不同酯。值得注意

的是，虽已有研究表明豆豉在制曲或发酵阶段脂肪含量仅小幅度下降

[54]

，但不

饱和脂肪酸及酯类物质等的产生对豆豉营养风味的贡献亦不容忽视。

5

硕士学位论文

(5) 异黄酮糖苷的转化。大豆原料异黄酮为混合物，含量约为0.1%~0.5%，

由其化学结构可基本分为大豆苷、染料木苷及黄豆苷3类；按存在形式则分为结

合型糖苷及游离型的苷元两类，其中结合型糖苷经酸或酶水解脱去糖基生成游离

型异黄酮苷元

[2]

。即意味着豆豉发酵中，虽然部分异黄酮苷元由酸解产生，但部

分则依靠微生物酶系发挥作用。有研究表明豆豉成品中游离型苷元占总黄酮可达

80%以上

[4]

，不同豆豉其比例或与发酵工艺（如原料、菌株及周期）有关。

1.3 豆豉微生态的研究进展

1.3.1 发酵食品微生态研究的常用方法

微生物生态简称微生态，主要围绕微生物群落构建、组成演变、多样性及其

与环境的关系等问题进行研究。除了自然环境，许多发酵食品环境亦可看作是一

类人为构建起来的微生态，如在发酵阶段，豆豉微生态的组成主要涵盖发酵房空

气及微生物、拌料、发酵池（罐）及内部微生物等要素。显然，若能通过借助各

类方法（试验工具或分析策略等）较大程度揭示发酵食品微生物演替的内在规律，

将为后续发酵工艺（原料、微生物、工艺参数）的选择提供理论基础。

(1) 可培养法。传统的可培养法通过创造适宜培养条件，尽可能分离到纯种

菌株，是分析微生物的基本手段。分离得到单菌株往往还会对其进行形态学、代

谢功能以及分子生物学分析，进而全面了解菌株特性。另一方面，基于某些专用

培养基，借助平板计数还可掌握特定类群的活性微生物的丰度变化。因此，即使

可培养法具有低精确性、长耗时及可培养微生物较少等短板

[55]

，但在发酵食品

微生物领域，培养分离仍是当前直接获得发酵菌株的手段，具有不可替代性。

(2) 实时荧光定量PCR。基于荧光共振能量转移的原理，实时荧光定量PCR

技术同时继承了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性及光谱技术的高精确性,

在基础生物、食品检测、环境监测等多领域发挥重要作用

[56]

。目前，实时荧光

定量常使用

4类荧光化学方法，其中最常用的为DNA结合染料法、水解探针法

两类，其中结合染料法检测简便且成本低，但特异性相对一般；而以Taqman为

代表的水解探针法，若探针设计得当，其特异性往往很强，但价格相对昂贵。就

发酵食品领域来看，实时荧光定量技术一方面应用于揭示食品安全风险如致病菌

（金黄色葡萄球菌等）、转基因成分及毒素的检测；另一方面也通过借助特异性

引物用于监测特定发酵功能菌的丰度变化。

(3) 梯度凝胶电泳。基于“GC夹板”及异源双链技术基础，梯度凝胶电泳

技术经初步发展完善，于上世纪90年代便在分子微生物学领域首次得到应用

[57]

。

目前主要分为变形梯度凝胶电泳（DGGE）及温度梯度凝胶电泳(TGGE)两类，

其中DGGE的应用较TGGE更早且更普遍。不可否认，DGGE等技术通过借助

6

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

指纹图谱直接再现了样品微生物群落结构，免去了培养法带来的分析误差，是包

括发酵食品等多领域进行微生物群落多样性及动态分析的强有力工具

[55]

。与此

同时，DGGE等技术也存在一些局限性，如DGGE在多数情况下只能针对相对

丰度阈值（如1%）以上的微生物进行分析

[57]

，不同实验条件（核酸提取、PCR

扩增程序及引物的选择）也可能导致带型谱图的复现力一般，从而给序列信息的

探针设计和系统发育分析带来负面影响。

(4) 宏基因组测序。宏基因组概念于1998年首次提出

[58]

，其定义为环境中

全部微小遗传物质的总和。宏基因组测序策略包括保守区域(如16S/18S/ITS基因)

的扩增测序法（Amplicon sequencing）及全基因组鸟枪测序法（Whole genome

shotgun sequencing）两种，而狭义的宏基因组测序仅指后者，其通过对原始序列

片段进行高质量组装，可提供种水平注释及单菌株基因组草图等深入信息。宏基

因组测序当前主流采用二代测序技术，主要在Illumina公司Miseq/Hiseq平台（通

量高，平均读长150~300 bp）与Roche公司454平台（通量较高，平均读长400~500

bp）完成，其中Illumina平台因成本较低、碱基错误率低等优势，近年来其在包

括发酵食品等多领域的应用呈现普及化

[59]

。此外，当前虽已出现以超读长著称

（平均读长>10 Kb）且无需扩增的三代测序技术，但当前其测序通量仍无优势且

需借助超高覆盖度矫正碱基识别错误(单次测序错误率可达15%)，成本高昂导致

相关研究较少，目前以基于单分子荧光测序策略的Pacbio平台为主

[60]

。

(5) 相关性分析。在统计学领域，相关性分析是指现象是否存在某种依存关

系，并就存在依存关系的现象探讨其相关方向及相关性强弱。相关性系数主要分

为皮尔森(Pearson)、肯德尔(Kendell)、斯皮尔曼(Spearman)三类方法，均可反映

两个变量间的变化程度及趋势，取值范围为-1至1，趋近1(-1)表示极强正（负）

相关，0为不相关

[61]

。具体来看，皮尔森相关性系数可对定距变量间的线性程度

进行衡量，常用于衡量两个正态连续变量间的相关程度；肯德尔相关性系数是对

有序变量进行非参数检验，在两个变量均有序的情况下适用；而斯皮尔曼法是基

于两个变量秩的大小进行线性相关分析，是衡量两个变量间依赖性的非参数指

标，对变量的总体分布形态、样本容量大小一般不作要求，适用领域较广。在发

酵食品微生物领域，相关性分析较常采用的为皮尔森及斯皮尔曼法，研究者大都

针对优势菌属与典型发酵产物（如乳酸、游离氨基酸、有机酸等）相关性进行探

讨

[62]

，或就不同菌属之间的正负相关关系展开分析

[63, 64]

。

(6) 环境因子关联分析。因微生物在发酵食品的生产环境中广泛存在，且微

生物又是食品发酵过程的重要参与者，而当前食品微生物与发酵环镜的关联分析

并不多见，但已有少量研究发现食品微生物可能与发酵场所的水分、pH、温度

等环境因素存在关联

[65, 66]

，说明发酵微生物的演替可能与发酵环境确实存在一

定联系。与此同时，传统生态学领域关于环境与微生物关联分析的工具与理论应

7

硕士学位论文

用已较为成熟，并已在发酵食品微生态领域得到应用，常见分析包括主成分分析

(Principal Components Analysis)、主坐标分析(Principal Co-ordinates nalysis)、冗余

分析(Redundancy Analysis)、蒙特卡洛检验(Monte-Carlo Test)等。

1.3.2 豆豉微生物分布特征的研究现状

伴随着微生物分子鉴定技术的发展，目前各类分类工具在豆豉微生物多样性

研究已得到较为普遍的应用。就2010年以来豆豉微生物群落结构的研究来看，

各类已发表的研究报告为40余篇，研究工具呈现多样化、先进化的趋向，且相

关研究联合双（多）组学的态势当前已初步显现。

1.3.2.1 豆豉微生物绝对丰度特征

微生物绝对丰度即微生物总量，其往往能够体现微生物对发酵进程的绝对贡

献度。针对微生物总量，研究者一般在较低分类学水平（如细菌、乳酸菌）划分，。

值得注意的是，虽然数十年前已发展出荧光染色法、磷脂脂肪酸 (Phosphor lipid

fatty acid, PLFA)图谱法等定量分析工具，但限于其便利性、准确性等短板，近年

来，各学者仍采用可培养法对豆豉制曲及发酵阶段的微生物总量进行探究。

就制曲阶段来看，霉菌型豆豉大都通过人工接种曲霉或毛霉等菌株，并提供

霉菌适宜生长的温度，此阶段霉菌生物量相对较多。有研究者借助可培养法对曲

霉型豆豉制曲菌群总量展开探究

[67]

，发现霉菌的生物量先增后降，并于制曲第5

天达到10

10

CFU/g的峰值，然而细菌生物量在制曲各阶段却均高于霉菌，且以

芽孢杆菌为主。另有学者针对毛霉型豆豉制曲阶段的微生物进行了分离统计

[68]

，

不同的是，其发现霉菌及细菌数目在整个制曲过程均呈逐步增加的态势，两者均

在制曲第9天达到10

9

CFU/g层级的峰值，且丰度均在制曲第7天后陡升。

而就发酵阶段来看，与细菌相比，真菌在高盐，低氧及相对较高温度下耐受

性较弱，故在发酵阶段细菌占据优势地位。胡会萍就曲霉型豆豉后发酵阶段的菌

群进行了分离

[69]

，发现其细菌总数约为10

9

CFU/g，但后期稍有下降，其中乳酸

菌群体占比逐步下降；霉菌与酵母自发酵起始便迅速下降，发酵末期其丰度约仅

为10

3

CFU/g；而毛泳宇等人的研究结果与胡会萍存在一定差异

[70]

，虽然其结果

也表明豆豉发酵中细菌逐步下降，但芽孢杆菌仅在发酵前期出现，而酵母发酵中

后期稳定维持在10

5

CFU/g的水平。而毛霉型豆豉经拌料后需历经漫长的发酵周

期（约10~12月），有研究表明细菌及霉菌总量虽有一定波动

[68]

，但大多数发

酵阶段仅维持在10

7

CFU/g丰度以下的水平。与上述研究不同的是，Liu等人收

集了云南省五地区共30个豆豉样品

[71]

，特地就乳酸菌群体的丰度及种类展开大

规模研究调查，结果表明各类豆豉的乳酸菌群普遍较为丰富，但不同地区及同一

地区各豆豉样品的乳酸菌绝对丰度及种类均差异较大。

1.3.2.2 豆豉微生物相对丰度特征

与绝对丰度不同，探究豆豉微生物相对丰度特征的分子技术工具较为多样

8

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

化。研究者通过可培养除了获得物种的绝对丰度信息，往往还会结合一代Sanger

测序对优势微生物进行种鉴定

[72]

，以获得优势物种大致相对丰度，而结果准确

度与不可培养菌株比例有关。少数研究借助Biolog鉴定系统对淡豆豉展开探究

[73]

，然而该技术只适用好氧且生长较快的菌群，具有较大的局限性。近年来豆

就DGGE技术的应用来看，汪孟娟等人在2010年即基于该技术对曲霉型豆

豉微生物相对丰度的研究以DGGE及宏基因组测序两大技术为主（表1-2）。

豉制曲等阶段的菌群展开研究

[67]

，结果表明，制曲阶段的细菌主要以枯草芽孢

杆菌及米曲霉为主，并发现了较多葡萄球菌，基于UPGMA聚类发现细菌丰富

度为先增后降，真菌条带在制曲前中期变化较小，但在制曲后期发生较大变化。

有研究者利用该技术对毛霉型豆豉菌群展开研究

[68]

，发现细菌及真菌分别扩增

出8条或9条主条带，经鉴定优势细菌主要包括魏斯氏菌、乳酸菌、芽孢杆菌等，

而优势真菌主要为总状毛霉及匍枝根霉；UPGMA聚类分析发现相邻阶段微生物

区系相似性较高，制曲及发酵呈现明显分支的状态。另外，还有研究者利用DGGE

技术对我国12种豆豉的菌群分布展开调查

[74]

，其结果表明，虽然各品牌豆豉的

细菌、杆菌及真菌最大相似度分别仅为79%、70%和64%，但具有许多共有核心

菌，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、假单胞菌等。总体来看，研究者重点研

究视野一般为优势菌属及各阶段图谱差异的比较研究，虽然有研究表明可依据

DGGE条带亮度描述相对丰度特征

[75]

，但在豆豉微生态中仅有零星报道

[76]

。

而就宏基因组测序来看，李晓然等基于454焦磷酸测序平台

[77]

，于2014年

首次报道了云南单个豆豉样品中的细菌多样性。其发现该豆豉细菌可主要归属于

乳杆菌科与芽孢杆菌科两类，其中乳酸杆菌属丰度更是高达72%。而Yang等人

则依托Illumina高通量测序就曲霉型豆豉全程9阶段展开研究

[78]

，其结果表明所

有样品的真菌均以曲霉与横梗霉为主，细菌群落结构在发酵阶段波动较大，其中

主要优势属包括魏斯氏菌属、葡萄球菌属等。另有研究者应用454测序也对浏阳

产地的曲霉型豆豉细菌多样性进行了调查

[79]

，发现核心属主要包括魏斯氏菌属、

芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属等，其发酵过程中微生物群落虽结构复杂，

但核心菌群相对稳定。就对比类研究来看，刘晓峰等即采用鸟枪宏基因组学策略

兼以宏转录组学研究了云南德宏两地传统豆豉中的微生物

[80]

，各样品均获得了

10 Gb以上的测序信息，首次获得豆豉微生物的种水平注释，且另就功能基因和

代谢通路进行了注释分析。而Zhang等人则针对甘肃两地的细菌型豆豉中真菌及

细菌进行了比较

[64]

，发现两地豆豉含芽孢杆菌、依格纳季氏菌，毕赤酵母、假

丝酵母等共有优势属，但两地豆豉的菌群结构整体存在较大差异。

此外，新近研究已倾向于结合其他组学共同揭示豆豉发酵过程的内在规律。

如Yang等人针对快速发酵豆豉的风味变化与微生物演替规律进行了分析

[81]

，发

现棒状杆菌、乳球菌等优势属为主要的风味贡献属；而He等人对毛霉与曲霉豆

9

硕士学位论文

豉制曲阶段风味与真菌演替差异展开对比研究

[82]

