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VIP基因在狮头鹅繁殖周期下丘脑—垂体—性腺轴中的表达

变化

张响英;卞有庆;唐现文;王利刚;刘新

【摘 要】为了探索狮头鹅繁殖周期下丘脑—垂体—性腺轴中VIP mRNA的表达规

律,选取产蛋期、就巢期、休产期狮头鹅母鹅各6只,采用荧光定量PCR方法分别

测定了各时期下丘脑、垂体及卵巢VIP mRNA的表达水平.结果表明,狮头鹅就巢期

血清催乳素(PRL)质量浓度为30 ng/mL,明显高于产蛋期和体产期(P＜0.01),下丘

脑就巢期VIP mRNA的表达量较其他繁殖周期高(P＜0.05),而垂体产蛋期VIP

mRNA的表达量最高(P＜0.01).提示狮头鹅下丘脑—垂体—性腺轴中VIP mRNA

的表达水平与PRL分泌密切相关,PRL是狮头鹅就巢行为维持和发展的关键激

素.%To investigate the expression of VIP gene in the hypothalamus-

pituitary-gonadal axis at different stages during the reproduction cycle in

Shitou goose, the expression levels of VIP gene were tested by FQRT-PCR

method in six female geese at stages of laying, incubation and laying

cessation, respectively. The results showed that in incubation stage, the

level of serum PRL was 30 ng/mL,higher than that of other stages (P<0. 01).

The expression of hypothalamus VIP in incubation was highest (P<0. 05)

while the pituitary VIP in laying stage was highest (P<0. 01). Therefore, the

expression level of VIP gene in the hypothalamus-pituitary-gonadal axi is

highly associated with PRL secretion in Shitou goose,and PRL is the key

hormone for incubation maintenance.

【期刊名称】《河南农业科学》

【年(卷),期】2013(042)003

【总页数】4页(P121-124)

【关键词】狮头鹅;繁殖周期;催乳素;VIP mRNA

【作 者】张响英;卞有庆;唐现文;王利刚;刘新

【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300

【正文语种】中 文

【中图分类】S835

狮头鹅是我国唯一的大型鹅种，是国家重点保护的优秀地方品种资源之一。狮头鹅

具有体型高大、生长速度快、肉质细嫩、肥肝性能好等特性[1]，但其就巢性较强，

年产蛋仅28枚左右，严重制约了狮头鹅养殖规模的扩大及商品价值的发挥。禽类

就巢现象的产生和抱性的诱发是由物种的遗传特性决定的，同时也是多种激素综合

作用的结果，其中催乳素（PRL）是引起家禽就巢行为发生和维持的关键激素[2－

5]。

血管活性肠肽（VIP）又名舒血管肠肽，是一种重要的生物活性肽，属胰高血糖素

－胰泌素家族成员。Lea等[6]研究证明，VIP 能促进禽类PRL分泌。随后，

Halawani等[7]证明，VIP 是家禽PRL的释放因子，具有刺激和调节PRL释放的

作用。因此，VIP是禽类就巢行为的决定因素。目前，有关VIP对鹅生殖活动的调

节作用研究很少。鉴于此，针对狮头鹅极强的就巢性，采用实时定量PCR技术检

测不同繁殖阶段下丘脑－垂体－性腺轴中各组织VIPmRNA的表达变化情况，分

析VIP的组织表达与PRL分泌是否密切相关，旨在为揭示狮头鹅的就巢机制及提

高其繁殖性能提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 试验动物

狮头鹅由江苏畜牧兽医职业技术学院国家级水禽基因库提供并饲养，分别于产蛋期、

就巢期和休产期各取6只健康狮头母鹅，屠宰后立即摘取下丘脑、垂体及卵巢，

快速用DEPC处理后，迅速投入液氮冷冻保存。

1.2 PRL的测定

采用时间分辨荧光测定法进行测定，试剂盒购于上海新波生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据鹅的VIP mRNA序列（GenBank登录号：DQ023161）和持家基因

（GAPDH）的 mRNA序列（GenBank登录号：AY436595），应用Premier

5.0软件分别设计引物P1和P2。引物信息见表1。

表1 狮头鹅VIP mRNA和GAPDHmRNA的PCR引物引物名称 引物序列（5′－

3′） 产物长度／bp P1160 P2 F：AACGCCACTCTGATGCTGTC R：

AAGGAAGGTTCAAGAATTTCTGC F：CGACCCCAGCAACATCAAG R：

CGGAGATGATGACACGCTTAG 128

1.4 总RNA的提取与cDNA合成

利用Trizol试剂盒提取总RNA，经核酸定量分析仪和凝胶电泳检测后立即进行反

转录。反转录反应体系为20μL，具体见表2。反应条件：65℃预变性5min，25℃

退火10min，迅速取出反应管置于冰上，立即加入反转录酶1μL，42℃延伸

60min，85℃灭活5min。

表2 反转录反应体系试剂 体系用量／μL 2×RT Buffer 6N随机引物（100pmol／

μL）灭菌DEPC水RT－mix模板（总RNA）10 1 3 1 5

1.5 荧光定量PCR

反应体系为50μL，具体见表3。反应条件：94℃4min；94 ℃ 20s，60 ℃ 30s，

72 ℃ 30s，35个循环；72℃检测信号。

表3 荧光定量PCR反应体系试剂 体系用量／μL 2×PCR Buffer Primers

（25pmol／μL）灭菌DEPC水模板cDNA SYBR GreenⅠ25.0 1.0×2 20.5 2.0

0.5

1.6 统计分析

反应在FTC 2000荧光定量PCR仪上进行，自动分析荧光信号并将其转换为Ct值

及溶解曲线图。每份样本设3个重复管，VIP基因的表达强度用对应的GAPDH

基因量进行校正，即△Ct＝Ct（VIP）－Ct（GAPDH），其相对表达量采用2－

ΔΔCt法进行分析。数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 13.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 狮头鹅繁殖周期PRL水平的变化

