2024年3月5日发(作者：)

细菌，古菌分离鉴定方法

张冉 2017.03

一.古菌及古菌分类进程：

以表型为基础 数学分类系统 化学分类系统 古菌被认为是原核生物的独立群体 多相分类法（表形、化学特征、基因型、系统发育信息）

暂定非培微生物（provisional status Candidatus）

二．细菌、古菌分类历史

时间 分类依据

表形，生长条件，致病力

表型，生理学，生物化学

化学分类学，数学分类学,DNA杂交

基因型分析，多位点序列分析，平均核苷酸相似度，全基因组测序分析

19世纪末

1900-1960

1960-1980

1980-至今

三．细菌、古菌鉴定方法

方法 依据 优点

对分类相关性进行了量化测量

对分类鉴定十分有用

缺点

不能反映系统发育关系

备注

基于表型分析的数学分类系统

增加实验次数，计算种属之间表型相似度系数

化学分类学

DNA碱基组成，醌类型，细胞壁化学组成，肽聚糖

类比动植物分类学方法

不能建立系统发育关系

1970-1980年间通过偏微商和rRNA小亚基基因序列分析，能够鉴定系统发育关系

理论基础模型需要考虑到物理，化学和物种形成的边界限制

理论基础模型

（以生态为基础的方法，集合种群概念）

生态位和菌株具有一对多和多对一现象，仍不清楚生态位是否是生态群

方法

操作模型

基因型方法

基于数据分析

表型方法

基因型分类

依据

基因相关性，DNA杂交，比较同源大分子序列

形态，生理，化学分类

优点

可以反映亲缘关系

缺点

相对于动植物而言，不可能从化石记录和个体形态发育来比较

备注

通过经验累计，已经有了一套关于表型和系统发育相似性的鉴定标准。例如，DNA杂交显示，有大于百分之70的相似性，培育温度相差小于5℃，则认为它们是一个种。

对于常规检定有用

对不可培微生物有广泛用途

对于亲缘关系，只能提供有限信息

由于过分保守性，不适用于种间区分。不适用门水平上的鉴定。

16S,23S rRNA是稳定的标记，较少收到横向基因转移的影响。并且普遍存在，功能不变，保守同源。

当16S rRNA相似度小于98.7％，则认为是不同的种（对应的DDH小于70％）。然而，当相似度大于98.7％时，也不一定是同一种。

对于种内的划分，DDH是参考标准，并不是黄金定律。

用16S rRNA确定发育地位，判断是否要做DDH。

ANI值与16S rRNA，DDH结果相对应。95％ANI值对应70％DDH相似性。当ANI值大与95％时，对应16S rRNA比对结果至少大于98.5％。

多相分类法

表型，化学方法，基因型，系统分类信息

平均核苷酸相似度（ANI）

通过比较基因组来分类

基于两两基因组之间所有同源蛋白质1编码序列比较的一平均值

比较多个看家基因

在细菌分类中，有重要的作用

ANI或替代操作复杂的DDH

不能处理未知的大量微生物

基因型分类法

多位点序列分析（MLSA）

看家基因提供了有效的不受重组影响的核苷酸位点

对不可培微生物进行分没有系统的方法筛选特征位点，设计扩增引物

仍有一些微生物不可测得

最好的方法是找到这一系列菌株中至少12个基因序列，重建系统发育树。

Candidatus概念用于不可培微生物

暂定非培微生物

原位探测已知真实性或已知发育相关性的细菌

类

注：1.同源蛋白：指进化上相关的蛋白质。即不同物种中具有相同或相似功能的蛋白质或具有明显序列同

源性的蛋白质。

同源基因：两个相比较的序列之间的匹配程度。一般来说，如果两条基因序列相似性达80% ，就可以把它们称为“同源基因(homologous gene)”。为了便于研究，Fitch又把同源基因分为直向同源基因（从祖先继承下来的基因）、横向同源基因（基因重复而产生的同源基因）和异源同源基因（基因在不同物种之间横向转移）。

附.论文中出现的表格

表2.16S rRNA基因序列分析的优缺点

优点 缺点

16S rRNA具有作为标记分子的所有特性（普遍存在，由于基因过分保守，在种水平的坚定上不可靠

功能不变，保守，同源）

rRNA是稳定的标记，很少受到基因转移的影响

基因型的分析与与rRNA结果一致

由于参与转录翻译的大部分信息的保守性，其与系统发育数的分支有良好的一致性

方便了不可培细菌的鉴定

很难鉴定门级别上的进化关系

存在多个16S rRNA（大多数情况下有1-2％的序列发散范围，但有时会更高）

表杂交的优缺点

优点

现今，对于种的分类而言，是参照标准

若菌株的DDH值大于70％，在标准条件下培育温度小于5℃，则属于同一种。

若菌株的DDH值小于70％，则需要做16S rRNA序列比对。若其数值等于或小于98.7％，可被认为是新种。

缺点

只是对于基因关系一个粗略的测量

只能区分相近的种和亚种（大于90％的相似性）

方法分冗长，费时，数据库不先进

不适用于非培微生物

表4.多位点序列分析（MLSA）优缺点

优点

多基因提供更多核苷酸位点信息，缓冲区减少了基因座重组的扭曲作用

看家基因是必须基因，且进化速度相对较慢，但比rRNA基因的进化速度快

相对于rRNA，可更精确的分类

可与rRNA数据结合分析

与经典的种的定义，有很好的相关性

方法适用于自动化和大型数据库的开发建设

缺点

仍不清楚如何选取一套合适的基因。对于不同的分类而言，一套是不够的。

如何设计能够在所有菌株中扩增基因引物，是很困难或是说不可能的。

即使是7-12个基因序列，对于全基因组而言，仍是很小的一部分。

不可用于非培细菌

表5.非培微生物的特征描述

特征

系统发育信息

形态学，革兰氏染色，特异性识别

生境或来源

生理学，代谢

生长温度

集群可能包含不同的菌株

举例

序列比较分析，如16S rRNA，宏基因组数据

球菌，杆菌，丝状，革兰氏染色，基因组数据，

自由生活，共生，

电子受体，电子供体

嗜冷，嗜热