，结合培养验证实验，发现季

也蒙毕赤酵母与毕赤酵母可能是两类豆豉制曲阶段风味差异的重要贡献群体。

表1-2 豆豉微生物多样性的代表性研究

Table 1-2 Rrepresentative researches on microbial diversity of douchi in China

样品

豆豉种类 采样阶段

数目

曲霉型豆豉 发酵

7

可培养法 乳酸菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、酵母

米曲霉、产酸克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、

淡豆豉 炮制

6 DGGE

弧形乳杆菌、隐球菌、丝孢酵母

可培养法

毛霉型豆豉 制曲，发酵

14

DGGE

可培养法

多类型豆豉 新鲜成品

12

DGGE

细菌型豆豉 新鲜成品

1

454焦磷酸测序

酿酒酵母，粉状毕赤酵母，米曲霉，

乳杆菌属，芽孢杆菌属，未分类肠杆菌科

魏斯氏菌，葡萄球菌，棒状杆菌属

曲霉型豆豉 制曲，发酵

9

Illumina扩增法测序

曲霉属，横梗霉属

枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，斯氏普罗

细菌型豆豉 新鲜成品

3

Illumina鸟枪法测序

威登斯菌，雷巧普罗威登斯菌，阴沟肠杆菌

芽孢杆菌属，葡萄球菌属，依格纳季氏菌属

细菌型豆豉 新鲜成品

6

Illumina扩增法测序

毕赤酵母属，假丝酵母属，红冬孢酵母属

毛霉与曲霉型豆豉 制曲

42

Illumina扩增法测序 曲霉属，毛霉属，假丝酵母属

匍枝根霉，总状毛霉，有性根霉

枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，假单孢菌

食窦魏斯氏菌，变异棒杆菌，费格森埃希菌

主要研究方法 主要优势微生物

文献

参考

[70]

[76]

[68]

[74]

[77]

[78]

[80]

[64]

[82]

1.4 研究目的及意义

曲霉型豆豉作为豆豉中受众面最广的一类豆豉，其生产主要聚集在我国南方

地区，虽然一些地方的主要生产环节已经实现了半自动化，但譬如接种方式往往

仍是粗放式，这一方面可能导致不同批次豆豉成品的品质存在差异，同时也提升

了有害微生物的污染风险，但若采用优良发酵性能菌株进行科学地人工复配发酵

则能够较好地解决诸类问题。需要指出的是，开展人工复配发酵试验首先应对原

有工艺发酵规律具有充分认识，如发酵环境，发酵微生物及其他关键工艺参数，

并掌握原有工艺下品质变化规律，由此通过核心菌群的复配发酵基本继承原有工

艺下的豆豉品质，达到缩短发酵周期及缩小食品安全风险的生产目标。虽然已有

一些学者对豆豉微生物变化或豆豉的品质变化进行了初步探索

[78, 79]

，但总体仍

呈指标偏少、样本零散或研究手段较为单一，这可能使豆豉发酵过程的内在规律

并不能得到很好地揭示，进而影响后续人工复配发酵工艺的探索及确立。

10

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

本文选取发酵过程中的豆豉作为研究对象，首先测定了其发酵过程中重要品

质指标、环境因子及关键酶活力的变化，从绝对丰度和相对丰度两方面探明其发

酵过程中微生物的变化，并基于分离得到优势微生物进行了环境耐受及发酵潜力

的验证。以期阐明豆豉原有工艺下基本品质特性及微生物变化的规律，并为未来

更科学化的豆豉人工复配发酵提供菌种资源及试验基础。

1.5 研究内容及路线

本文的主要研究内容分为三部分，具体如下：

(1) 采集发酵阶段的豆豉样品，统计发酵温度及pH值，测定了6个发酵阶

段豆豉样品基本品质指标，就质地、颜色，气味等进行主体感官评价，并完成各

发酵阶段关键酶的酶活力测定。

(2) 对样品中细菌、真菌，乳酸菌进行分离培养并统计群体丰度，并对分离

得到的菌株进行鉴定。通过提取30样品的宏基因组，一方面应用荧光定量PCR

测定细菌、真菌、葡萄球菌属与芽孢杆菌属的绝对丰度；另一方面基于16S保守

区域扩增获得PCR产物，通过高通量测序获得细菌相对丰度并进行关联分析。

(3) 基于分离得到的优势菌株，进行不同发酵环境（pH，温度，含盐量）的

液体及平板培养试验，针对各优势菌株开展正常环境下的豆豉纯菌发酵试验，完

成不同阶段发酵样品中关键酶的酶活力测定，并进行主体感官评价。

本文整体的技术路线如下（图1-2）：

图1-2 本文技术路线图

Figure 1-2 Technology roadmap of the paper

11

硕士学位论文

2 曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及关键酶的酶活力变化

曲霉型豆豉在历经过较短的制曲阶段，并经洗曲、堆积、拌盐后即进入较长

的（后）发酵阶段，发酵阶段特定的环境不断变化的同时，豆豉品质参数及感官

特征也会发生较大改变，其内在原因很大一部分是由微生物酶系发挥的作用。曲

霉型豆豉发酵周期往往与含盐量呈负相关，而当前鲜有关于中等盐度曲霉型豆豉

成品的品质特性兼以酶活力变化报道。本章先测定了豆豉发酵环境的主要指标，

而后对豆豉基本品质参数进行测定，辅以不同阶段豆豉感官指标的评价，另外就

与豆豉发酵品质有关的关键酶的酶活力展开测定。这可掌握原有发酵环境下豆豉

品质特性及内部酶系的分布情况，为后续探究微生物分布特征提供研究基础。

2.1 材料与仪器

2.1.1 主要药品试剂

本章主要使用的药品试剂如下所示（表2-1）：

表2-1 主要药品试剂

Table 2-1 The main medicines and reagents

名称

铬酸钾

硝酸银

氢氧化钠

葡萄糖

盐酸

乙醇

乙醚

石油醚

甲醛

麦芽糖

3,5-二硝基水杨酸

苯酚

酒石酸甲钠

亚硫酸钠

二水合柠檬酸钠

级别

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

CP

AR

CP

AR

AR

AR

AR

12

厂家

西陇科学有限责任公司

上海麦克林生化科技有限公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

北京索莱宝科技有限公司

广州韦伯科技有限公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

天津大茂化学试剂有限公司

天津永大化学试剂研发中心

西陇科学有限责任公司

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

续表2-1

一水合柠檬酸

可溶性淀粉

冰乙酸

三水合乙酸纳

碘

碘化钾

硫酸

硫代硫酸钠

羧甲基纤维素钠

酪氨酸

乳酸

乳酸钠

二水磷酸二氢钠

十二水磷酸氢二钠

干酪素

三氯乙酸

碳酸钠

福林酚试剂

对硝基苯基棕榈酸酯

曲拉通X-100

异丙醇

阿拉伯胶

对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

CP

CP

AR

AR

AR

AR

AR

BR

AR

CP

AR

AR

AR

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

上海源叶生物科技有限公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

上海麦克林生化科技有限公司

上海麦克林生化科技有限公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

上海润捷化学试剂有限公司

上海源叶生物科技有限公司

上海源叶生物科技有限公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

天津大茂化学试剂有限公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

西陇科学有限责任公司

上海蓝季生物有限公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

上海源叶生物科技有限公司

西陇科学有限责任公司

上海源叶生物科技有限公司

北京索莱宝科技有限公司

2.1.2 主要溶液及其配制

(1) DNS试剂。甲液：于10%(W/W)的NaOH溶液中加入6.9 g苯酚和0.9 g

亚硫酸氢钠，定容至69 mL；乙液：于300 mL 10% (W/W) NaOH溶液中溶解255

g酒石酸钾钠，再加入1% (W/W) 的3,5-二硝基水杨酸溶液880 mL；将二者混匀

后装入棕色瓶中，避光阴凉处放置7 d方可使用。

(2) 柠檬酸缓冲液(0.1mol/L，pH=5.6)。甲液：称取4.20 g一水合柠檬酸，纯

水定容至200 mL即配成0.1mol/L柠檬酸溶液。乙液：称取8.82 g二水合柠檬酸

钠定容至300 mL即配成0.1mol/L柠檬酸钠溶液。将甲液110 mL及乙液290 mL

充分混合即配制完毕，于4˚C保存。

13

硕士学位论文

(3) 醋酸缓冲液(0.2mol/L，pH=4.6)。甲液：称取5.44 g三水合醋酸钠，纯水

定容至200 mL即配成0.2mol/L醋酸钠溶液。乙液：准确吸取2.28 mL冰醋酸，

定容至200 mL即配成0.2mol/L稀醋酸溶液。将甲液147 mL及乙液153 mL充

分摇匀即配制完毕，于4˚C保存。

(4) 碘液(0.1mol/L)。称取0.325 g 碘及0.875 g 碘化钾，溶于10 mL蒸馏水

中，稀释定容至25 mL，并保存于棕色瓶中。

(5) 乳酸缓冲液(0.05mol/L，pH=3.0)。甲液：称取乳酸（85%~90%）6.3 g，

加水溶解定容至 600 mL；乙液：称取乳酸钠（70%）3.2 g，加水溶解并定容至 200

mL；按 8:1体积比将甲液与乙液充分混匀并稀释1 倍，并调节pH =3.0，即得 0.05

mol/L乳酸缓冲液，而后4˚C保存。

(6) 磷酸缓冲液(0.2mol/L,pH=7.0)。甲液：称取17.8 g二水合磷酸氢二钠，

使用蒸馏水定容至500 mL即为0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液。乙液：称取21.48 g

十二水合磷酸二氢钠，定容至300 mL即配成0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液。将甲液

427 mL及乙液273 mL充分混合摇匀后于4˚C保存。

(7) 棕榈酸对硝基苯酯底物溶液。甲液：取棕榈酸对硝基苯酯30 mg ，加入

10 mL的异丙醇（3 mg/mL）；乙液：取曲拉通X-100 2.0 g、阿拉伯胶0.5 g一

同溶解于450 mL的Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH=8.0）；临用时方可按甲

液：乙液体积比为1:9配成乳状液，并于2 h内使用。

2.1.3

主要仪器

本章主要使用的实验仪器如下所示（表2-2）：

表2-2 主要仪器

Table 2-2 The main apparatus

名称

数显温度计

pH计

高速冷冻离心机

高速离心机

磁力搅拌器

电热恒温鼓风干燥箱

高压蒸汽灭菌锅

酶标仪

电热恒温水浴锅

分析天平

型号

WDJ200

PB-10

H1750R

Hico 21

99-1

DHG-9140A

DSX-280B

SpectraMax M2

HWS26

BS210S

厂家

深圳市安晟一电子有限公司

Sartorius

济南泰圣医疗器械有限公司

生工生物工程（上海）股份有限公司

江苏省荣华仪器制造有限公司

上海一恒科学仪器有限公司

上海申安器械厂

Molecular Devices

上海申安医疗器械厂

Satorius

14

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

2.2 实验方法

2.2.1 豆豉采集及主要环境因子的测定

(1) 豆豉的采集。豆豉于南昌稻香园调味品有限公司采集，采集方式为同一

发酵池分批次采集，采集阶段为发酵第1，3，6，10，15，21天，每个阶段分别

采集5份样品，不同深度随机采样（同一深度混样，深度不浅于15 cm，不含盐

块及成团样），取样后装入密封袋后于4˚C冷藏盒，并尽快送至实验室。

(2) 发酵池温度的测定。每次采集豆豉样品时，均在同一处位置，将温度计

插入同等深度，待示数稳定后读数，每次测定时均重复三次。

(3) 豆豉pH的测定。取50 mL 蒸馏水，用 pH 计测定其 pH 值，调整测

定差值(<0.02)，以此为空白组。取豆豉样品各2.0 g破碎后加入空白组蒸馏水，

搅拌均匀 (30 min)，静置测定豆豉悬浮液的 pH 值，试验重复三次。

2.2.2 豆豉基本品质指标的测定

(1) NaCl含量的测定。以SBT 10170-2007标准为参照，取10 g豆豉充分破

碎加入蒸馏水定容至100 mL，离心5 min (12000 r/min)，取上清液2.0 mL于

250mL 锥形瓶中，添加50 mL蒸馏水及 1mL铬酸钾指示剂（50 g/L），混合均

匀。用硝酸银标准滴定液（0.1 mol/L）滴定至初显砖红色。量取50 mL水，进行

空白参照试验，各试验均重复三次

[69]

。

(2) 含水量的测定。含水量的测定采用常压恒重干燥法。取多个洁净称量瓶，

放入电热恒温鼓风干燥箱中，于100˚C干燥 1 h后取出冷却后称量，重复此操作

至称量差值小于0.05 g时记录为恒重。准确称取10 g的豆豉样品，放入恒重的

铝制瓶中，称重并记录，于100˚C加热干燥 2 h，冷却后取出称量，重复烘干后

至重量不再变化，各样本均重复三次。

(3) 总酸含量的测定。以SBT 10170-2007标准为参照，吸取(1)中离心后的

上清液5.0 mL，将上清液置于100 mL烧杯中，加入50mL蒸馏水，借助磁力搅

拌器不断搅拌，由此保持酸浓度的分布均匀，并使用氢氧化钠标准滴定溶液（0.1

mol/L）滴定至 pH 计指示为 pH=8.2，记录此时消耗的氢氧化钠毫升数，由此

推算总酸的含量，重复三次完成测定。

(4) 还原糖及总糖含量的测定。采用DNS法，配制不同浓度的葡萄糖溶液

完成标准曲线的制作。取7 g豆豉充分碾碎，分别用于还原糖及总糖的测定。取

1 g豆豉碾碎物溶于60 mL蒸馏水的锥形瓶，而后沸水浴15分钟后并定容至100

mL，待冷却后作10倍稀释，取稀释液100 μL置于 2 mL的EP管中，补水至200

μL，加 200 μL DNS 溶液，振荡摇匀后短暂离心，即于沸水浴加热 5 min，取出

待冷却至室温，用纯水稀释至 1.5 mL，测定OD

540

值，推算还原糖含量，重复

15

硕士学位论文

三次。另取1 g豆豉碾碎物加入10 mLHCl (6mol/L)及50 mL蒸馏水，充分混匀

后沸水浴15 min，待冷却后作20倍稀释，各样品取稀释液100 μL进行后续试验，

其他相关步骤参照还原糖测定。

(5) 粗脂肪含量的测定。参照GBT5009.6-2003中酸水解法完成粗脂肪的测

定，其基本原理为样品经处理后使用乙醚提取，去除溶剂后即为粗脂肪（含游离

脂肪与结合脂肪）的含量，具体步骤参考文献进行

[83]