从图1可以看出，狮头鹅就巢期血清PRL质量浓度较高，达到30ng／mL，远远

高于其他繁殖阶段（P＜0.01）。

图1 狮头鹅繁殖周期PRL水平的变化小写字母和大写字母分别表示0.05、0.01显

著水平

2.2 总RNA完整性检测

利用核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和OD值，OD260／OD280在1.6～2.0，

符合试验要求。琼脂糖凝胶电泳图显示3条带，分别为28S、18S和5S，其中

28S和18S条带清晰，5S条带较暗（图2），说明样品RNA纯度较高，无明显

降解，可用于荧光定量PCR分析。

图2 总RNA琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 GAPDH和VIP基因的扩增曲线

由图3可以看出，GAPDH和VIP基因的扩增曲线走势正常，呈典型的S型曲线。

图3 GAPDH和VIP基因的扩增曲线

2.4 GAPDH和VIP基因的融解曲线

GAPDH和VIP基因的融解曲线均呈单一尖峰（图4），表明设计的引物特异性好，

无引物二聚体和非特异产物。

2.5 VIP基因在狮头鹅不同繁殖周期下丘脑－垂体－性腺轴中的表达变化

由表4可以看出，VIP基因在狮头鹅下丘脑、垂体和卵巢中均有表达，不同组织

VIP基因表达量不同，并且随着狮头鹅繁殖周期的变化，其表达量亦随之改变；下

丘脑就巢期VIP基因的表达量显著高于产蛋期和休产期（P＜0.05），而垂体产蛋

期VIP基因的表达量较其他繁殖周期高（P＜0.01）。

表4 VIP基因在狮头鹅不同繁殖周期下丘脑－垂体－性腺轴中的表达变化注：同行

不同大、小写字母分别表示差异达0.01、0.05显著水平。组织 产蛋期 就巢期 休

产期下丘脑垂体卵巢0.338±0.089Ab 1.399±0.312Bb 0.555±0.097ab

0.462±0.134Ab 3.901±0.835Aa 0.748±0.136a 0.915±0.223Aa

1.014±0.207Bc 0.372±0.064b

图4 GAPDH和VIP基因的融解曲线

3 讨论

家禽的就巢性不仅与环境、遗传相关，而且还与其自身的生殖内分泌激素水平变化

密切相关。Proudman等[8]发现，血浆PRL浓度急剧上升诱导火鸡表现就巢行为，

就巢结束血浆PRL浓度也下降至较低水平，提示血浆PRL浓度与火鸡就巢行为的

发生和维持密切相关。本研究发现，狮头鹅就巢期血清PRL质量浓度高达30ng／

mL，远远高于其他繁殖阶段（P＜0.01）。Shi等[9]测定了不同季节马岗鹅血浆

中PRL浓度，结果表明，休产季节血浆PRL浓度最低（5ng／mL），就巢季节血

浆PRL浓度最高（超过20ng／mL）。在众多家禽品种中，血浆PRL浓度升高抑

制其繁殖活动和触发家禽换羽[9－11]，提示血浆中高水平的PRL是家禽就巢发生

和维持的主要原因。

本研究结果表明，VIP 在狮头鹅下丘脑－垂体－性腺轴中均有表达，不同组织VIP

表达量不同，并且随着狮头鹅繁殖周期的变化，其表达量亦随之改变。在家禽中，

VIP作为生理性PRL释放因子，有调控垂体 PRL mRNA 表达的作用[12]。

Kuenzel等[13]通过免疫组化研究VIP在鸡组织的分布发现，VIP神经元主要集中

在下丘脑中，下丘脑分泌的VIP进入垂体门脉运输到垂体，与垂体分泌PRL细胞

上的VIPR结合促进PRL分泌，VIPR基因主要在垂体中表达。Sharp等[14]研究

发现，就巢鸡下丘脑内侧基部VIP水平明显大于产蛋鸡。本研究发现，狮头鹅就

巢期下丘脑VIP表达量明显高于产蛋期和休产期（P＜0.05），而垂体产蛋期VIP

的表达量较高（P＜0.01），这与 Yupaporn等[15]对火鸡生产周期中VIP的表达

量研究结果相一致，刘毅[16]在浙东白鹅上也得出相似的结论。随着下丘脑VIP的

表达量和血浆PRL浓度的上升，抑制了GnRH和LH／FSH分泌，产蛋停止，卵

巢和输卵管开始退化，家禽开始就巢[17]。本研究进一步证明了VIP与PRL分泌

密切相关，对其具体的作用机制还有待于深一步研究。

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