2024年3月27日发(作者：vivo x20 plus)

液质联用法筛选黄芩中清除自由基的活性物质

刘渊宏;宋龙

【摘 要】目的:用液质联用方法快速筛选黄芩药材中用于清除人体内自由基的活性

物质.方法:通过对黄芩中提取制得含4种单体(野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、黄芩

素)的样品溶液,分别与各自由基制得的溶液混合,以甲醇为对照孵化培养,液相色谱-

质谱联用方法对黄芩提取液中各组分分离,以峰面积的变化来进行考察.结果:清除自

由基实验结果显示,这4种成分经过与超氧自由基、羟基自由基、过氧自由基反应

后含量都有不同程度的减少.结论:黄芩中4种成分对DPPH、超氧自由基、羟基自

由基和过氧自由基都具有一定的清除作用.

【期刊名称】《中国中医基础医学杂志》

【年(卷),期】2015(021)009

【总页数】4页(P1156-1159)

【关键词】自由基;黄苓;液质联用

【作 者】刘渊宏;宋龙

【作者单位】甘肃奇正藏药有限公司,兰州 730000;上海中医药大学中药学院,上海

201203

【正文语种】中 文

【中图分类】R965.1

自由基是导致人体衰老、癌症的主要诱因，为近代科学研究所重视。在人体自由基

中，活性氧(ROS)占到自由基总量的95%，其中人体内重要的活性氧自由基包括

超氧阴离子自由基、羟基自由基、脂氧自由基被认为是抗自由基活性物质清除自由

基性能的重要评价指标［1-2］。为防治自由基对人体产生的危害，抗自由基物质

开发成为科学研究的重点。在生物尤其植物中存在着大量的天然抗自由基化合物，

其副作用很低、种类多且易于应用，成为抗自由基物质开发的重要方向［3-5］。

天然产物中黄酮类物质对自由基有着独特的优势。黄芩作为传统中药，目前已被列

入世界众多国家的药典，如中国、韩国、日本等。其主要活性成分即为黄酮类成分，

如黄芩苷、黄芩素等，且这些成分的抗氧化、抗自由基作用也受到科学研究的重视。

与此同时，黄芩地上部分(茎叶)中黄酮类物质以野黄芩苷、野黄芩素为主，具有抗

氧化、抗自由基的作用。但这4种成分对人体内重要自由基清除活性，却未得到

深入研究。

抗自由基物质评价主要有体外评价和体内评价，体外评价如ABTS自由基阳离子清

除实验、超氧阴离子自由基清除实验、羟自由基清除实验、脂氧自由基清除实验等

［6-7］;体内评价常采用小鼠或大鼠作为实验对象，测定结果能够真实反映抗自由

基物质在生物体内的清除活性，但由于检测指标多而复杂、实验周期长、费用昂贵

等原因，并不适合抗自由基物质的前期筛选。

为深入研究黄芩中的抗自由基活性，本文采用体外自由基评价方法，就黄芩中所含

野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、黄芩素等4种成分对人体内氧阴离子自由基、羟

基自由基、脂氧自由基的清除作用进行研究，为黄芩抗自由基物质的前期筛选开发

研究提供重要的理论支撑。

HH-S4电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁

力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司;YLD-6000 SHP生化培养箱，扬州鸿都电子

有限公司;AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;KQ5200DE数控

超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;Surveyor高效液相色谱质谱联用分析仪，

美国Finnigan。

黄芩茎叶购自陕西西安，经上海中医药大学生药教研室鉴定为唇形科植物黄芩

(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥全草。对照品为野黄芩苷，含量98%，阿

拉丁试剂(中国)有限公司;Free Radical DPPH购于美国Sigma公司(，

MO，USA);其他实验所用试剂均为国产分析纯试剂。

2.1 提取物制备

准确称取黄芩地上部分6.60 g，采用热回流法，加入350 mL甲醇，60℃提取4

h。在提取液中，按提取液中野黄芩苷含量为2%，等质量添加野黄芩素;按黄芩苷

含量为8%，等质量添加黄芩素，制备为P (primary)液。

野黄芩素、黄芩素为实验室自制。取野黄芩苷(或者黄芩苷)3.0 g，依次加入120

mL70%乙醇、20 mL浓硫酸，110℃加热6 h，搅拌速率10 r/s。反应结束后，

加入6倍体积量纯水，过滤并收集滤饼即为野黄芩素(或者黄芩素)。

2.2 色谱总离子HPLC

2.2.1 色谱条件 流动相的选择与优化中分别采用乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-甲

