2024年3月20日发(作者：)

第

27

卷第

6

期

4

2009

年

11

月

北京工商大学学报

(

自然科学版

)

JournalofBeijingTechnologyandBusinessUniversity

(

NaturalScienceEdition

)

Vol

1

27No

1

6

Nov.2009

　　

文章编号

:1671

2

1513

(

2009

)

06

2

0004

2

03

玄参新鲜根和干燥根总

DNA

提取方法的比较研究

沈志雯

,

　刘　蕾

,

　徐　瑾

,

　杨业然

,

　何聪芬

(

北京工商大学化学与环境工程学院

,

北京　

100048

)

摘　要

:

用十二烷基磺酸钠法分别提取玄参新鲜根及干燥根的

DNA.

电泳结果显示

,

从玄参新鲜

根中可提取到完整

DNA,

而从“发汗”后的玄参干燥根中提取的

DNA

已降解

.

使用紫外分光光度

法对新鲜根中提取的

DNA

进行纯度鉴定

,A

260

/A

280

为

1

1

83.

结果表明

,

所采用的十二烷基磺酸钠

法可经济高效地从玄参根部提取到高质量的

DNA.

关键词

:

玄参

;DNA

提取

;

十二烷基磺酸钠法

中图分类号

:TS218;Q751

　　　　　文献标识码

:A

　　玄参

(

Scrophularianingpoensis

Hemsl.

)

为玄参

科玄参属多年生宿根类草本植物

,

以根入药

,

别名元

参、黑参、浙玄参、乌元参等

,

主产于浙江、湖北、江

苏、江西等省

,

为常用中药

.

玄参始载于《神农本草

经》

,

列为中品

,

其味甘、苦、咸

,

性微寒

,

归肺、胃、肾

经

,

具有凉血滋阴、泻火解毒之功效

.

高质量

DNA

的提取已经成为分子生物学研究的重要技术环节之

一

,

能否快速、经济地提取植物总

DNA

以及所提取

的

DNA

质量的高低将直接影响整个实验结果

.

与

其他提取植物

DNA

方法比较

,

曾有报道十二烷基

硫酸钠

(

Sodiumdodecylsulfate,SDS

)

法对植物根中

DNA

的提取有效

,

本文主要研究玄参根部

DNA

提

取方法的优化

,

以建立适宜药材玄参

DNA

的提取

方法

.

(

pH

值为

8

1

0

)

、

100mmol/L

氯化钠、

1%

巯基乙醇、

20%

十二烷基硫酸钠

2

1

5mol/L

醋酸钾

(

pH

值为

4

1

8

)

;3mol/L

醋酸钠

(

pH

值为

4

1

8

)

;

酚氯仿

(

1

∶

1

)

;

异丙醇

;70%

乙醇

;

无菌水

;RNA

酶

(

RNaseA

)(

sig

2

ma

)

;

所用试剂均为国产或进口分析纯

.

1

1

3

　实验仪器

4K15

型超速冷冻离心机

,Sigma;PowerPac

1000

型电泳仪

,BIORAD;DYCP

2

33A

型电泳槽

,

北

京市六一仪器厂

;AlphalmagerHP

型凝胶成像系统

等

.

1

1

4

　实验方法

[1-4]

1

1

4

1

1

　干燥根部

DNA

提取方法

玄参根部含有大量的酚、萜、苷

[5]

类物质

,

这些

物质对

DNA

的提取有一定的影响

,

因此

,

对玄参干

燥根设置平行对照组

,

一组为不处理

,

一组为

70%

乙醇浸泡

2h

处理

.

1

)

取玄参根部

0

1

1g

液氮研磨

,

加入

600

μ

L65

℃预热的提取缓冲液及

66

μ

L20%SDS;2

)

65

℃水

浴保温

45min,4

℃

10000r/min

离心

10min;3

)

取

上层清液加入

2/3

体积的醋酸钾溶液

,

冰上静置

30

min;4

)

4

℃

10000r/min

离心

10min;5

)

取上层清

液加入等体积酚氯仿溶液

,

充分混匀后

4

℃

10000

r/min;6

)

取上层清液加入

0

1

6

倍体积的异丙醇

,

混

1

　材料与方法

1

1

1

　实验材料

玄参新鲜根购于浙江省磐安大盘镇中药材市

场

;

玄参干燥根购于北京市航天桥同仁堂药房

,

产自

浙江

.