。

(6) 氨基酸态氮含量的测定。采用甲醛滴定法完成测定

[69]

，具体为以总酸含

量测定完毕溶液（pH=8.2）为原液，加入10 mL甲醛溶液（36%）后混匀，使用

氢氧化钠标准滴定溶液（0.1 mol/L）滴定至 pH=9.2，记录氢氧化钠溶液的消耗

体积。空白组以50 mL蒸馏水替代，用氢氧化钠标准滴定溶液（0.1 mol/L）滴定

至 pH=8.2，后续步骤与实验组相同，测定实验均重复三次。

2.2.3 豆豉感官指标的评价

(1) 豆豉硬度的评价。参考孙森的方法

[84]

，将一薄玻璃板置于平整的台面，

取四粒较为完整豆豉放于玻璃板四角，取另一薄玻璃板盖上，逐渐加砝码，直至

豆粒完全压扁。记下砝码和玻璃板重量，重复三次。

硬度(kg/cm

2

)=砝码和玻璃板的重量/豆豉总面积。

(2) 豆豉外观、色泽与气味的评价。鉴于发酵期豆豉未进行后加工处理，因

此主要从外观，色泽与气味三方面进行评价，评价由7人小组构成，每项评分均

除去最高及最低值。具体评分规则为：色泽黑色发亮为5~3分，黑色发暗为2~1

分；豆豉香浓郁为5分，有一定豆豉香为4~3分，豆豉香微弱或无为2~1分；颗

粒完整、松散及软硬适中为5~4分，颗粒破碎或成团及太软（硬）为3~1分。

2.2.4 豆豉发酵关键酶的酶活力测定

测定酶活力测定前需制备粗酶液，具体方法为：称取5 g豆豉碾碎后均质，

置于PBS缓冲液混匀，4˚C 6000 r/min 离心15 min后的上清液即为粗酶液。

(1) α-淀粉酶活力的测定。准确配制1 mg/mL麦芽糖标准液，采用DNS法完

成标准曲线（1.5 mL体系）的制作

[69]

。样品测定时，取6个EP试管（3个为对

照，3个为测定）各加入待测酶液50 μL，在对照管中加入200 μL 0.4 mol/L的

NaOH溶液，6个管中各加50 μL柠檬酸缓冲液（pH=5.6），于45˚C恒温水浴中

反应15 min，再向各管加入在45˚C下预热的1%可溶性淀粉溶液100 μL，摇匀，

立即放入40˚C恒温水浴锅中反应5 min。取出后向测定管中迅速加入4 mol/L

NaOH溶液终止反应。反应液取出于6000 r/min离心1 min取100 μL上清液，余

下操作参照标准曲线处理，完成麦芽糖生成含量的测定。酶活单位的定义为在上

述条件下，每分钟水解淀粉产生1 mg麦芽糖为1个淀粉酶活力单位 (U)。最终

单位以 U/ g豆豉表示，下列各酶均与此相同。

16

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

(2) 糖化酶活力的测定。参考文献

[85]

，取可溶性淀粉（2%）溶液240 μL，

加入醋酸缓冲液（pH=4.6）600 μL充分振荡摇匀，于45˚C恒温水浴中预热10 min，

加入待测酶液240 μL(空白组以蒸馏水代替)，反应1 h后加入60 μL 20%的NaOH

终止反应，轻柔混匀并冷却至室温。取上述反应液1 mL于定容瓶中，先加入0.05

mol/L碘液2 mL，再加0.1 mol/LNaOH 2 mL，摇匀暗处静置15 min。加入2 moL/L

硫酸0.4 mL，使用0.05 mol/L硫代硫酸钠滴定刚好变为无色，分别记录空白和样

品消耗硫代硫酸纳标准滴定溶液的体积，算出样品组与空白组硫代硫酸钠消耗体

积(mL)的差值。酶活力单位定义为上述条件下 l h 分解可溶性淀粉产生 1 mg葡

萄糖所需的酶量为1个酶活力单位 (U)。

(3) 纤维素酶活力的测定。采用DNS法，葡萄糖标准曲线与(1)中淀粉酶测

定试验共用。在3个2 mL EP管中各加入0.5% CMC-Na溶液180 μL，加入粗酶

液60 μL，于45˚C浴中反应30 min，取出后短暂离心，于沸水浴放置5 min使酶

失活，待糖化液冷却加入180 μL DNS显色液，再沸水浴10 min，冷却后加水定

容至1.5 mL，混匀。空白组为3个2 mL EP管中各加入60 μL酶液，沸水浴5 min，

冷却后加180 μL 0.5% CMC-Na，反应时与样品组同时放入45˚C水浴30 min。其

它操作同样品组。以空白EP管调零，测定在540 nm处吸光度。纤维素酶活定

义为上述条件下，每分钟水解 CMC-Na 后释放出1 μg葡萄糖所需的酶量(mL)

为 1个酶活单位 (U)。

(4) 酸性与中性蛋白酶活力的测定。以酪氨酸标准液进行不同浓度酪氨酸的

配制，取其100 μL于EP 管，加入0.4 mol/LNa

2

CO

3

500 μL,再各加入已稀释的

福林酚试剂500 μL。摇匀后45˚C保温20 min，测定OD

660

值完成标准曲线制作。

样品组测定时，取3个EP管，每管内加入样品稀释液100 μL，置于45˚C水浴

中预热2 min,再各加入经同样预热的酪蛋白100 μL保温10 min，反应完毕立即

加入0.4 mol/L三氯乙酸200 μL以终止反应，水浴保温20 min，将残余沉淀后短

暂离心得留滤液。取滤液100 μL,再加0.4 mol/L碳酸钠500 μL以及稀释后的福

林酚试剂100 μL，摇匀，45˚C保温20 min后测定。空白组先加0.4 mol/L三氯

乙酸200 μL，酶失活后再加入酪蛋白，其余操作等同于样品组。测定酸性蛋白

酶活力时，配制酶或酪氨酸稀释液使用乳酸缓冲液（pH=3.0）。测定中性蛋白酶

活力时，相关稀释液使用磷酸缓冲液（pH=7.5）。蛋白酶的酶活力定义为在特定

条件下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个蛋白酶活力单位 (U)。

(5) 脂肪酶活力的测定。参照相关文献

[86]

，采用对硝基苯酚法，取已配制好

的PNPP(对硝基苯基棕榈酸酯)底物溶液1.3 mL，于45˚C恒温水浴锅中预热5

min，加入0.2 mL粗酶液（空白组采用蒸馏水代替），在水浴锅中准确反应10 min，

立即加入乙醇 3 min 终止反应，并于5 min之内测定在410 nm波长下的吸光值。

脂肪酶的酶活力单位：在上述条件下,每分钟释放出1 μmol对硝基苯酚的酶量定

17

硕士学位论文

义为1个酶活力单位 (U)。

(6) β-葡萄糖苷酶活力的测定。参照文献

[87]

，采用pNPG法完成对硝基苯酚

标准曲线的制定。取50 μL已稀释的酶液（空白组加蒸馏水）加入1.5 mL EP管

中，加入500 μL的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=5.6)，于45˚C水浴保温10 min，

加入已预热至45˚C pNPG溶液（5 mmol/L）450 μL，反应10 min后加入100 μL

Na

2

CO

3

(1mol/L)终止反应，而后静置并定容至1.5 mL，振荡混匀离心后测定OD

410

的值。β-葡萄糖苷酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟水解1 μmol pNPG的

酶量定义为1个酶活力单位 (U)。

数据统计分析采用SPSS 24.0完成，使用方差分析（Tukey或Games Howell

法检验）进行多组间差异比较，并将重要品质指标与之对应的关键酶进行Pearson

相关性分析。

2.3 结果与讨论

2.3.1 豆豉发酵过程中重要环境因子的变化

测定结果表明，豆豉发酵过程中温度整体呈现先升后降的趋势，在发酵初始

时，发酵池的平均温度仅36.8˚C （图2-1），但因车间约第3天前后即开启了加

热保温模式，持续的高温发酵约持续了两周，发酵末期（第21天）因稍早前控

温阀的关闭自然回落至42.2˚C。显然，中高温发酵通常可提升各类生化反应的反

应速率进而缩短发酵周期，其中酸化便是重要的反应之一，由此造成豆豉在发酵

过程中

pH值快速下降，由最初6.35回落至临近结束的4.86，而低pH的环境又

使发酵进程逐渐迟滞，加快了发酵终点的到来。此外，就各不同取样的点来看，

其温度及pH差异均较小，表明豆豉发酵池环境的整体表现基本一致。

图 2-1 豆豉发酵中重要环境因子的变化

Figure 2-1 Changes of important environmental factors during fermentation of douchi

注：不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),全文均适用。

Note: Different English letters indicate significant differences (P <0.05), and the full text applies.

18

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

2.3.2 豆豉发酵过程中基本品质指标的变化

豆豉在拌盐发酵1天后，因此时大部分食用盐已完成溶解并渗于豆豉表面，

其NaCl含量达到5.84%（表2-3），不可忽略的是，初期部分豆豉表面仍夹杂着

少量盐粒，而发酵中后阶段略高的盐浓度则往往是发酵进程的真实体现。与某些

豆豉相比

[79, 84]

，此豆豉含盐量处于较低水平，这与其更短的发酵周期相对应。

而其含水量在整个发酵过程有一定波动，其中第15天含水量达到32.08%的谷值，

与邻近两个发酵阶段存在较大差异。

豆豉发酵中会产生许多有机酸参与发酵产物的形成，进而影响豆豉的口感及

风味。通过对总酸测定后发现，该豆豉总酸上升幅度并不大，发酵第21天时为

2.01%，与某些豆豉相差不大

[88]

，满足2.5%上限的质量标准。另外，值得注意是，

豆豉发酵过程中总糖持续下降，还原糖则初期上升但后期持续下降，与前人的报

道基本类似

[70, 89]

，而前期还原糖上升意味着相关酶分解的总糖已超出微生物所

需，但之后微生物逐步消耗的量均大于其生成量。氨基氮是发酵中游离氨基酸生

成量的重要指标，主要与营养、口感有关，而豆豉氨基氮的含量是一个持续积累

上升的过程，该豆豉样品中氨基氮含量亦从0.16%达到末期的0.89%。而就粗脂

肪来看，豆豉发酵中脂肪含量仅稍下降，初期与末期差值仅为1.73%，说明在此

发酵条件下，豆豉后发酵过程脂肪的分解代谢基本处于不活跃的状态。

表2-3 不同发酵阶段豆豉的主要品质指标

Table 2-3 The main quality properties of douchi at different fermentation stages

品质特性

NaCl含量(%)

含水量(%)

总酸 g/100 g

还原糖 g/100 g

总糖 g/100 g

粗脂肪g/100 g

氨基氮g/100 g

Day 1

5.84±0.04

e

35.11±0.87

b

1.37±0.02

f

4.35±0.14

a

17.61±0.31

a

22.56±0.24

a

0.16±0.02

f

Day 3

5.93±0.03

d

35.07±0.52

b

1.45±0.02

e

4.44±0.13

a

16.62±0.56

b

21.54±0.10

b

0.24±0.02

e

Day 6

6.07±0.05

c

34.56±1.39

b

1.59±0.04

d

3.64±0.15

b

14.80±0.23

c

21.23±0.10

b

0.36±0.03

d

Day 10

6.22±0.06

a,b

36.03±0.74

b

1.74±0.03

c

2.56±0.12

c

14.12±0.13

d

21.07±0.21

b

0.53±0.02

c

Day 15

6.29±0.05

a

32.08±0.61

c

1.86±0.03

b

2.12±0.09

d

13.39±0.18

e

20.72±0.06

c

0.77±0.03

b

Day 21

6.14±0.05

b,c

37.45±0.71

a

2.01±0.05

a

1.89±0.08

e

12.98±0.11

e

20.46±0.08

c

0.89±0.05

a

2.3.3 豆豉发酵过程中主要感官特征的变化

豆豉基本品质指标变化的同时，其更直接的外在表现即感官特征也在发生较

大变化。就整体外观来看（图2-2-A），因豆豉大部分发酵阶段的环境温度较高，

此时主要由美拉德反应为主导，产生黑色素，颜色继而逐渐变黑，并在第6天至

第15天表现尤为明显，部分豆豉因发酵中酶及化学反应变得软碎（图2-2-B）。

19

硕士学位论文

就主要感官特征的评分来看（表2-4），豆豉在发酵过程中逐渐变软，硬度

指数自发酵第10天后仅下降了0.34；发酵前中期普遍带有一些不愉快气味（如

酸气味，氨气味），自15天该豆豉以酱香为主体的风味即已基本形成，在第21

天风味更加独特复杂，且更具有色泽，总体均评分达到最高4.4分。

图2-2 豆豉发酵过程中外观的变化

Figure 2-2 Changes in appearance of douchi during fermentation

注： A: 豆豉振荡后洗脱液；B: 豆豉的整体及横剖面外观

Note: A: Douchi eluents after oscillation; B: Overall and cross-sectional appearance of douchi

表2-4 豆豉发酵过程中主要感官特征的变化

Table 2-4 Changes of principal sensory characteristics of douchi during fermentation

