2024年3月5日发(作者：)

全科医学临床与教育2021年4月第19卷第4期ClinicalEducationofGeneralPracticeApr.2021，Vol.19，No.4·305··论著·类风湿关节炎患者肠道菌群的分布及其临床意义康海英吴君平张马军王云卿[摘要]目的探究肠道菌群在类风湿关节炎（RA）发生中的分布及其临床意义。方法选取RA患者20例和同期健RA组的OTU菌群丰度、α-多样性、β-多样性低于对照组。RA组的Intes⁃康对照组20例作为研究对象。对两组患者的肠道菌群进行高通量测序，比较两组的OTU菌群丰度、α-多样性、β-多样性、菌群分布及LEfSe差异分析。结果tinibacter菌属的丰度增加，乳杆菌属（Lactobacillus）、大肠志贺氏杆菌（Escherichiashigella）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、CandidatusSaccharimonas菌属、Odoribacter菌属、肠球菌属（Enterococcus）丰度降低。结论RA患者肠道菌群丰度明显低于健康人，部分菌群存在明显差异，改变肠道菌群结构可能是今后RA治疗的一个研究方向。[关键词]肠道菌群；类风湿关节炎；高通量测序ThedistributionandclinicalsignificanceofintestinalflorainthepathogenesisofrheumatoidarthritisKANGHaiying，WUJunping，ZHANGMajun，mentofRheumatologyandImmunology，theFifthPeople'sHospitalofYuhangDistrict，Hangzhou311100，China.[Abstract]ObjectiveToinvestigatethedistributionandclinicalsignificanceofintestinalflorainthepathogenesisofTotally20patientswithrheumatoidarthritis（RA）-throughputsequencingwasperformedontheintestinalfloraofthetwogroups，andtheabundance，α-diversity，β-diversity，distsTheintestinalfloraabundance，α-diversityandβ-estinalfloraabundanceofRATheabundanceofintestinibacterincreased，theabundanceofLactobacillus，Escherichiashigella，Klebsiella，CandidatusSaccharimonas，sionpatientsisobviouslylowerthanthatofhealthypeople，ore，changingtheintestinalflorastructuremaybearesearchdirectionforthetreatmentofRAinthefuture.[Keywords]intestinalflora；rheumatoidarthritis；high-throughputsequencing类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种慢性的，以骨质破坏、关节功能丧失及慢性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病[1]。其发病机制尚未明了，可能与遗传和内外环境因素有关[2]。随着新一代高通量测序技术的发展，微生物与RA的关系也受到临床科研工作者越来越多的关注，尤其是肠道DOI：10.13558/1672-3686.2021.004.006（医学2017015）作者单位：311100马军）浙江杭州，杭州市余杭区第五人民医院内分泌肾脏科（康海英），内分泌科（吴君平），检验科（张基金项目：杭州市余杭区医疗卫生科研、重点学科建设微生物群。有研究表明，肠道菌群紊乱与RA的发生和发展密切相关[3]。本研究采用高通量测序技术分析RA人群与正常人群中肠道菌群的分布特征及差异，旨在为今后RA的防治提供理论依据。1资料与方法1.1一般资料选取2018年1月至2020年7月在杭州市余杭区第五人民医院就诊的RA患者20例为RA组。本次研究经过本院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。排除：①既往接受过抗风湿治疗的患者；②接受过激素治疗的患者；③近期3个月内接受过抗生素治疗的患者；④应用过胃肠动力药的患者；⑤合并有胃肠炎病史的患