1

1

2

　

SDS

法所用试剂

提取缓冲液

:100mmol/L

三羟甲基氨基甲烷盐

酸盐

(

Tris

2

HCl

)(

pH

值为

8

1

0

)

、

50mmol/LEDTA

收稿日期

:2009

2

04

2

10

基金项目

:

北京市教育委员会自然科学基金资助项目

(

KM2

)

.

)

,

女

,

浙江宁波人

,

研究方向为生物工程

;

作者简介

:

沈志雯

(

1988

—

)

,

女

,

河北无极人

,

教授

,

博士

,

主要从事植物分子生物学方面的研究

.

通讯作者

.

何聪芬

(

1966

—

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

第

27

卷第

6

期　　　　　　　　沈志雯等

:

玄参新鲜根和干燥根总

DNA

提取方法的比较研究

5

匀后于

-20

℃保存

2h;7

)

4

℃

10000r/min

离心

10

min;8

)

沉淀物干燥后溶于

400

μ

L

无菌水中

,

加入

等体积酚氯仿溶液

,

充分混匀

;9

)

4

℃

10000r/min

离心

10min;10

)

加入上层清液体积

1/10

的醋酸钠

溶液

,

混匀后加入

2

倍体积的无水乙醇

,-20

℃保

存

2h;11

)

4

℃

10000r/min

离心

20min,

用

70%

乙

醇洗涤

,

干燥后溶于

50

μ

L

无菌水中

,

放置于

-20

℃

保存

.

1

1

4

1

2

　以新鲜根为材料

SDS

法提取

DNA

乙醇浸泡处理

(

图

1

中

3

～

4

)

得到的

DNA

亮度明显

高于未处理组

(

图

1

中

1

～

2

)

,

证明

70%

乙醇浸泡可

有效减少根部多酚物质对

DNA

的影响

.

2

1

2

　

SDS

法提取新鲜根

DNA

结果分析

SDS

法提取玄参新鲜根中

DNA

结果如图

2.

由图

2

可见

,DNA

主带明显且清晰无拖尾

,

可以提

出玄参新鲜根的总

DNA.

结果说明

,

本研究所使用

的

SDS

法可以有效去除蛋白质及多酚类物质

;

加入

RNA

酶可有效去除

RNA,

则电泳图无

RNA

条带出

现

.

然而

,DNA

主带的亮度不高

,

产率较低

,

推测原

因是玄参根叶片中含有较多的酚类物质

,

极易自发

氧化褐变或在多酚氧化酶

(

PPO

)

作用下发生酶促褐

变

,

生成褐色的醌类物质等

,

这些物质与核酸发生不

可逆结合而使提出的核酸产率下降

.

第

1

)

至

7

)

步与

1

1

4

1

1

中相同

.

沉淀物干燥后

溶于

400

μ

L

无菌水中

,

加入

2

μ

LRNA

酶

(

RNase

A

)

,37

℃水浴

30min,

其后步骤与

1

1

4

1

1

中

9

)

至

11

)

步相同

.

1

1

5

　

DNA

质量检测

电泳

5

μ

LDNA

与

1

μ

L6

×

LoadingBuffer

混合

均匀

,1

×

TAE

电泳缓冲液

,0

1

8%

琼脂糖凝胶

,150V

30min

快速电泳

,EB

染色后使用凝胶成像系统分

析

.

稀释

50

倍后用紫外分光光度法测量

DNA

纯

度

.

2

　实验结果分析

对玄参干燥根进行预处理结果显示

,70%

乙醇

浸泡

2h,

处理后溶液呈棕色

.

玄参根部含有环烯醚

萜苷类成分

[6]

,

该类成分是玄参发汗后变黑的主要

成分

,

在乙醇溶液中容易被析出

.

2

1

1

　

SDS

法提取干燥根

DNA

结果分析

图

2

　

SDS

法提取玄参新鲜根

DNA

结果

1

～

2:

为玄参新鲜根

DNA

用

SDS

法提取玄参干燥根中

DNA,

结果如图

1.

由图

1

可见

,

无完整的

DNA

主带出现

,

但有大量

因以玄参干燥根为材料无法提取到完整的

DNA,

所以仅对新鲜根为材料

SDS

法提取到的

DNA

进行纯度检验

,OD

260/280

为

1

1

83,

接近理论值

1

1

8,DNA

质量浓度为

402

1

5

μ

g/mL.

根据电泳图结

弥散的条带

,

根据大小判断

DNA

片段已降解为小

分子

;

点样孔亮度较低

,

蛋白质及酚污染较少

.70%

果及分光光度计检测结果

,

提取到的

DNA

质量较

高

.

3

　结　论

使用

SDS

法提取玄参新鲜根可以得到条带清

晰

,

纯度

(

OD

260

=1

1

83

)

较高的

DNA.