发酵阶段

硬度指数

外观评分

色泽评分

气味评分

Day 1

2.23±0.28

1.4±0.55

1.2±0.45

2.0±0.71

质硬，颗粒完

质偏硬，颗粒完

整 ；表面微量

粒完整 ；内深

整 ；内褐色，

盐粒；内浅褐

褐色，色泽偏

色泽偏暗，有一

色，色泽暗，有

定酸气味

较弱酸气味

味及轻微氨味

及较弱酸气味

微酸气味

弱乳香气味

暗；有中等酸气

均一；有弱酱香

有酱香味及轻

强酱香气味及

色，色泽整体不

色泽大多较亮；

色，色泽亮；有

完整；内黑褐

整 ；内黑色，

分完整；内深黑

Day 3

1.68±0.23

1.6±0.45

1.6±0.55

1.8±0.45

Day 6

1.37±0.19

2.2±0.55

2.4±0.45

1.2±0.55

质软硬适中，颗

Day 10

1.15±0.21

3.6±0.45

3.2±0.45

2.4±0.55

质偏软，颗粒较

Day 15

0.96±0.11

4.4±0.45

4.2±0.45

3.8±0.45

质软，颗粒较完

Day 21

0.81±0.07

4.2±0.45

4.4±0.55

4.6±0.55

质软，颗粒大部

整体

描述

20

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

2.3.4 豆豉发酵过程中关键酶的酶活变化

豆豉在发酵过程中品质特征发生变化一部分是由于自发化学反应的进行，另

一方面则是微生物分泌的酶作用于发酵原料。为此，在测定豆豉发酵中关键酶的

酶活力后，结果发现各类酶的酶活力大小及变化规律不一（图2-3）。具体来看，

α-淀粉酶与糖化酶的酶活力主要在第1至6天酶活力较高，且均在第3天酶活力

达到最高，分别达到54.3 U/g及24.5 U/g，但在最后阶段酶活力均不足5 U/g，

均比毛霉型豆豉或制曲阶段米曲霉豆豉的酶活力低

[69, 89]

，这可能与发酵微生物

总量及发酵环境存在一定联系。而就蛋白酶来看，扮演主要角色的为中性蛋白酶，

酸性蛋白酶次之，。就具体变化趋势来看，与第1天相比，两类蛋白酶均在第3

天达到峰值147.4 U/g及39.1 U/g，亦于发酵末期酶活力达到谷值，但酸性蛋白

酶（10.8 U/g）与中性蛋白酶活力（22.8 U/g）差距不大。

另外，针对纤维素酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶测定后发现，其活力整体较淀

粉酶或蛋白酶相差1~2个数量级。其中各发酵阶段的纤维素酶的酶活力均值最

低，最高（第1天）仅为0.36 U/g，这与管泳宇等人的研究结果较为类似

[70]

，但

较制曲阶段酶活力的研究结果明显更低

[69]

。脂肪酶的变化趋势也与纤维素酶类

似，在第1和第3天的酶活力均大于0.5 U/g，发酵中后期酶活力下降一半以上。

而β-葡萄糖苷酶的酶活力自发酵第一天（1.03 U/g）即快速下降直至发酵结束，

而发酵中相关产酶微生物的绝对丰度低且产酶环境条件不佳或是重要原因。

图2-3 豆豉发酵过程中关键酶的酶活力变化

Figure 2-3 Activity changes of vital enzymes in douchi during fermentation

21

硕士学位论文

基于酶活力及品质特性变量的Pearson相关性分析表明，α-淀粉酶及糖化酶

与总糖变化量存在显著正相关（0.5˂r˂0.8，P˂0.01），而脂肪酶与粗脂肪、氨基

氮与中性蛋白酶存在低度正相关（0.3˂r˂0.5，P˂0.05），其他指标则无统计意义

的相关性。这也就意味着，发酵阶段豆豉中总糖、脂肪与氨基氮品质指标可能会

与相应的产酶源头即优势微生物存在较为紧密地联系。

表2-5 关键酶的酶活力与对应品质指标的皮尔森相关性分析

Table 2-5 Pearson correlation analysis between enzyme activity of vital enzymes and

corresponding quality properties

关键酶

α-淀粉酶

糖化酶

中性蛋白酶

酸性蛋白酶

脂肪酶

Δ总酸

-0.087

-0.201

-

-

-

Δ还原糖

0.371

0.097

-

-

-

Δ总糖

0.564**

0.656**

-

-

-

Δ粗脂肪

-

-

-

-

0.432*

Δ氨基氮

-

-

0.438*

0.267

-

注： “Δ”为后一阶段与前一阶段的差值；“**”或“*”分别表示P˂0.01或P˂0.05

Note: "Δ" refers to the difference between the later stage and the previous stage; "**" or "*" refers

to P ˂ 0.01 or P ˂ 0.05 respectively

2.4 本章小结

本章首先通过测定曲霉型豆豉的发酵环境的温度及pH，发现豆豉大多数发

酵阶段温度均在45˚C上下，pH则由初始6.35下降至结束时4.86。发酵过程中

豆豉含盐量在6%上下，含水量及粗脂肪含量整体变化较小，氨基氮及总酸均呈

稳步上升的趋势，其中氨基氮发酵结束时含量为2.01%，而氨基氮为0.89%，而

还原糖及总糖为稳步下降的趋势。豆豉发酵过程中，颜色逐步变黑，硬度变小，

以酱香为主体的风味在第15天开始形成并于第21天进一步强化。最后的酶活力

测定试验结果则表明，两类蛋白酶、淀粉酶、糖化酶的酶活力较高，而纤维素酶、

脂肪酶、β-葡萄糖苷酶的酶活力则比主要酶低2~3个数量级，所有发酵关键酶的

酶活力总体上均呈下降趋势。

22

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

3 曲霉型豆豉发酵过程中微生物结构的变化

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及关键酶系的变化与微生物息息相关，然而

过去研究者大都仅停留在其微生物的丰度变化分析

[64]

，很少将其品质变化与微

生物变化，环境改变与微生物变化等内在联系进行探讨

[79]

。本章基于上章采集

的豆豉，通过可培养法判别细菌，真菌，微生物的绝对丰度，并就分离得到的众

多豆豉发酵菌株进行了鉴定。在提取豆豉微生物的宏基因后，一方面通过特异性

引物基于荧光定量PCR技术探明了细菌，真菌，葡萄球菌属，芽孢杆菌属的绝

对丰度，另一方面通过高通量测序技术解析豆豉发酵的核心类群即细菌的相对丰

度特征，并就菌群结构与环境因子之间分别进行了功能注释及环境因子关联分

析，以期更为深入揭示原有工艺下曲霉型豆豉发酵中微生物的变化规律。

3.1 材料与仪器

3.1.1 主要药品试剂

本章主要使用的药品试剂如下所示（表3-1，部分未再列可参见2.1.1）：

表3-1 主要药品试剂

Table 3-1 The main medicines and reagents

名称

结晶紫

草酸铵

番红

纳他霉素

氯霉素

柠檬酸氢二铵

磷酸氢二钾

硫酸锰

硫酸镁

吐温80

酵母浸粉

牛肉浸粉

蛋白胨

BHI成品培养基

级别

AR

AR

AR

HPLC

USP

AR

AR

AR

AR

CP

23

厂家

北京索莱宝科技有限公司

上海麦克林生化科技有限公司

北京索莱宝科技有限公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

生工生物工程(上海)股份有限公司

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

西陇科学有限责任公司

天津永大化学试剂研发中心

安琪酵母股份有限公司

北京奥博星生物技术有限公司

北京奥博星生物技术有限公司

青岛海博生物技术有限公司

硕士学位论文

续表3-1

PDA成品培养基

细菌DNA提取试剂盒

真菌DNA提取试剂盒

土壤宏基因提取试剂盒

DNA片段回收试剂盒

青岛海博生物技术有限公司

Omega Bio-tek

Omega Bio-tek

成都福际生物技术有限公司

Omega Bio-tek

3.1.2 主要溶液和培养基及其配制

本章主要需要配制溶液和培养基如下（部分未再列可参见2.1.2）：

(1) 结晶紫染液。甲液：称取结晶紫5 g，并将其充分碾磨，量取95%乙醇5

mL充分溶解结晶紫即可。乙液：将草酸铵2.0 g溶于100 mL蒸馏水即配成乙液。

将甲、乙两液充分混合静止48 h后，过滤后即使用。

(2) 番红染液。称取番红0.5 g溶于20 mL 95%乙醇中即配成2.5%番红-乙醇

母液，母液应存放于密封性良好的棕色瓶，临用时需取2 mL母液加8 mL.蒸馏

水即为番红染液。

(3) 纳他霉素母液。准确称取0.5 g纳他霉素溶于10 mL的冰醋酸中，并借

助有机过滤头除菌分装于EP管（已灭菌）中。

(4) 氯霉素母液。准确称取0.25 g纳他霉素溶于10 mL的乙醇中，并借助有

机过滤头除菌分装于EP管（已灭菌）中。

(5) BHI培养基。称取BHI成品培养基38.5g，加热搅拌溶解于1000 mL 蒸

馏水中，固体培养基另加18 g琼脂，121˚C高压灭菌15 min, 待冷却至温热即可

加入2 mL纳他霉素母液（工作浓度0.1 g/L）

[90]

，备用。

(6) MRS培养基。分别称取磷酸氢二钾2.0 g硫酸镁 0.58 g，一水合硫酸锰

0.25 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，三水合乙酸钠5.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，

牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，加1000 mL蒸馏水定容，并加入吐温80 1.0 mL稍

加热充分混匀并调节pH约为6.4。固体培养基另加18 g琼脂，115˚C高压灭菌

20分钟,待冷却至温热即可加入2 mL纳他霉素母液（工作浓度0.1 g/L），备用。

(7) PDA培养基。称取PDA成品46.0克，加入1000ml蒸馏水中，115˚C高

压灭菌20分钟，待冷却至温热即加入1 mL氯霉素母液（工作浓度0.025 g/L），

备用。

3.1.3 主要仪器

本章主要使用的实验仪器如下页所示（表3-2，部分未再列可参见2.1.3）：

24

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

表3-2 主要仪器

Table 3-2 The main apparatus

名称

恒温培养箱

组合式振荡培养箱

双目光学显微镜

核酸电泳仪

梯度PCR仪

凝胶成像仪

蓝光切胶仪

超微量分光光度计

荧光定量仪

实时荧光定量PCR仪

型号

DH4000II

ZQZY-GS8V

SAGA003

DYY-6C

T100

GelDoc XR

G500312

Nanodrop-2000

Qubit 3.0

7500

厂家

上海奥析科学仪器有限公司

上海知楚仪器有限公司

苏州神鹰光学有限公司

北京六一仪器厂

Biorad

Biorad

生工生物工程(上海)股份有限公司

Thermo Fisher

Thermo Fisher

Applied Biosystems

3.1.4

引物序列

本章使用的引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物具体信息

及相关参考文献如下（表3-3）：

表3-3 本章中使用的引物

Table 3-3 Primer pairs used in this chapter

步骤 目标微生物 引物序列 (5’-3’)

27F: AGAGTGATCCTGGCTCAG

1492R: ACGGCTACCGACGAC

细菌

338F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

PCR

霉菌

ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC

NL1: GCATATCAATAAGCAGAGGAAAAG

酵母

NL4: GGTCCGTGTTTCAAGACGG

338F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

细菌

518R: ATTACCGCGGCTGCTGG

qPCR

真菌

NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC

Fung: ATTCCCCGTTACCCGTTG

50

53

54

806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT

ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG

58

55

[92]

退火温度 (˚C) 参考文献

[91]

[91]

[93]

[94]

[95]

25

硕士学位论文

续表 3-3

STPYF: ACGGTCTTGCTGTCACTTATA

葡萄球菌属

STPYR: TACACATATGTTCTTCCCTAATAA

qPCR

YB-P1: ACGCCGTAAACGATGAGT

芽孢杆菌属

YB-P2: GTGTGTAGCCCAGGTCATAA

60

[97]

59

[96]