·306·全科医学临床与教育2021年4月第19卷第4期ClinicalEducationofGeneralPracticeApr.2021，Vol.19，No.4者；⑥合并其他自身免疫性疾病的患者。另外选取同期门诊健康体检者20例为对照组。RA组中男性7例、女性13例；平均年龄（45.26±8.13）岁；平均14病程（3.42±1.10）年；对照比较，例；平均年龄（42.64±7.82）组中男性6例、女性1.2差异均无统计学意义（P岁。两组性别、均＞0.05年龄1.2.1检测方法）。饮食习惯。均在早上粪便样本的采集6∶00所有样本人群均无特殊～8∶00用无菌采样盒收集新鲜粪便标本。采样时均佩戴无菌手套，手持无菌棉签迅速取样后放置于无菌培养盒中，在-18℃下冷冻保存，1.2.2Kit总DNA并于提取24h采用内完成QIAampDNA提取。DNAStoolMini说明书进行实验操作。试剂盒提取粪便细菌基因组总DNA，严格按照1.2.3和80627R肠道菌群分析进行16SrDNA所有样本均使用引物V3~V4可变区的PCR338F扩增，CA-3正向引物序列为WTCTAAT-3’，反向引物序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAG⁃5’-GGACTACHVGGGT⁃量测序’。构建MiSeq文库，使用MiSeqMiseq行拼接，测序得到的（由美国Illumina公司生产）进行双端测序。高通同时对序列质量进行质控和过滤。获得优PEreads首先根据overlap关系进化序列后，erational库对taxonomic使用QIIMEunits软件进行操作分类单位，OTU）聚类，基于Silva（op⁃1.3OTU进行物种注释和分类学分析。数据OTU监测指标比较两组患者肠道菌群分布的成差异。分析、a-多样性分析、b-多样性分析及菌群组1.4对数据进行处理。组间肠道菌群的统计学方法采用SPSS22.0统计分析软件a-多样性采用t检验，各菌群间差异比较采用Wilcoxon秩和检验，组间菌群差异采用LDA及LEfSe分析。设P＜0.05为差异有统计学意义。22.1结果由封二图两组OTU2分析见封二图可见，RA组的肠道菌群丰度低于对2照组，2.2且肠道菌群OTU图3两组患者肠道菌群的数目总和低于对照组。a-多样性分析见封二由封二图3可见，RA组Chao和Sobs指数均低于对照组，差异有统计学意义（t分别=0.01、0.02，P均＜0.05）。2.3由封三图两组患者肠道菌群的4可见，基于b-OTU多样性分析见封三图丰度的主成分分析4显示，RA组的肠道菌群结构明显与对照组不同，对照组的b-多样性明显高于RA组，在对照组中，部分粪便样本的细菌群落与RA组相似，而对照组中其他个体的微生物组成与2.4RA组完全不同。由封三图两组患者肠道菌群组成比较见封三图5可见，在属水平，拟杆菌属和5Faecal⁃ibacteriumRA菌是两组人群中丰度最高的菌群，虽然照组，组拟杆菌属和Faecalibacterium菌的丰度高于对2.5由封三图LEfSe但两组差异无统计学意义。差异性分析见封三图6可见，两组患者的肠道菌群构成存6在显著差异，其中RA组的Intestinibacter菌属的相对丰度高于对照组，对照组中乳杆菌属（Lactobacil⁃lus）、大肠志贺氏杆菌（Escherichiashigella）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、CandidatusSaccharimonas菌属、Odoribacter菌属、肠球菌属（Enterococcus）相对丰度明显高于RA组。3讨论家RA在世界范围内的发病率约1%，在发达国0.3%~0.6%的发病率，且女性发病率约为男性的为0.5%～1.0%，在我国的2发～病3倍率为[4,5]。人体在正常情况下，肠道内存在着梭菌、双歧杆菌及类杆菌等大量定殖细菌，会影响机体内环境，并促进体内维生素、蛋白质等营养物质合成，成为肠道的天然屏障[6]。