酸-水、甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-甲酸-水。通过图谱的对比分析得出，在流

动相为乙腈、甲酸和水的条件下，采用全梯度洗脱模式能够达到最优的分离度和选

择性，优化的梯度洗脱条件如下(乙腈:A，0.5%甲酸水:B):0 min，A:3%，

B:97%;23 min，A:10%，B:90%;40 min，A:46%，B:54%;60 min，A:100%。流

速控制在0.2 ml/min，考虑分离效率的同时，兼顾色谱柱的柱填料(3 mm)和兼容

后期的液质联用分析。

液相色谱分析采用 Thermo Finnigan Surveyor HPLC系统，经过色谱条件与系

统适用性试验优化后，为在分离过程获得更好的选择性、分离度、灵敏度和重复性，

最终确定采用色谱柱为 Thermo Hypersil GOLD C18(3 mm，150×2.1 mm，

i.d.，键合杂化填料)的反相柱，柱温设定为40℃;数据以3D波长采集，波长范围

在190～800 nm全波长扫描，PDA/UV检测波长为350 nm。进样方式采用自动

进样，部分定量环进样模式(Partial loop)，进样量2 μL;进样室温度4℃。

2.2.2 总离子色谱图 量取P液经0.45 um过滤器过滤其杂质，进样经HPLC分析

得出其全程谱图。经色谱指认，其中A峰为野黄芩苷，B峰为野黄芩素，C峰为黄

芩苷，D峰为黄芩素。

2.3 自由基制备

2.3.1 DPPH的制备 精确称取 0.0035 gDPPH，用无水甲醇溶解定容至50 ml容

量瓶中标为A液，储存于0～4℃冰箱中备用。

2.3.2 超氧自由基的制备 精确称取0.0100 g核黄素用70%甲醇溶解定容至10 ml

容量瓶中标为B液;取0.0250 g甲硫氨酸溶解定容于25 ml容量瓶中标为C液，

以上制备液储存于0～4℃冰箱中备用。

2.3.3 过氧自由基制备 精确称取0.3025 g卵磷脂溶于30 ml磷酸盐缓冲液中(50

mmol/L，pH =7.4)并超声，冰水浴保持2 h，标为E液;准确称取0.0148 g氯化

铁，定容至50 mL，标为F液;准确称取0.0107 g抗坏血酸，定容至50 mL，标

为H液，以上制备液储存于0～4℃冰箱中，备用。

2.3.4 羟基自由基的制备 精确称取0.0414 g水杨酸定容至50 mL，标为I液;准确

称取0.3006 g七水硫酸亚铁晶体，定容至100 mL，标为J液;精确称取0.0564 g

过氧化氢溶液，定容至50 mL，标为K液，以上制备液储存于0～4℃冰箱中备用。

2.4 自由基测定

2.4.1 DPPH清除率 实验组准确量取2.5 mLP液和2.5mLA液混匀，37℃恒温避

光孵化2 h;对照组准确量取2.5 mLP液和2.5 mL甲醇混匀，37℃恒温避光孵化2

h。

2.4.2 超氧自由基清除率 实验组准确量取2.0 mlP液、1.0 mLB液、1.0 mLC液混

匀，在254 nm和365 nm紫外灯下避光孵化2 h;对照组准确量取2.0 mlP液和

2.0 mL甲醇混匀，在254 nm和365 nm紫外灯下避光孵化2 h。

2.4.3 过氧自由基清除率 实验组准确量取1.0 mLP液、5.0 mLE液、2.0 mLF液、

1.0 mlH液混匀，37℃恒温避光孵化4 h;对照组准确量取1.0 mLP液、5.0 mL磷

酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH= 7.4)、2.0 mLF液、1.0 mlH液混匀，37℃恒温避

光孵化4 h。

2.4.4 羟基自由基清除率 实验组准确量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、

2.0 mLK液，依次加入混匀，37℃恒温避光孵化2 h。对照组准确量取5.0 mLP

液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mL去离子水依次加入混匀，37℃恒温避光孵

化2 h。自由基清除率计算公式:对于一个自由基实验体系，通过实验组和对照组对

应谱峰面积的变化，就可以利用计算公式来评价相应组分的清除自由基活性，其计

算公式如下:100%。其中PAcontrol是对照组的峰面积，PAexp是实验组的峰面

积。

2.5 色谱图中组分物质的鉴定

不同自由基评价色谱图中4种成分(野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、黄芩素)的鉴定，

是对比4种物质各自的保留时间、UV光谱数据、MS以及MS2数据，并通过对

各自物质的裂解规律讨论进行验证，并参考相关文献［4-22］。

3.1 超氧自由基的评价

图1显示，峰1表示野黄芩苷，峰2表示野黄芩素，峰3表示黄芩素，自由基色

谱数据。

3.2 羟基自由基评价

图2表2显示，4种成分(野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、黄芩素)对超氧自由基、

羟基自由基、过氧自由基具有一定的清除作用。比较而言，4种成分对3种自由基

总体效果为:过氧自由基＞羟基自由基＞超氧自由基。这种效果排序验证了前人对

黄芩提取物药理作用的研究，也验证了黄芩全草提取物在扩张血管、改善血液微循

环、提高供血水平方面的应用。

由清除超氧自由基实验组和对照组分析数据及谱图可知，经测定野黄芩苷对超氧自

由基的清除率18.98%，黄芩苷对超氧自由基的清除率1.09%，黄芩素对超氧自由

基的清除率24.38%，其他成分无表观清除作用。由野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素对

超氧自由基的清除效果可知，其各自A环上的邻羟基与其清除作用密切相关，而

野黄芩素的失效，很可能是因为野黄芩苷受到超氧自由基的影响，A环7位脱去

糖醛酸转化为野黄芩素，因而掩饰了其真实效用。汉黄芩苷、白杨素-7-葡萄糖醛

酸苷则是受到其B环上缺少羟基及其A环上缺失邻羟基的原因，因而不具备超氧

自由基的清除效果。

黄芩中4种成分对3种自由基的作用可知，针对不同自由基，它们的作用效果并

不相同。比较而言，黄芩素、野黄芩苷对超氧自由基的效果较好;黄芩苷对羟基自

由基的效果较好;野黄芩素、黄芩素对过氧自由基的效果较好;比较野黄芩苷和野黄

芩素对于过氧自由基清除作用，也验证野黄芩苷有效药理作用代谢成分为野黄芩素

的研究报道，同时本研究为黄芩抗自由基物质的前期筛选开发研究提供重要的理论

依据。

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