试验结果说明

,

采用玄参新鲜根能提取到完整

的

DNA,

而采用玄参干燥根提取的

DNA

已被降解

,

推测是玄参的制药过程经过“发汗”作用所造成的影

响

.

“发汗”过程是将供药用的块根

,

白天晾晒

,

夜间

图

1

　

SDS

法提取玄参干燥根

DNA

结果

1

～

2:

未处理的玄参干燥根

DNA

提取结果

;

3

～

4:70%

乙醇浸泡处理的玄参干燥根

DNA

提取结果

.

堆积

,

反复堆积晾晒至半干

,

堆积

2

～

3d

“发汗”

,

使

块根内部变黑

,

再进行白天晾晒、夜间堆积

,

直至全

干

;

遇雨天则用炕烘烤

,

温度

60

℃左右

,

并适时翻

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

6

北京工商大学学报

(

自然科学版

)

　　　　　　　　　　　　　

2009

年

11

月

动

,

烘至半干时进行“发汗”

,

再烘干

,

随后又经长时

间存储、运输

,

导致

DNA

在这些过程中被降解

,

在

提取过程中无法得到完整

DNA.

此外

,

玄参根部含

有大量的酚、萜、苷类物质

.

酚类物质极易自发氧化

褐变或在多酚氧化酶

(

PPO

)

作用下发生酶促褐变

,

生成褐色的醌类物质等

.

这些物质与核酸发生不可

逆结合而使提取的核酸产率下降

.

其中

,

环烯醚萜

类和苯丙素苷类化合物含量较高

,

这两类化合物溶

于乙醇

,

经

70%

乙醇浸泡处理后

,

可使部分环烯醚

萜类和苯丙素苷类物质溶出

,

如果能够去除一部分

这类物质

,

可减少其对

DNA

提取的影响

.

本研究在干燥根的

DNA

提取中

,

对直接研磨

与液氮研磨干燥根提取

DNA

分别进行了研究

,

结

果表明

,

直接研磨效果与液氮研磨一致

.

推测原因

是干燥根本身质地较为坚硬同时缺少水分

,DNA

酶

活性很低

,

不会对干燥根中的

DNA

造成太大的影

响

.

本研究对加入异丙醇后

-20

℃保存时

,

时间对

DNA

提取的影响进行了研究

,

选择的保存时间分别

为

1h

、

2h

、过夜

.

结果表明

,

加入异丙醇后

-20

℃

保存

1h

产率最低

,

而保存

2h

及过夜产率较高且相

近

.

因此

,

选择

2h

为最优保存时间

.

参考文献

:

[1]

　肖冰梅

,

周小江

,

罗京

.

玄参总

DNA

提取方法的比较研

究

[J].

湖南中医药大学学报

,2008,28

(

2

)

:31

2

32.

[2]

　王琼

,

程舟

,

张陆

,

等

.

野山人参和栽培人参的

DALP

指纹图谱

[J].

复旦学报

:

自然科学版

,2004

(

12

)

:1030

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[3]

　宋振巧

,

王明明

,

王建华

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等

.

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2

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冯波

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[5]

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黄真

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浙江中医药大学学报

,2008

(

3

)

:268

2

270.

[6]

　

NguyenAT,JeanineF,MalonneH,es

2

terandaniridoidglycosidefromScrophularianingpoensis

[J].Phytochemistry,2005,66

(

10

)

:1186

2

1191.

COMPARATIVESTUDYONEXTRACTINGDNAFROM

FRESHROOTSANDDESICCATEDROOTSOF

SCROPHULARIANINGPOENSIS

HEMSL.

SHENZhi

2

wen,

　

LIULei,

　

XUJin,

　

YANGYe

2

ran,

　

HECong

2

fen

(

CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering,BeijingTechnologyand

BusinessUniversity,Beijing

100048

,China

)

Abstract:

Scrophularianingpoensis

icaltradtitonalChineseherb,whichcontainsphe

2

nolics,terpenesandglycoside,paper,themodifiedmethodsofSDSwereusedtoextract

ultsshowthatthegenomic

DNAcanextractfromfreshroots,A

260

/A

280

ofge

2

nomicDNAfromfreshrootsis1

1

lusion,thisprovidesaneconomic,convenientandeffec

2

tivemethodofDNAisolationforabiologicalstudyof

scrophularianingpoensis

Hemsl.

Keywords:

scrophularianingpoensis

Hemsl.;DNAisolation;modifiedSDS

(

责任编辑

:

叶红波

)

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.