有研究表明，肠道定殖菌群如果出现菌群结构或数量的改变，会使肠道的屏障功能减弱，致病菌易侵袭机体而诱发疾病，且细胞因子会被肠道细菌细胞壁的肽聚糖成分激发并释放，21这可能是诱发RA发病的一个重要因素[7]就得到了系统的论证世纪以来，RA患者与健康人之间的菌群差异。自[8]。但是国内RA患者微生物的构成比例仍不清楚，以往的研究多采用细菌培养的方法分析菌群结构，但这种方式受多种因素影响，因此也就不能客观地评价菌群结构以及菌群与疾病的相关关系。近来基于16SrDNA基因设计通用引物进行PCR扩增，通过高通量测序分16S析菌群结构，是菌群结构分析的有效方法。测环境的微量细菌，rRNA测序技术的优点是不必培养细菌即可检同时随着宏基因组测序技术的日趋成熟，这使系统性分析肠道菌群结构和功能成为可能。

全科医学临床与教育2021年4月第19卷第4期ClinicalEducationofGeneralPracticeApr.2021，Vol.19，No.4·307·本研究结果显示RA组的肠道菌群丰度、a-多样性、deWieleb-等多样性低于对照组，这与Chen等[9]、Van[10]的研究结果一致。在属水平，拟杆菌属和Faecalibacterium菌是两组人群中丰度最高的菌群，虽然RA组拟杆菌属和Faecalibacterium菌的丰度高于对照组，但两组无明显统计学差异。RA组的Intestinibacter菌属的丰度增加，乳杆菌属（Lac⁃tobacillus）、大肠志贺氏杆菌属（Escherichiashigel⁃la）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、CandidatusSac⁃charimonas菌属、Odoribacter菌属、肠球菌属（En⁃terococcus）丰度降低。这表明RA患者的肠道菌群与健康人群存在差异，肠道菌群的组成可能通过改变微生物功能而促进RA的发生或发展。乳杆菌属与机体的免疫应答密切相关，参与机体的非特异性和特异性免疫应答，它可能在RA发生和发展过程中起关键作用。乳杆菌属及肠杆菌属等肠道定植菌群数量的减少，可能会阻碍黏膜免疫系统的发育成熟，降低机体免疫力，增加RA的易感性，激活机体的自身免疫应答，导致RA的发生。而且机体肠道微生物在生长和分裂过程中，肽聚糖会不断地从细胞壁中脱落，并越过肠道屏障进入循环。Huang等[11]的实验研究表明，肠道微生物群可间接地使肽聚糖增加，导致胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷酰胺浓度升高，激活并触发促炎症信号通Huang路，等促使RA的炎症反应加重。本次研究与[11]的研究类似，RA患者均发生肠道菌群结构的改变，提示RA的发生发展可能受不同发病机制的促进或诱导。肠道菌群与宿主相互作用形成了人体复杂有序的微生态系统，物种多样性丰富，其含量高，数量约为人体细胞的10倍。大量研究均表明，肠道菌群除了能维持人体肠道、免疫环境及生理功能的稳态，还会影响肠道以外的部位。一项研究曾表明RA的发生发展受肠道菌群的差异性及多样性的影响，菌群紊乱会促进RA形成，而调整菌群则可有效延缓RA进一步发展[12]。Liu等[13]研究提示了乳杆菌属与RA的发生和发展之间的潜在关系，这与本次研究的结果一致。Zhang等[14]RA果显示，患者治疗前后口腔及肠道菌群的变化的研究结通过宏基因组测序检测RA患者发病一年后，唾液、牙菌斑和粪便中的唾液乳杆菌均显著增加，且在疾病处于高度活动期的患者中表达最为明显，而嗜血杆菌的丰度则明显下降，且与RA自身免疫抗体的滴度呈负相关。表明肠道菌群紊乱与RA疾病的发生和发展密切相关。但对于肠道菌群如何影响机体诱发RA的机制仍有待进一步的研究和考证。本次研究为小样本、单中心的病例对照研究，可能会存在组间个体差异较大的情况，后期应增大样本量进行进一步的研究。目前RA患者主要以药物治疗为主，治疗效果较好，但长期服药的副作用较大，探究更有效安全的治疗方法势在必行。本次研究中RA患者存在一定的肠道菌群紊乱，日后研究可多从肠道菌群调整角度出发进行探索分析，RA的防治提供理论依据。为综上所述，RA患者的肠道菌群分布与健康人群存在显著差异，其发病可能与肠道菌群结构和数量的变化有关。而肠道菌群如何影响机体诱发RA的机制仍有待进一步的研究和考证。参考文献1自我护理能力和负性情绪的影响傅根莲，刘晓霞，许敏霞.延续护理对类风湿关节炎患者[J].健康研究，2018，382（王志文4）：382-385.