3.2 实验方法

3.2.1 豆豉发酵过程中微生物的分离培养与鉴定

(1) 豆豉微生物的分离培养。本章豆豉样品基于第2章，具体采样细节可参

见2.2.1(1)。每次采样完毕，迅速于洁净环境分别称取5份豆豉，每份10 g，装

入含100 mL PBS（pH=7.0）锥形瓶中于摇床(150 r/min)振荡洗脱20 min。通过若

干只含PBS缓冲液（已灭菌）试管将原洗脱液进行梯度稀释，涂布时须依据发

酵阶段调整涂布稀释度，其中细菌 (BHI培养基)：前中期10

-6

至10

-8

，后期10

-5

至10

-7

；乳酸菌（MRS培养基）：前期10

-5

至10

-7

，中后期10

-3

至10

-5

；真菌（PDA

培养基）：前中期10

-3

至10

-5

，后期10

-1

至10

-3

。涂布完毕后，细菌于37˚C培养

24 h后计数，乳酸菌培养基需再次倾盖一层琼脂(1.5%)并封板，于37˚C培养48 h

后计数，真菌于28˚C培养72 h后计数。每个平板均挑取不同形态差异的菌落进

行多次三区划线或点接，得到单菌株进行后续所有实验同时，各形态菌株保藏若

干只甘油管于-80˚C冰箱。

(2) 豆豉微生物的形态学与分子鉴定。将各发酵阶段获得的菌株进行平板菌

落形态观察、进行革兰氏染色后，使用显微镜观察菌株的个体形态并予以记录。

将分离得到的细菌单菌株使用相应液体培养基分别培养，培养完毕将菌液离

心后得到沉淀，参照细菌DNA提取试剂盒说明书，完成细菌DNA的提取。采

用点接法或分离划线获得真菌菌落，使用无菌环挖取真菌菌落，进行液氮碾磨并

预处理后，使用真菌DNA提取试剂盒完成DNA的提取。使用27F/1492R，

ITS1/ITS4，NL1/NL4三对引物分别对细菌、霉菌及酵母进行PCR扩增，经1%

琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物符合预期，将扩增产物送至上海生工测序。将测

序结果经软件处理拼接后，执行NCBI网站的Blast在线比对程序完成分子鉴定。

3.2.2 豆豉发酵过程中微生物宏基因的提取

各阶段豆豉采集完毕后，每个样品立即称取4 g豆豉倒入40 mL PBS缓冲液

(已灭菌，下同)中，于摇床200 r/min振摇30 min，将洗脱下来的液体于双层纱

布（已灭菌）过滤装于锥形瓶（已灭菌），再次洗脱2次，同一样品的洗脱液与

之前汇合，存放于4˚C环境。各豆豉样品洗脱液置于冰盒，于4˚C下10000 r/min

26

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

离心15 min，弃去上清并用预冷的PBS缓冲液充分重悬后离心，重复2次，最

后使用4~5 mL PBS缓冲液充分重悬后，等量分装于4个EP管(2 mL)，其中3

个为备份管。所有样品于12000 r/min离心2 min，弃尽上清即初步处理完毕，而

后迅速置于-80˚C暂存。

待冻藏的豆豉样品解冻后，采用宏基因提取试剂盒按说明书进行宏基因提

取，提取中样品前期步骤应处理充分并动作轻柔，尽量提升宏基因的提取质量。

提取完毕立即取少量进行1%琼脂糖凝胶电泳检查条带亮度及完整性。而后分装

两份，置于-80˚C保存。

3.2.3 荧光定量PCR监测主要微生物类群的绝对丰度

荧光定量采用SYBR qPCR Master mix (Low ROX)试剂进行，四类主要微生

物类群即细菌、真菌、葡萄球菌属、芽孢杆菌属的相关引物及退火温度见表3-3。

各微生物类群均采用同一份原始宏基因作为模板，空白对照采用RNA-free水作

模板，每个样品均做三个平行，试验采用20 μL的反应体系，具体见表3-4：

表 3-4 实时荧光定量PCR反应体系

Table 3-4 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system

试剂

SYBR Mix

引物1 (10 mM)

引物2 (10 mM)

DNA模板

体积

10 μL

0.8 μL

0.8 μL

1 μL

7.4 μL

RNA-free水

荧光定量PCR反应程序循环均包含变性、退火、延伸三步骤，共循环40次，

荧光信号待退火结束开始收集。另标准曲线的制作与样品测定同时进行，参考相

关文献

[98]

，标准曲线以含有目的片段的单拷贝克隆作为标准样品，标准样品的

模板为10倍梯度稀释，各微生物类群依据预期丰度设置6个适当梯度，拷贝数

按相关公式转换，标准品亦做三个平行。运行结束后，由机器内置软件自动构建

标准曲线，并对荧光定量数据进行分析及作图。基于各个样品的Ct 值，从标准

曲线上计算出样品相应的起始拷贝数。

3.2.4 高通量测序监测细菌群落的相对丰度

(1) PCR扩增及切胶回收。各豆豉样品基于各自另一份独立的宏基因样，采

用细菌16S rRNA基因V3至V4保守区的338F/806R通用引物配制50 μL的反应

体系反应体系，各样品依据正向及反向引物携带的Barcode标签区分，具体的

27

硕士学位论文

PCR反应体系见表3-5：

表 3-5 常规PCR反应体系

Table 3-5 Conventional PCR reaction system

试剂

Taq Mix

338F (10mM)

806R (10mM)

DNA模板

RNA-free水

体积

25

μL

2

μL

2 μL

2

μL

19

μL

PCR反应程序循环包含变性、退火、延伸三步骤，共循环27次。反应结束

后取少量检查各样品条带的特异性及亮度。初步确认产物合格后，将余下所有

PCR产物进行琼脂糖电泳。借助蓝光切胶仪及切胶器切下目的条带后，按切胶

回收试剂说明书指示完成目的条带的回收。利用Nanodrop测定PCR产物的浓度

及OD

260/

OD

280

值，以评估其浓度及污染度，所有样品确认合格后完成统一定量，

汇合成同一管送至天津诺禾致源生物公司illumina Hiseq 2500平台测序。

测序结束后得到的原始序列已提交至 NCBI网站SRA数据库。项目检索号：

SRP239510，30个样品检索号：SRR10829571~ SRR10829600。

(2) 测序数据处理及分析。由于测序平台的原始下机数据存在引物和

Barcode序列以及一定比例的低质量数据，为提高数据的可靠性，分析前首先对

数据进行了拆分、拼接、过滤及去除嵌合体等处理

[99-101]

。而后在相似性 97% 的

水平上对所有Clean Tags序列进行聚类

[102]

，并以以所有测序序列数的0.005%作

为阈值过滤 OTU(Operational Taxonomic Units)。将处理完成的序列集合用RDP

Classifier（置信度阈值=0.8）与细菌16S:Silva数据库进行物种注释

[103, 104]

。对于

多样性分析，分别基于Mothur软件及R语言平台完成α-多样性分析及β-多样性

分析

[105]

，并采用Lefse工具进行组间差异物种分析。

3.2.5 PICRSt功能注释及关联分析

使用PICRUSt软件对生成的OTU表进行标准化处理后，通过每个OTU对

应的Gene ID获得OTU对应的KEGG家族信息，并结合数据库通过计算获得

KEGG Pathway信息及各功能类别的丰度

[106]

，并在统计学上分析比较不同发酵

阶段之间在功能上的差异。另使用Canoco 5.0 软件就优势属与主要环境因子之

间进行冗余分析(RDA)，并进行蒙特卡洛检验。

28

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

3.3 结果与讨论

3.3.1 可培养微生物的丰度及种类变化

培养后计数的结果表明，BHI平板培养基生长的微生物数量均为最高，但各

阶段微生物的绝对丰度基本呈下降的趋势，第1天BHI上各类好氧（含少量兼

性厌氧）微生物的总数目达7.71 log CFU/g，发酵第15天总数目则降至6.60 log

CFU/g，且一半以上微生物以芽孢杆菌典型特征（表面粗糙、不透明、褶皱伴乳

白或褐色）为主。MRS培养基上生长的乳酸菌的数目亦呈先降后升的趋势，其

中第1天乳酸菌为7.04 log CFU/g，于第10天降至3.65 log CFU/g的谷值。而就

真菌来看，其在发酵中也呈现大体连续下降的趋势，其中发酵初始真菌为5.31 log

CFU/g，在第15天仅为 3.24 log CFU/g，以两类形态霉菌为主。就之前报道对比

来看

[67, 69, 70]

，本试验分离各类型微生物的丰度与之前报道存在一定差异。

图3-1 不同类型可培养微生物的绝对丰度

Table 3-1 Absolute abundance of different types of culturable microbes

另外，在统计可培养微生物的绝对丰度的同时，亦挑取了具有一定形态差异

的菌落进行多次分离纯化及培养（图3-2-A），并对染色后的各菌株进行了镜检

(图3-2-B)，最终选取50余株菌进行了分子鉴定。分子鉴定结果表明（表3-6），

可培养微生物共分离得到18种菌株，其中细菌7种，乳酸菌4种，真菌6种。

（次）优势微生物主要隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏属(Weissella)、乳杆

菌属(Lactobacillus)、曲霉属(Aspergillus)、横梗霉属(Lichtheimia)，其中优势种包

括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)及

咸海鲜魏斯氏菌(Weissella jogaejeotgali)等，就豆豉分离微生物种属的分布特征来

看，这与过去的相关报道大体类似

[107]

。

29

硕士学位论文

图3-2 豆豉主要微生物的形态学鉴定

Figure 3-2 Morphological identification of dominant microbes in douchi

注：A:各培养基的形态；B: 普通光学显微镜的形态

Note: A: morphologies on various mediums; B: morphologies on ordinary optical microscope

表3-6 豆豉微生物分离鉴定的相关信息

Table 3-6 Vital isolation and identification information of douchi microbes

同源性最高

编号

B-1

B-2

B-3

B-4

B-5

B-6

B-7

B-8

M-1

M-2

M-3

M-4

P-1

鉴定种属

登录号

Bacillus velezensis

Bacillus licheniformis

Bacillus subtilis

Bacillus tequilensis

Bacillus pumilus

Staphylococcus sciuri

Staphylococcus gallinarum

Staphylococcus saprophyticus

Weissella hellenica

Weissella jogaejeotgali

Lactobacillus fermentum

Pediococcus acidilactici

Lichtheimia ramosa

MK713690.1

MN493794.1

MG980567.1

MK748243.1

NR112637.1

MT072194.1

KF015518.1

NR115607.1

NR118771.1

NR145896.1

NR104927.1

NR042057.1

KY065345.1

相似度

100%

100%

99%

99%

99%

100%

100%

98%

99%

100%

99%

98%

99%

所有阶段

第1,3,6,21天

第1,3,6天

第1,3天

第1,3天

第1,3,6天

所有阶段

第1,3天

第1,3天

第1,3,6天

第1,10,15,21天

第1天

所有阶段

是

是

是

是

是

是

是

最高

分离阶段 （次）优势菌

30

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

续表3-6

P-2

P-3

P-4

P-5

P-6

Aspergillus oryzae

Aspergillus niger

Hyphopichia burtonii

Millerozyma farinosa

Kodamaea ohmeri

MF944082

MN100313

MG554325

KY108569

KC442921

100%

99%

100%

100%

100%

第1,3,6天

第1天

第1,3天

第1,3天

第1天

是

3.3.2 宏基因提取及主要微生物类群的绝对丰度变化

仔细观察豆豉微生物宏基因的电泳条带可以发现（图3-3），各阶段1 g的

豆豉样品微生物条带的亮度存在显著差异。发酵前期（第1天至第6天）条带明

显更亮，其中以第1天亮度最佳，第6天条带亮度已变得较浅，但3个发酵时期

条带均有不同程度地降。而后期三个阶段（第10天至第21天）条带几乎消失，

第10天也仅隐约可见。由于微生物总量与电泳条带亮度基本呈正相关，由此表

明豆豉发酵的主体微生物可能在发酵前中期即已逐步消失，发酵中后期仍存活的

微生物量维持在很低的水平。

图3-3 豆豉发酵阶段宏基因的提取

Figure 3-3 Extraction of metagenomics from douchi samples during fermentation

由于以荧光染料法进行豆豉主要微生物类群绝对丰度的测定，需以标准曲线

为参照。为此通过参照文献，经前期预实验进行梯度PCR完成反应条件摸索，

对多对引物进行引物特异性的验证，最终各选取最佳的1种引物进行了荧光定量

PCR试验。结果表明（图3-4），四个类群（细菌、真菌、葡萄球菌属、芽孢杆

菌属）标准曲线均无异常溶解峰出现，而R

2

值均在0.99以上，说明其线性关系

良好，而扩增效率也均达到90%左右，这满足扩增效率80%~115%的基本要求（越

接近1越理想）

[108]

，进而说明各标准曲线均可用于豆豉微生物绝对丰度的标定。

31

硕士学位论文

图3-4 豆豉主要微生物类群的绝对荧光定量PCR标准曲线

Figure 3-4 Absolute quantitative Real-time PCR standard curves for primary microbes in douchi

注： A: 细菌；B: 真菌；C:葡萄球菌属；D:芽孢杆菌属

Note: A: Bacteria; B: Fungi; C: Staphylococcus D: Bacillus

豆豉样品的荧光定量结果表明，细菌及真菌的变化趋势均为逐步下降，这与

可培养法的试验结果基本一致。就具体值来看，细菌在发酵第1天的绝对丰度达

到7.96 log copies/g；至发酵第10天时，绝对丰度仅为6.12 log copies/g；而发酵

第21天其绝对丰度继续小幅回落至5.94 log copies/g。而真菌的绝对丰度初期峰

值仅为5.67 log copies/g，中后期三阶段真菌的绝对丰度均较为相近且均小于4

log copies/g。因发酵食品生境中古菌的比例通常很低，故发酵过程微生物的丰度

几乎可等同于真菌与细菌之和，而细菌与真菌总丰度的变化趋势亦与电泳条带亮

度的变化趋势基本吻合。就可培养法与荧光定量PCR法对比来看，虽然两者细

菌与真菌的绝对丰度值呈现存在较大差别，但两种研究方式均表明，在豆豉发酵

过程中，细菌的绝对丰度远大于真菌绝对丰度，两者约为2~3数量级的差距，与

其他食醋、大曲等发酵食品中细菌与真菌的比例差异明显

[109, 110]

。

另一方面，就分离培养的主要优势属即葡萄球菌属与芽孢杆菌属来看，葡萄

球菌属在发酵前中期的拷贝数明显大于芽孢杆菌属，但在中后期则持续下降，而

芽孢杆菌变化幅度则不大。如第1天葡萄球菌的绝对丰度达7.48 log copies/g，

第21天降至4.53 log copies/g，同期芽孢杆菌的绝对丰度则略微上升至到5.27 log

copies/g，两者丰度约相差5倍。值得注意的是，荧光定量法与可培养法计数预

估的两个属丰度比值存在较大差异，而培养平板上过半的芽孢杆菌类群往往是对

32

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

真实绝对丰度的过高预估，这或与培养基选择及芽孢杆菌极易培养的特性有关。

图3-5 基于荧光定量法的豆豉主要发酵微生物类群绝对丰度

Figure 3-5 Absolute abundance of dominant microbial groups in douchi during fermentation using

Real-time PCR

3.3.3 细菌群落的相对丰度变化

由于荧光定量PCR及可培养法均表明豆豉发酵过程中细菌群体占据绝对优

势地位，因此利用高通量测序对豆豉细菌的结构特征展开进一步探究。测序结果

表明（表3-7），经过对以最少序列的样品作参照，进行抽平后各阶段序列均接

近于15000条，Q20指数均达到97%以上，而OTU的数目则在47至99之间，

这与过去利用Miseq平台测序获得的OTU数目存在一些差距

[78]