[J].按摩与康复医学，.早期类风湿关节炎患者的肠道微生物群落研究3MaedaY，TakedaK.2018Role，9（of16gut）：rheuma⁃4庞立园，arthritis[J].J丁锐，张瑾，Clin等Med.菌群变化对类风湿关节炎的影响，2017，6（6）：60.5[J].蔡艳娟，中国微生态学杂志，对类风湿关节炎的诊断价值杜娟，卢小岚，等2016.抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体，28（12）：1477-1479.[J].川北医学院学报，2019，634丁瑞雪，（2）：197-200作用的研究进展武俊瑞，，211.[J].岳喜庆，中国乳品工业，等.益生菌对肠道营养健康调控7高举梅，刘毅，刘冰，等.双歧杆菌四联活菌片对类风湿关2018，46（1）：24-32.节炎患者TNF-α和脂联素水平的影响[J].泰山医学院学8报，Sun2017Y，Chen，38（7）Q：，taLinP，teristicsofgutmi⁃9hai，China[J].FrontinpatientsCellwithInfectrheumatoidMicrobiolarthritis，2019，9：⁃thritis[J].GenomelineageChenJ，intestinalWrightK，MedmicrobesDavisJM，2016，8（characterizes，nsion1）：toidofrarear⁃10RheumatoltheVanmicrobiotadeWieleT，VanPraetJT，MarzoratiM，11Huang，2016，shapes12（7）：ticdiseases[J].NatRevmicrobiota-derivedZ，WangJ，XuX，dyneutralizationofflammationandamelioratescirculatingautoimmunity[J].peptidoglycanNatdampensMicrobi⁃in⁃

·308·全科医学临床与教育2021年4月第19卷第4期ClinicalEducationofGeneralPracticeApr.2021，Vol.19，No.412VaahtovuoJ，MunukkaE，KorkeamäkiM，i⁃13LiuX，ZouQ，ZengB，isoffecalLactobacil⁃toidarthritis[J].CurrMicrobiol，2013，67（2）：170-176.2008，35（8）：，2019，4（5）：766-773.14ZhangX，ZhangD，JiaH，landgutmicrobi⁃izedaftertreatment[J].NatMed，2015，21（8）：895-（收稿日期2020-11-09）蔡华波）crobiotainearlyrheumatoidarthritis[J].JRheumatol，luscommunitystructureinpatientswithearlyrheuma⁃（本文编辑（上接第304页）miRNA-21表达水平能够使PTENmRNA、FsaLmRNA表达水平升高，与文献报道一致[17]。综上所述，胆囊癌组织中miRNA-21明显高于正常癌旁组织，下调胆囊癌细胞中miRNA-21表达水平能够抑制细胞增殖活力、周期和迁移能力，使细胞内PTEN和FasL表达增高，具有作为胆囊癌治疗新靶点的潜力。参考文献1234分析[J].中国基层医药，2020，27（13）：1555-1558.焦辉，鲁艳，张志刚，等.胆囊结石合并胆囊癌134例临床RappardDF，BugianiM，BoelensJJ，addercarcinoma：PrognosticfactorsandsuppressorPTENincolorectalcancer[J].CellPhysiolBio⁃9chem，2017，43（3）：-155，miR-21，miR-221，miR-30a，miR-34aandmiR-29a：Comparisonofcolonicandrectalcancer[J].InVivo，2018，32（6）：，2011，8（5）：706-713.2020，18（5）：，KissI，GyöngyiZ，sionofCirculat⁃10KumarswamyR，VolkmannI，tionand11LuJ，TanT，ZhuL，thylationcausesfunctionofmiRNA-21inhealthanddisease[J].RNABi⁃MIR21overexpressionintumors[J].MolTherOncolytics，andtheriskofpolypsandcarcinomainmetachromaticleukodystrophy[J].Neurology，2016，87（1）：103-111.12黄体政，孙鹤，肖军.miR-21在结肠癌细胞失巢凋亡调节13ChenCY，ChenJ，HeL，：Tumorsuppressor2018，9（5）：338.（5）：645-649.中的作用及机制研究[J].重庆医科大学学报，2020，45（43）：euticoptions[J].WorldJGastroenterol，2015，21andmetabolicregulator[J].FrontEndocrinol（Lausanne），FOXOandARsignalinginprostatecancer[J].AdvExpMedBiol，2019，1210（3）：ol，2011，90（6）：，2003，3（2）：fistulacausedbyaggressivemucinousgallblad⁃dercarcinomawithaporcelaingallbladder[J].ClinJGas⁃troenterol，2019，12（5）：iA，iogenesisandregulationofMatsumotoY，FujimotoK，MitsuokaE，ystodu⁃14YanY，layamongPI3K/AKT，PTEN/15LettauM，PaulsenM，SchmidtH，tsintothe5678（7）：es：Anoverview[J].MethodsMolBiol，2017，1509Thetherapeuticconnection[J].AdvCancerRes，2017，135cellularmatrixdegradationandangiogenesisinTMJOAbytargetingSpry1[J].ArthritisResTher，2020，22（1）：，ZhangA，LiX，-21-5pregulatesextra⁃WuY，SongY，XiongY，NA-21（Mir-21）VanRK，hallmarksandmicroRNAs：molecularregulationofFasL（CD178）biology[J].EurJpressionofFasLandBaxinhumanlungcancer[J].Clin16BadilloAI，BadilloSC，VillalobosR，iveex⁃17张琳梅，陈诚，张耀超，等.PTENp1作为miR-21吸附“海报：医学版，2020，41（5）：713-717.（收稿日期2021-02-24）蔡华波）（本文编辑（1）：119-149.绵”在口腔鳞癌中调控PTEN的表达[J].西安交通大学学promotescellgrowthandinvasionbyrepressingtumor

假手术组模型组阳性药对照组中药低剂量组图1中药中剂量组各组VD大鼠海马组织病理改变（苏木精-伊红染色，×100倍）中药高剂量组（见内文第295页）10%1%0.1%0.01%0.001%RA组对照组OTU总等级数量800300200RA组对照组相对丰度OTU水平等级A400100510样本数量B1520注：A为Rank-Abundance曲线图；B为PanCore曲线图。图2两组OTU分析（见内文第306页）500OTU水平的Chao指数4OTU水平的Sobs指数RA组对照组5000A注：A为Chao指数估计物种总数；B为Sobs指数观察OTUs数目。图3两组肠道菌群的a-多样性分析RA组B对照组（见内文第306页）

对照组RA组对照组RA组A注：A为由加权UniFrac分析生成的主成分分析（PCoA）图；B为采用UniFrac软件进行的OTU聚类分析。图4两组患者肠道菌群的β-多样性分析B（见内文第306页）RA组对照组RA组对照组AB注：A为属水平的肠道菌群分布图；B为属水平的肠道菌群Wilcoxon秩和检验条形图。图5对照组RA组两组肠道菌群分布及差异图对照组RA组（见内文第306页）A注：A为肠道菌群的LDA值分布柱状图；B为肠道菌群的进化分支图。图6LEfSe差异分析图B（见内文第306页）