。而稀释性曲线

的走势整体已较为平缓（图3-6-A），说明样品的测序深度已基本满足要求，即

关键的物种信息已经获得。

而就α-指数来看，6个发酵阶段的Ace及Chao 1指数变化幅度较大，两者

在第1天及第3天均相对较低，而Ace及Chao 1指数用于衡量物种数目的多少，

说明豆豉发酵第1至3天细菌种类可能偏少。与此同时，第1，3，15天的Simpson

值更小且Shannon指数更大，而物种多样性往往与Simpson指数Shannon指数的

比值成正比，与这进一步说明这三个发酵阶段物种多样性偏低。需要指出的是，

Shannon指数曲线平滑走势及Coverage指数均值接近1的现象（>0.998）（图

3-6-B），这进一步说明了此次测序结果已获得了豆豉中细菌群落的绝大部分物

种分布信息。

33

硕士学位论文

表3-7样品的测序质量及α-多样性指数信息

Table 3-7 Sequencing quality and alpha diversity indexs information of samples

发酵

Q20

（%）

阶段

Day 1

Day 3

Day 6

Day 10

Day 15

Day 21

97.17±0.20

97.20±0.17

97.39±0.12

97.29±0.17

97.37±0.09

97.29±0.05

数目

76.0±3.46

70.6±6.15

51.6±4.16

71.2±8.23

83.8±6.69

88.2±7.12

Ace

88.41±6.86

a

96.36±12.64

a,b

96.97±35.21

a,b

127.72±49.74

a,b

164.27±55.78

b

129.27±37.31

a,b

Chao 1

86.72±6.79

a,b

88.39±9.88

a,b

82.04±23.44

a

111.45±36.65

a,b

129.98±24.28

b

110.40±18.89

a,b

Simpson

0.32±0.01

c

0.32±0.04

c

0.64±0.05

a

0.40±0.08

b,c

0.36±0.04

b,c

0.45±0.06

b

Shannon

1.72±0.05

a,b

1.65±0.12

a,b

0.96±0.11

c

1.54±0.25

b

1.82±0.11

a

1.50±0.15

b

0.9992±0.0003

0.9988±0.0002

0.9995±0.0001

0.9995±0.0001

0.9995±0.0001

0.9995±0.0001

OTU

α-多样性指数

Coverage

图3-6 α-多样性指数的相关曲线

Figure 3-6 Correlation curves of α - diversity indexs

注：A:稀释性曲线；B: 香农指数曲线

Note: A: Rarefaction curve; B: Shannon index curve

经过与物种数据库比对，分别获得了从门至属水平的细菌物种分类信息，以

下重点选取了门、属两个层级就豆豉微生物的物种注释结果展开叙述。就门水平

来看(图3-7-A)，豆豉发酵过程中主要由厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门

(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)组成。首先就厚壁菌门来看，其在各阶

段样品的相对丰度都远大于其他门，发酵第一天占比达97.7%，即使最低时（第

15天）平均丰度也达到84.6%。与之变化趋势基本相反的为放线菌门，其在第

15天达到15.25%的最高占比，而6个发酵阶段整体的平均丰度仅为5.6%。另一

次优势门即为变形菌门，其在第1天平均丰度为1.1%，而后丰度维持在很低水

平。就以往豆豉微生物的相关报道来看，很多研究亦发现厚壁菌门为主要优势门

[64, 77-79]

，但变形菌门及放线菌门丰度占比则存在较大差别

[64, 77]

，少数报道还包

含本研究未发现的拟杆菌等严格厌氧菌门

[78]

。

34

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

而就属水平来看(图3-7-B)，优势属主要包括葡萄球菌属(Staphylococcus)，

芽孢杆菌属(Bacillus)，魏斯氏菌属(Weissella)，短杆菌属(Brevibacterium)等,这5

类主要优势属的在6个阶段平均相对丰度达到94.8%。首先就占比最高的葡萄球

菌属来看，其整体呈现先升后降的趋势，于发酵第6天达到最高相对丰度(93.6%)，

临近发酵结束平均相对丰度仅为12.9%，而就芽孢杆菌属来看，其在发酵第1天

平均占比仅为1%，但最后两个阶段各样品芽孢杆菌属的占比达到56.7%~72.9%，

结合其他学者报道，发现除了豆豉及其他发酵豆制品研究

[62, 78]

，其它诸类报道

也表明葡萄球菌属（凝固酶阴性菌株）及芽孢杆菌属（不产毒素菌株）在其他高

盐或高温发酵食品常扮演优势功能菌角色

[111, 112]

。而鉴于分离纯化试验并没有发

现食品安全风险菌株，这侧面说明该豆豉两优势属中有害菌株的占比可能很低。

此外，结合荧光定量PCR试验结果，也可很好解答后期芽孢杆菌相对丰度上升

的原因，即葡萄球菌及乳酸菌等原有优势菌绝对丰度发生2~3层级下降，而环境

耐受性很强的芽孢杆菌群体绝对丰度变化不大，群体比例的转换使得芽孢杆菌相

对丰度显现出快速上升的表象趋势。

另外，乳酸菌群体在豆豉发酵也扮演关键作用，如豆豉发酵第1天魏斯氏菌

的平均相对丰度达到47.9%，但在第3天即下降至3.6%，有研究表明稀态酱油

全程主要的优势细菌为魏斯氏菌为代表的乳酸菌群体

[113]

，而稀态酱油发酵阶段

温度通常不高于30˚C

[29]

，侧面说明温度上升可能是造成魏斯氏菌快速下降的重

要原因。而乳酸杆菌在前期升温即回落，而后末期降温时其相对丰度较快爬升，

如第21天其平均丰度达到14.2%，而此时环境温度已回落至约42˚C，而发酵乳

杆菌常适配的发酵温度常为40˚C上下

[114]

，说明乳酸菌群体可能对温度的波动亦

较敏感，但与魏斯氏菌相比，其在相对较高温度的生存状态或更佳。

值得注意的是，豆豉中还存在一定比例的放线菌，如短杆菌属、棒状杆菌属

(Corynebacterium)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)，其中短杆菌属在第15天的相

对丰度达到9.6%，这几类放线菌属常在盐碱环境有较多分布

[115, 116]

，但在发酵

豆制品，大曲等食品的发酵进程也常出现

[78, 117, 118]

。虽然传统上放线菌通常不像

细菌、霉菌及酵母那样被归为发酵功能菌，但近来白酒类研究已发现其可对白酒

中代谢产物的多样性造成重要影响

[119]

，进而影响风味，并在酿造环境中发挥一

定的生物调节作用。这也就意味者，豆豉发酵中，放线菌群体的比例虽整体较低，

但该群体或亦与豆豉风味的形成存在较为重要的联系。

35

硕士学位论文

图 3-7 豆豉发酵过程中微生物的相对丰度特征

Figure 3-7 Characteristics of relative abundance of microbes in douchi during fermentation

注：A: 门水平，相对丰度˂1%合并为Others；B: 属水平，相对丰度非前10合并为Others

Note: A: Phylum level, Others is a combination of which relative abundance less than 1%; B:

Genus level, Others is a combination of which relative abundance not top 10

为更好地比较不同豆豉样品在物种多样性方面存在的相似程度，使用β-多样

性中的加权算法(weighted unifrac)进行了PCoA分析。结果发现，基于物种丰度

加权后的算法，PC1及PC2两轴的解释度和为83.47%（图3-8-A）。具体来看，

同一发酵阶段的样品差异普遍较小，而不同发酵阶段物种多样性的相似度存在较

大区别，例如发酵第1天无紧邻的样品集，而中间三个发酵阶段的相似程度很高，

三者在PC1轴上更为相近，而三者葡萄球菌属均具有相近的相对丰度或是造成

其相似程度很高的原因，其PC2轴相距较远则可能是芽孢杆菌属物种丰度的差

异造成。另外，第15天与第21天PC1相距很近则主要由葡萄球菌属及芽孢杆

菌属所贡献。

另外，通过Lefse工具(LDA>4.0,P<0.05）发现了各发酵阶段具统计学差异

的标志生物（biomaker）。属水平的分析结果表明（图3-8-B），发酵第15天差

异属较多，且三类标志属均为放线菌，而发酵第1天或第21天主要的差异属为

36

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

乳酸菌群，但发酵第3天则并无差异属的出现，而发酵阶段的标志属整体较多的

现象，一定程度反映了豆豉发酵中的菌群结构历经了较大波动。

图3-8 豆豉发酵过程中物种差异性分析

Figure 3-8 The analysis of dfferences of species diversity in douchi during fermentation

注：A:基于unifrac加权算法的PCoA分析； B: Lefse分析进化分枝图

Note: A: PCoA analysis based on weighted unifrac algorithm; B: Evolutionary branch graph of

Lefse analysis

3.3.4 PICRUSt功能注释及关联分析

为更深入地比较不同发酵阶段的豆豉发酵细菌的功能基因在代谢途径上的

差异和变化，并观察发酵细菌为适应环境变化而发生的代谢功能改变，通过

PICRUSt软件将标准化的OTU数据进行了KEGG功能注释。分析结果表明，在

一级代谢通路上(图3-9-A)，各发酵阶段均为代谢(Metabolism)通路最为丰富，相

对丰度为72.9%~74.9%，在其次分别为遗传信息处理(Genetic Information

Processing)及环境信息处理(Environmental Information Processing)，而其他三类通

路的占比则很低；就发酵过程中通路的变化趋势来看，环境信息处理、遗传信息

处理及细胞过程(Cellular Processes)两类的丰度发生较为明显的阶段性变化，如第

1天与环境信息处理通路的相关占比为8.9%，而后占比其一直增加，至第21天

达到了10.1%，而代谢相关的通路则整体变化不大。

于此同时，进一步对二级代谢通路进行注释后发现（图3-9-B），主要的15

类二级的代谢通路平均占比和为92.3%，其变化趋势整体差异较大，在同属代谢

类的10条二级通路中，丰度靠前主要为碳代谢(Carbohydrate metabolism)、全局

概览(Global and overview maps)及氨基酸代谢(Amino acid metabolism)，其平均丰

度均在11.8%以上，这与Wu等人关于豆酱微生物代谢通路的注释存在一定差异

[62]

。而各代谢类通路在第3天、第6天及第10天之间大多并无显著差异（P>0.05），

37

但部分通路呈现较为明显的变化趋势，如核酸代谢（Nucleotide metabolism）在

硕士学位论文

第1天平均相对丰度为6.8%，而中期三阶段降为5.5%上下，末期继续下降为

5.0%，核酸代谢通路的逐步下降的现象暗示着菌群的繁殖随着发酵的进行或愈发

保守，某种程度也侧面印证了微生物总量呈下降趋势的结果。另一方面，其他5

个二级通路分属于遗传信息处理及环境信息处理类别，其中复制与修复

(Replication and repair)、翻译(Translation)、膜转运(Membrane transport)均整体上

呈下降趋势，再次从侧面说明豆豉发酵中后期微生物的繁殖可能陷入停滞，而信

号转导(Signal transduction)占比则保持持续上升的趋势，其相对丰度由发酵第1

天的2.7%一直攀升至第21天发酵结束时的4.57%。

图3-9 豆豉发酵过程中细菌16S rRNA的KEGG功能注释

Figure 3-9 KEGG functional annotation of bacterial 16S rRNA in douchi during fermentation

注：A:一级水平注释；B: 二级水平注释，平均丰度低于2%的通路未显示

Note: A: Annotation at level 1; B: Annotation at level 2, pathways with average abundance below

2% were not shown

为更好地揭示豆豉发酵过程微生物群落演替的环境因素，此处针对豆豉优势

菌微生物与主要环境因子之间关联性进行了RDA分析。结果表明（图3-10），

RDA两轴RDA1与RDA2的解释率和达到77.8%。具体来看，发酵过程中温度

与魏斯氏菌、乳酸杆菌呈显著负相关，但与三类放线菌存在较强的正相关，表明

乳酸菌与放线菌对温度的耐受性存在较大差距，葡萄球菌与还原糖，pH存在一

定程度的正相关，说明葡萄球菌可能更适合在还原糖较多或pH偏高的环境生存，

而芽孢杆菌则与酸度的夹角很小，说明与其他菌属相比，对豆豉发酵中总酸浓度

敏感度较低。另外，可以发现含量盐、水分的箭头连线长度较短，说明其与样本

的相关性较弱。对比其他发酵食品的环境因子分析来看，各研究者得出的结论或

因研究对象或分析工具的差别而各不相同。譬如有研究者发现海拔、温度等因素

可能是影响奶酪细菌结构特征的因素

[66]

，而Liang等人经分析后发现，腐乳中的

乳球菌、链球菌与腐乳盐含量存在较为紧密联系

[120]

，而Li等人则发现大曲环境

38

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

中乳杆菌科、芽孢杆菌科等菌群与大曲酸度、含水量等密切相关

[65]

，这与本研

究的结论存在一定差异。

图3-10 豆豉发酵中优势微生物与主要环境因子的冗余分析

Figure 3-10 Redundancy analysis of dominant microbes and primary environmental factors in

douchi during fermentation

另外，Mantel-Carlo test可对两个矩阵例如豆豉微生物群落与相应环境因素

间的相关性完成检验，同时计算单个环境因子对于豆豉发酵中细菌物种分布的解

释率。分析结果表明（表3-8），环境pH对细菌分布的解释率为最高，单因子

解释率达到51.5%（P˂0.01），而温度居其次，其解释率亦达到24.1%的较高水

平（P˂0.01），而含水量量及总酸的解释率较低。另外，含盐量与还原糖的解释

度不具有显著的统计学意义（P>0.05），说明其与菌群结构特征的关联性或较弱。

表3-8豆豉优势细菌属与主要环境因子的蒙特-卡罗检验

Table 3-8 Monte-Carlo test of dominant bacteria and primary environmental factors in Douchi

环境因子

pH

温度

含水量

总酸

含盐量

还原糖

RDA1

-0.5194

-0.1347

0.9749

0.8914

-0.832

-0.9441

RDA2

0.8112

0.0098

0.2031

0.2555

0.0622

-0.2095

解释度(%)

51.5

24.1

5.6

3.0

1.4

1.1

F

29.8

26.8

7.7

4.7

2.4

1.9

P-value

0.002

0.002

0.002

0.008

0.074

0.1

3.4 本章小结

本章首先通过培养法分离豆豉中的微生物，发现在豆豉发酵过程中细菌、真

39

硕士学位论文

菌群体的丰度呈下降趋势，特别是乳酸菌的下降尤为明显，6个发酵阶段共鉴定

出18种菌株，细菌共为12种，主要优势细菌为贝莱斯芽孢杆菌、鸡葡萄球菌、

咸海鲜魏斯氏菌，而真菌则主要为横梗霉及米曲霉菌。荧光定量PCR技术探究

发现，豆豉发酵过程中细菌及真菌中后期的丰度均较前期下降明显，整个过程细

菌的·丰度始终领先真菌2~3数量级，葡萄球菌属的绝对丰度在发酵第10天及以

后均维持在降低水平，而芽孢杆菌属的绝对丰度波动并不明显。另一方面，基于

高通量测序发现，细菌以厚壁菌门为主，而葡萄球菌属是唯一全程优势属，其丰

度呈现先增后降的趋势，最高平均丰度达93.6%；芽孢杆菌在发酵中后期占比则

逐渐上升，后两阶段其占比达56.7%~72.9%；以魏斯氏及乳酸杆菌属为代表的乳

酸细菌主要分布于发酵初期及末期；而几类放线菌属的细菌占比均较低，短杆菌

属作为优势放线菌，其最高相对丰度也仅为9.6%。

此外，PCoA及Lefse分析发现发酵中期的菌群结构更为相似，豆豉发酵过

程中细菌群落结构整体上发生了较大变化。而PICRUSt功能注释的结果表明，

豆豉发酵细菌的核酸代谢、膜运输、复制与修复等通路在发酵中整体呈下降趋势。

而冗余分析的结果表明，造成豆豉细菌菌群波动的重要环境因子为pH与温度。

40

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

4 曲霉型豆豉发酵过程优势菌应用潜力的初步评价

由于原有工艺豆豉的品质风味较大程度上是豆豉发酵中优势菌所贡献，若后

期需应用优势菌开展科学复配发酵，探明优势菌的环境耐受性并进行单菌发酵评

价则很有必要性。因此，本章基于上章分离纯化得到优势细菌，首先对其进行了

温度、pH、含盐量的环境胁迫试验，分析不同优势菌的适宜生长条件差异。而

后选取各优势菌株进行单菌豆豉发酵试验，一方面从感官指标评价单菌株的发酵

效果，并结合豆豉发酵过程中关键酶系的差异变化进行比较，以期为后续豆豉科

学细化的菌种复配发酵提供理论支撑及前期试验基础。

4.1 材料与仪器

4.1.1 主要药品试剂及菌株

本章所用的药品试剂参见2.1.1及3.1.1。黑豆购自周边商场，试验菌株来源

于第二章豆豉微生物的分离得到的代表性优势菌株，共选取了4个主要细菌属的

优势种，分别为Bacillus velezensis、Staphylococcus gallinarum、Lactobacillus

fermentum、Weissella jogaejeotgali，每个菌种各取三株开展试验。

4.1.2 主要溶液和培养基及其配制

黑豆固体培养基：黑豆粉（黑豆破碎）75 g，琼脂15 g 溶于1L水后，并经

115˚C灭菌20 min,本章其他使用的溶液及BHI与MRS培养基的配制参见2.1.2

及2.1.2，并依据胁迫因子即培养基的pH及NaCl含量及相应的培养温度，通过

控制变量完成配制，具体细节如下所示（表4-1，平板培养只进行加粗条件试验）。

表4-1 豆豉优势菌的胁迫环境试验条件配置

Table 4-1 Configurations of stress environment test conditions of dominant bacteria in Douchi

含盐量 温度/˚C

34

37

0%

40

43

47

50

6% 37

-

4.5

-

-

-

-

-

-

4.8

-

-

-

-

-

41

pH

-

5.2

-

-

-

-

-

-

5.8

-

-

-

-

-

6.4

6.4

6.4

6.4

6.4

6.4

6.4

-

7.0

-

-

-

-

-

硕士学位论文

4.1.3 主要仪器

微型粉碎机(FZ102)：天津市泰斯特仪器有限公司；可见光分光光度计

(UV752)：上海申安医疗器械厂；其他仪器参见1.1.3及2.1.3。

4.2 实验方法

4.2.1 优势菌不同胁迫环境下的培养试验

(1) 液体培养基试验。分别挑取4株隶属于不同优势细菌属（魏斯氏属、乳

杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属）的代表种于相应的普通培养基活化。活化完

成后，接入相应的普通培养基进行纯培养以制备种子液，按1%接种量，将葡萄

球菌及枯草芽孢杆菌于变动后的BHI液体培养基进行培养，乳杆菌及魏斯氏菌

则置于变动后的MRS液体培养基培养。依据豆豉发酵环境，设置包括低pH、高

盐、高温三类胁迫因子，采用控制变量法，每组内仅包含1个特定胁迫因子的差

异，培养基具体设置参见4.1.2部分。液体培养时均采用静置培养，以空白培养

基为参照，各类优势菌均为每隔3小时摇匀后测定菌液的OD值，持续监测24 h；

乳杆菌及魏斯氏菌每隔6小时摇匀并测定菌液OD值，持续监测24 h。

(2) 黑豆平板培养试验。另制备种子液，统一稀释至同一浓度（以OD

600

值

为准），取适宜稀释度进行黑豆平板（胁迫因子设置与液体培养基相同）的稀释

涂布。芽孢杆菌及葡萄球菌涂布完毕半小时即倒置培养24 h，魏斯氏菌及乳杆菌

涂布完毕半小时后倾盖一层琼脂并封口培养48 h。培养结束后，观察各平板上菌

株的形态并进行计数。

4.2.2 优势菌发酵豆豉的感官指标评价

(1) 黑豆的处理及发酵试验。参照胡会萍处理

[69]

，将精选后的黑豆用纯水浸

没并室温浸泡约7 h。待浸至绝大多数豆粒膨胀且无皱纹，沥干水分后于121˚C

蒸煮30 min。冷却后在充分拌匀盐(6%)后，将预备好的4株原工艺豆豉分离培养

得到的菌悬液按2%（V/W）的接种量，于超净工作台进行豆豉的接种，于发酵

容器中压实并外覆保鲜膜，在恒温（37˚C）恒湿（80%）的条件下发酵5 d。

(2) 各优势菌发酵豆豉的感官评价。发酵结束后，以整体外观、色泽、气味

等感官指标对各优势菌发酵豆豉进行感官评价，相关试验细节参见2.2.3(2)。

4.2.3 优势菌发酵豆豉的关键酶系测定

发酵过程中，间隔一定时间，将不同优势菌发酵的豆豉充分洗脱，进行关键

酶系的三次测定试验，相关细节参见2.2.4。

42

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

4.3 结果与讨论

4.3.1 优势菌不同胁迫环境下的培养状况差异

通过对豆豉发酵阶段分离的优势菌进行胁迫环境试验，不仅可较好地考察其

环境耐受能力，也可对上章关联分析结果进行一定验证，依据第二章自然发酵豆

豉的自然环境，合理设置培养环境分组进行试验。结果表明(图4-1)，对于魏斯

氏菌来说，虽是基于MRS静置厌氧培养的方式，但其整体的环境耐受能力表现

仍不理想。就pH来看，其最适应的pH范围约为pH 5.8至 pH 7.0，培养24 h

后OD

600

值均在1.6以上，而pH 4.8及更低时生长较为缓慢，如在pH 4.5 环境

生长24 h小时后OD

600

值仅有0.68；而就温度来看，魏斯氏菌在40˚C生长即显

著变慢，在43˚C及以上的环境生长更是几乎停滞，这与骞宇等人对食窦魏斯氏

菌的研究结果基本一致

[121]

，于此同时也很好地印证了，自然发酵豆豉在升温后，

发酵第3天魏斯氏菌属的相对丰度快速下降的结果。另外，魏斯氏菌在另添加

6%的NaCl的MRS培养24小时后OD

600

虽也仅有0.61，但同时说明其仍有较好

的耐盐能力，这一定程度解释了其在高盐分酱油常为功能优势菌的现象

[113]

。

而就另一类乳酸菌即乳杆菌属来看，其整体生长表现较魏斯氏菌更佳。就

pH来看，其在豆豉发酵中常见的pH范围(4.5~7.0)中生长整体较好，但在pH 5.2

及以下生长速度相对更慢，但24 h的OD

600

值也均在1.0以上。有学者曾对鸡肠

道来源的乳酸杆菌群体进行耐酸测试，发现其在pH 2.0或更低条件下生长受到

严重影响，而pH 3.0及4.0生长则整体较好，这与本研究的结果较为类似

[122]

。

而就培养的温度来看，其在47˚C仍有一定生长，但在50˚C时，仅1株菌保持极

缓慢生长的状态，2株菌的OD值自转接后保持无生长的状态。而就发酵乳杆菌

的耐盐性来看，其在6%的MRS中培养24 h的菌浓约等同于不加盐生长9 h的

浓度（OD

600

），表明乳杆菌对盐分的耐受性与魏斯氏菌相差不大。

芽孢杆菌及葡萄球菌作为豆豉自然混菌发酵中的优势菌，其代表种对环境胁

迫的整体耐受性较乳酸菌均明显更强。就芽孢杆菌来看，虽没有以振荡的方式进

行培养，但其在各类设置的条件均有不同程度的生长，其中pH高低对其生长造

成的影响最小，6%盐分也会造成一定影响，但鉴于快速繁殖及抗逆性极强的特

性，其在加盐培养基培养24 h的平均OD

600

值亦达到1.55，有关高盐环境关于

贝莱斯芽孢杆菌亦有较多分布的报道则从侧面进行了证明

[123]

。而就温度来看，

其在47˚C及50˚C环境中生长受到较大抑制，但对温度的耐受整体表现最佳，如

在50˚C条件经24小时培养后其OD

600

值为0.83，约为良好环境条件生长浓度的

1/3，这一定程度上解释了芽孢杆菌历经盐分及高温豆豉发酵环境，其相对丰度

在发酵后期持续攀升的现象。而就鸡葡萄球菌来看，其对酸性环境的耐受能力也

较强，在pH 4.5培养24小时后OD

600

也达到1.46，其对温度的耐受能力虽不如

43

硕士学位论文

贝莱斯芽孢杆菌，在47˚C环境培养至结束时OD

600

值也可达到0.67，但菌浓度

约仅为正常温度（37˚C）培养的30%。值得注意的是，葡萄球菌在另加6% NaCl

的BHI培养基的生长曲线与不加盐差别较小，培养24 h的菌浓（OD

600

）也达到

2.16，究其原因可能与其很强的耐盐能力有关，如含7.5% NaCl的甘露醇氯化钠

琼脂培养基常用于葡萄球菌的分离培养，在一些高盐发酵食品如肉肠，发酵鱼酱

中，葡萄球菌属也常作为优势属存在

[124, 125]

。

图4-1 豆豉发酵中优势细菌在不同培养环境的生长状况

Figure 4-1 Growth conditions of dominant bacteria in different culture environments from douchi

at fermentation stages

另一方面，通过仅原料黑豆粉配制培养基，更直观地观测不同环境条件下各

优势菌在黑豆平板上的生长状况。相关结果表明，就两类乳酸菌来看，魏斯氏菌

即使在37˚C 无盐 pH=6.4的适宜环境条件培养也仅有较少量生长，其余条件均

基本无生长或完全无生长，这或许其培养条件较为严苛有关。而就乳杆菌来看，

其在37˚C/40˚C 无盐 pH 为6.4有一定生长，其中37˚C 无盐 pH=6.4 条件下生

长的菌落更多，相同时间内该条件下的菌落形态也更大，而其他环境下培养的乳

杆菌则基本无生长甚至无生长。

而就芽孢杆菌与葡萄球菌来看，其在黑豆平板的生长状况完全不同，两者在

大部分的培养条件均具有较好生长，且在适宜的环境条件下生长速度更快。具体

来看（图4-2） 芽孢杆菌于豆板培养 24 h后即产孢，但菌体形态整体较大，而

在较低pH 或 高温（47˚C）环境的培养条件下，其形态较正常环境培养均较小，

44

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

且酸性环境较高温对芽孢杆菌的影响更大一些，值得注意的是，3株贝莱斯芽孢

杆菌中有两株在含6%盐平板生长状况明显更差，仅有两三个菌落，而另1株分

离自发酵后期的生长状况虽偏差，但较前者稍好一些。此外，就鸡葡萄球菌来看，

其在正常条件下长势更好，其次为酸性环境下培养24 h的平板，其上的菌落相

对稍小。而在含盐豆板上，葡萄球菌是唯一生长状况一般的菌株，但此时菌落形

态亦较小，高盐胁迫下24 h的培养周期显得仍不够。另外，在47˚C培养条件下，

菌落形态最小但肉眼仍勉强可见，说明温度对葡萄球菌生长的影响最为严重。

总的来看，魏斯氏菌及乳酸杆菌的长势受各类环境影响菌较大，其适宜的生

长条件相对较少，而大多数芽孢杆菌在盐胁迫的条件下整体生长不佳，葡萄球菌

在温度较高(47˚C)时生长受到严重抑制，平板培养与摇瓶静置培养的观测结果较

为一致，但各菌株在专用培养基中生长状况明显更佳。

图3-2 芽孢杆菌与葡萄球菌优势种在黑豆平板的培养形态

Figure 3-2 The culture forms of Bacillus and Staphylococcus dominant species in black bean

plates

4.3.2 优势菌发酵豆豉的感官指标差异

通过一定比例接种后的发酵试验，进而评价各单菌发酵豆豉即细菌型豆豉的

基本感官差异。结果发现（表3-2），两类乳酸菌进行发酵后，其整体感官指标

有一定相似之处，两者发酵第3天后均呈现不同程度的乳香味，同时在发酵过程

中亦散发不同程度的酸气味。具体来看，魏斯氏菌发酵第1天时豆豉的质地仍然

较硬，直至发酵第5天才散发中等浓度乳香味，或与其生长速度较慢及环境耐受

45

硕士学位论文

性偏弱存在一定联系。而乳杆菌在发酵第3天仅有轻微酸气味，但第5天因菌株

产酸较旺盛，豆豉此时的质地继而变为为较软，并散发出中等酸气味，由此导致

其整体评分由4.4分下降至4.0分。

而就芽孢杆菌来看，其在发酵初始时即开始散发出轻微的氨味，而3菌株这

类不愉快的氨气味强弱整体存在一定差异，值得注意的是发酵第3天均开始出现

一定的豉香味，而在第5天均表现出豉香味，颜色也呈现具有光泽的黑褐色，整

体评分达到4.6分。最后就葡萄球菌属来看，其在发酵第1天即开始散发轻微酱

香味，至发酵结束时酱香味已很浓，这与自然发酵豆豉的气味较为相似，进一步

从气味上证明了葡萄球菌是自然豆豉发酵的主要核心功能菌，而此时其质地虽也

变为较软，但由于其整体色泽评分偏低，故整体评分为4.4分，稍低于贝莱斯芽

孢杆菌发酵的豆豉。

表3-2 各优势菌发酵豆豉的感官指标变化

Table 3-2 Changes of sensory indexes of douchi by dominant bacterium during fermentation

菌属 发酵天数

Day 1

Weissella Day 3

Day 5

Day 1

Lactobacillus Day 3

Day 5

Day 1

Bacillus Day 3

Day 5

Day 1

Staphylococcus Day 3

Day 5

质地

硬

偏硬

中等偏软

偏硬

中等

软

偏硬

偏软

软

偏硬

中等偏软

软

色泽

浅褐色

褐色

黑色

中褐色

黑褐色

黑色

浅褐色

褐色

黑褐色

浅褐色

中褐色

褐色

气味

豆香及轻微酸气味

偏弱乳香味及较弱酸气味

中等乳香味及较弱酸气味

豆香及偏弱乳香味

偏浓乳香味及轻微酸气味

偏浓乳香味及中等酸气味

豆香及轻微氨气味

偏弱豉香味及弱氨气味

豉香味

豆香及轻微酱香味

较浓酱香味

浓酱香味

整体评分

1.5

3.1

3.9

2.4

4.4

4.0

1.3

2.8

4.6

2.5

4.1

4.4

4.3.3 优势菌发酵豆豉的关键酶系差异

由于豆豉的风味与基本品质指标与微生物分泌的酶系存在紧密联系，故而对

4种优势菌发酵豆豉过程中的关键酶系进行了测定。试验结果发现，与自然发酵

豆豉类似，各菌与糖类、蛋白降解相关酶的酶活力明显更高，就发酵阶段来看，

后期的酶活力则明显更高。具体来看，各类菌与中性蛋白酶、α-淀粉酶相关的酶

活力最高，其中贝莱斯芽孢杆菌的产酶能力最佳，如其在发酵第5天时中性蛋白

酶的酶活力达到648 U/g，α-淀粉酶为276 U/g，而芽孢杆菌相关酶较强的分泌能

46

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

力在过去也有许多报道

[126, 127]

，相比之下，魏斯氏菌整体的产酶能力更为逊色，

如其中性蛋白酶在第1天的酶活力为25U/g,，至发酵第5天时也才254 U/g，但

值得注意的是，即使是各项酶活均较低的魏斯氏菌，其主要酶活力指标较豆豉自

然发酵中的酶活力也更高一些，说明发酵池的高温及盐分会对菌株自身生长及分

泌酶系的能力造成较大的负面影响。

另外，就脂肪酶来看，其酶活相对很低，葡萄球菌及部分芽孢杆菌具有产酶

的能力，其中葡萄球菌均具有产脂肪酶的能力，但其酶活偏低，但一株芽孢杆菌

的酶活最高，但其酶活力也不足3 U/g，这与胡会萍等人存在一定差别

[72]

，其发

现源自豆豉的22株芽孢杆菌均不具有脂肪酶的产酶能力。而就纤维素酶与β-葡

萄糖苷酶来看，分别仅有2株及1株芽孢杆菌具酶活力，但均低于0.5 U/g。而

对于两个乳酸菌属而言，其均不具备三种酶的产酶能力。由此说明，豆豉自然发

酵过程中脂肪酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等三类酶可能更多的是制曲残留的酶

活力，发酵阶段中这三类酶的贡献度很低。

图4-3 不同发酵阶段优势菌产酶的变化

Figure 4-3 Changes of enzyme production by dominant bacteria at various fermentation stages

4.4 本章小结

液体培养试验表明，乳酸菌的整体表现较差，各属普遍对高温胁迫的耐受能

力较弱，其中芽孢杆菌的高温耐受性表现相对更好一些。各菌株对盐分、低pH

等均具有一定耐受性，其中葡萄球菌在6%盐分的生长基本不受影响，各菌属在

pH 5.2及以上环境的生长影响不大。通过黑豆平板培养试验发现，菌落的生长表

现较液体培养明显不佳，但各属对环境胁迫因子的耐受表现与液体培养试验结果

整体一致，胁迫环境下平板上的菌落数目更少且形态更小。豆豉发酵试验发现，

47

硕士学位论文

魏斯氏菌与乳杆菌豆豉的风味感官较为类似，主体均为乳香味，乳酸杆菌后期会

产生一定酸气味进而使得其感官指标下降；而芽孢杆菌及葡萄球菌的特征性气味

分别为豉香与酱香味，气味随着发酵的进行更为浓厚。最后，对豆豉发酵中相关

酶的活力测定结果表明，各菌属发酵中的以蛋白酶为代表的主要酶的酶活力水平

较自然发酵更高，而脂肪酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶的酶活力均维持在很低的

水平。

48

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

5 结论与展望

5.1 结论

本文以生产车间的自然曲霉型豆豉为研究对象，依托生化试验对豆豉发酵中

的品质特性、环境因子及主要酶活性的变化进行比较，并对各发酵阶段的主要感

官指标进行了主体评价；借助微生物分子鉴定技术从绝对丰度和相对丰度两方面

探明其豆豉发酵过程中微生物的变化；最后通过培养及生化试验，对分离得到的

优势微生物进行了环境耐受及发酵潜力的初步验证。主要的研究结论归纳如下：

(1) 曲霉型豆豉大多数发酵阶段温度均在45˚C上下，pH由初始6.35下降至

结束时4.86。发酵过程中豆豉含盐量为6%上下，发酵末期较发酵初期稍高；含

水量及粗脂肪含量发酵中变化较小，氨基氮及总酸呈稳步上升的趋势，其中氨基

氮发酵结束时含量达到2.01%，而氨基氮为0.89%；还原糖及总糖的含量保持稳

步下降的趋势。豆豉发酵过程中颜色逐步变黑，硬度变小，以酱香为主体的风味

在第15天开始形成并于第21天进一步加强。豆豉发酵中中性蛋白酶、酸性蛋白

酶、淀粉酶、糖化酶的酶活力较高，而纤维素酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶的酶活

力则比上述4种酶低2~3个数量级，所有发酵关键酶的酶活力总体上均为持续下

降的趋势。

(2) 曲霉型豆豉发酵过程中，可培养细菌及真菌的丰度均呈下降趋势，乳酸

菌丰度下降尤为明显。6个发酵阶段共分离鉴定18种菌株，12种细菌中主要优

势菌为贝莱斯芽孢杆菌、鸡葡萄球菌、咸海鲜魏斯氏菌，真菌以横梗霉及米曲霉

菌为主。成功提取各发酵阶段的宏基因后，荧光定量PCR试验发现细菌及真菌

在中后期的绝对丰度均较前期下降明显，细菌的绝对丰度始终领先真菌2~3数量

级，葡萄球菌属的绝对丰度于第10天及以后大幅下降，芽孢杆菌属绝对丰度的

波动并不明显。高通量测序发现豆豉发酵中细菌的主要优势门为厚壁菌门，葡萄

球菌属是唯一全程优势属，其丰度呈先增后降的趋势，最高丰度达93.6%；芽孢

杆菌发酵中后期的占比逐渐上升，后两阶段占比为56.7%~72.9%；以魏斯氏及乳

酸杆菌属为代表的乳酸细菌主要分布于发酵初期及末期。此外，PCoA及Lefse

分析发现发酵中期的菌群结构更为相似，细菌结构在发酵中整体上发生了较大变

化；PICRUSt工具注释到核酸代谢、膜运输、复制与修复等通路呈陆续下降趋势，

冗余分析发现pH与温度是造成豆豉细菌菌群演替的重要环境因子。

(3) 魏斯氏菌、乳酸杆菌在胁迫环境下整体生长不佳，各属均对高温胁迫的

耐受能力较弱，但对盐分、低pH等环境因子具有一定耐受性，其中葡萄球菌属

在6%盐分的生长基本不受影响。胁迫环境下黑豆平板上，菌落数目更少且形态

49

硕士学位论文

更小，主要结果与液体培养试验结果基本一致。魏斯氏菌与乳酸杆菌进行单菌豆

豉发酵的风味主体均为乳香味，但乳酸杆菌在发酵后期会产生一定酸气味；芽孢

杆菌及葡萄球菌发酵豆豉的特征性气味分别为豉香与酱香味。各菌属发酵中的以

中性蛋白酶为代表的多种酶活力较自然发酵豆豉明显更高，脂肪酶、β-葡萄糖苷

酶、纤维素酶的酶活力全程均很低。

5.2 展望

本文先从豆豉的基本品质及酶系等指标切入；而后对造成豆豉相关品质指标

改变的重要内在因素即微生物进行研究，首次利用三类工具从相对丰度及绝对丰

度两个层面对其进行较为全面的探查；最后结合培养试验对优势微生物的环境耐

受及发酵潜力进行初步评价。虽整体的研究路线较为连贯，但各类试验仍存在许

多不足亟需补充或改进，另还可针对某些研究问题展开更为深入地探索。

(1) 若无相关仪器限制，感官指标还可参照相关报道

[128]

，借助质构仪、色

度仪、电子舌、电子鼻等设备对豆豉各发酵阶段的对应指标（硬度、咀嚼度、色

泽、味觉、气味）进行更为科学、精准、全面的评价，并进行统计学差异评价。

(2) 本文虽对豆豉发酵中各类微生物虽进行了一定强度的分离筛选，但仅限

于为单个豆豉发酵池的不同区域跟踪，未来可对不同发酵池、不同季节、不同加

工阶段进行扩大化筛选，以更加全面地获得自然发酵曲霉型豆豉中的菌种资源。

(3) 通过优化豆豉微生物的宏基因提取技术，获得高质量的宏基因，进行无

需PCR扩增的鸟枪法宏基因测序，获得优势菌的基因组草图、种水平的注释分析

及更为准确全面的功能注释信息，并结合风味代谢组学进行联合分析。还可参照

相关报道

[80, 129, 130]

，进行RNA提取/功能蛋白的抽提及双向电泳分离，完成豆豉

微生物宏转录或宏蛋白测序后，结合其它相关试验，从实时微生物及现存功能蛋

白的角度进行更为精确、全面地分析。

(4) 限于试验周期，本文仅进行了环境胁迫试验及优势细菌的单菌豆豉发酵

试验，并没有考虑豆豉实际发酵过程中微生物共同培养时发生的互作

[131]

，在进

一步探索优势菌混菌培养可能发生互作的同时，还可进行含酵母的双菌及多菌不

同比例混合的豆豉精细化复配发酵，并对豆豉发酵中的综合理化特征，风味指标、

酶活力进行更为细致的追踪，以确立更为科学的复配发酵参数。

50

曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

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硕士学位论文

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曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

致 谢

韶光易逝，三年的硕士生涯恍然间已匆匆过去，短暂又坎坷的科研旅途在特

殊的今年也更快地画上了句号。值此停笔之际，首先感谢王筱兰教授和杨慧林老

师的悉心指导，无论从选题、设计、实验乃至定稿环节，都倾注了两位老师许多

心血和宝贵时间，在此衷心地向两位老师说一句谢谢。

其次，感谢江西师范大学生命科学学院提供的实验环境以及南昌稻香园公司

提供的试验样品，本论文的工作才得以完成。感谢王老师中后期给予的关照，首

年选题未定，而前期安排的选题因诸类缘故陷入瓶颈，是您给予我新的选题空间，

本选题方向由此确立。感谢杨老师日常科研上给予的帮助，特别是实验环节给予

了较多指导。两位老师对科研的态度均值得我学习。感谢李浩师妹对本论文实验

作出的贡献，平时与你关于前沿文献的探讨也让我的科研思维更为广阔，也衷心

祝愿你试验顺利。感谢实验室已毕业师姐及师弟（妹）平时的陪伴与帮助。另外，

也一并感谢所有在读期间帮助、支持和鼓励我的人们。

此外，特别感谢我的父母，深深感谢他们的养育之恩，是他们大力的支持与

付出使得我能够顺利完成学业，平日也给予了我最多的问候和鼓励。

最后，向百忙之中抽出时间对本论文进行审阅、评议和参与本人论文答辩的

各位老师表示衷心地感谢。

2020年5月

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硕士学位论文

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曲霉型豆豉发酵过程中品质特性及微生物变化规律研究

在读期间公开发表论文（著）及科研情况

1. 曲霉型豆豉发酵阶段细菌群落的演替及其与环境因子的关系[J] 食品科学,网

络首发.（第1作者）

2. 豆豉中 β-甘露聚糖酶高产菌的分离鉴定及其酶学性质[J] 江西师范大学学报

（自然科学版）, 2020,44(2):196-201.（第1作者）

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