2024年3月21日发(作者：cancel是什么意思中文)

・１２・

国际生物制品学杂志２０１６年２月第３９卷第１期　IntJBiologicals，February２０１６，Vol．３９，No．１

・论著・

１株甲基杆菌的鉴定

曹璟　黄思佳　郭蓉　刘鹏　金文平　胡业勤　薛红刚

　　【摘要】　目的　鉴定１株在生物制品生产车间采集的菌株wh０１的种属。方法　观察该菌株的形态，

并用细菌鉴定仪进行检定。采用PCR法扩增菌株的１６SrDNA和甲醇脱氢酶大亚基的mxaF基因，用

生物信息学软件进行分析。结果　该菌株经细菌鉴定仪检定为沙门菌属，但其形态与沙门菌有很大差

别，其１６SrDNA和mxaF基因序列与甲基杆菌属序列的相似性高达９９％。结论　该菌株属于甲基杆

菌属。

【关键词】　甲基杆菌；DNA，核糖体；mxaF基因；环境污染

基金项目：“重大新药创制”科技重大专项（２０１３ZX０９４０２‐３０２）；武汉市关键技术攻关计划

（２０１４０６０２０２０１０１１６）

IdentificationofastrainofMeth

y

lobacterium　CaoJin

g

倡

，Huan

g

Si

j

ia，GuoRon

g

，LiuPen

g

，Jin

Wen

p

ing，HuYe

q

in，XueHon

gg

ang．

倡

De

p

artmento

f

BacterialVaccines，WuhanInstituteo

f

Biolo

g

icalProductsCo．，Ltd．，Wuhan４３０２０７，China

Corres

p

ondingauthor：XueHon

gg

ang，Email：２７４６２６９４５

＠

qq

．com

【Abstract】　Objective　Toidentifyabacterialstrainwh０１collectedinabiologicalproduct

instrument．The１６SrDNAandmethanoldehydrogenaselargesubunitmxaF

g

enewereamplifiedby

workshop．Methods　Thestrainwasmorphologicallyobservedandidentifiedbybacteriaidentification

identifiedasaSalmonellasp．bytheinstrument，butmorphologicallydifferentfromSalmonella．The

Conclusion　ThisstrainbelongstoMeth

y

lobacterium

g

enus．

PCRandsequenced．Sequenceswerethenanalyzedbybioinformaticssoftware．Results　Thestrainwas

sequencesimilarityofits１６SrDNAandmxaF

g

enetothatofMeth

y

lobacteriumwasashighas９９％．

【Keywords】　Meth

y

lobacterium；DNA，ribosomal；mxaF

g

ene；Environmentalpollution

andDevelopment＂（２０１３ZX０９４０２‐３０２）；ProgramforTacklingKeyProblemsinScienceandTechnology

forWuhanCityPlan（２０１４０６０２０２０１０１１６）

Fundprogram：NationalScienceandTechnologyMajorProjectsfor＂MajorNewDrugsInnovation

　　枟药品生产质量管理规范枠要求：在生产操作时，

应当进行中间控制和必要的环境监测，并予以记

［１］

录

，因此，武汉生物制品研究所有限责任公司在从

事生物制品生产过程中，对洁净车间生产环境中的

悬浮粒子、沉降菌、浮游菌、表面微生物等均进行常

规检查，并对收集的菌株进行常规鉴定。在常规检

查中，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等为常见的环境

［２］

菌株

。在某次对车间进行静态环境监测时，发现

DOI：１０．３７６０／cam．issn．１６７３‐４２１１．２０１６．０１．００３

j

．

某C级区域的个别沉降菌平皿在正常判定结果时

间后第６天有粉红色菌落，明显不同于常规环境生

长菌落，记录编号为wh０１，我们对其生物化学和遗

1　材料与方法

１．１　主要材料

GenomicDNAExtractionKitVer．２．０、

p

MD１８‐T

基因组抽提试剂盒MiniBESTBacterial

传学特性进行了分析和鉴别。

克隆载体购自宝生物（大连）工程有限公司；GoTaq

（北京）生物技术有限公司；凝胶回收试剂盒

作者单位：４３０２０７武汉生物制品研究所有限责任公司细菌类疫

苗室（曹璟、黄思佳、郭蓉、刘鹏、胡业勤、薛红刚）；４３００６０武汉市第

三医院检验科（金文平）

通信作者：薛红刚，Email：２７４６２６９４５＠

qq

．com

GreenMixDNA聚合酶购自普洛麦格（Promega）

QIAquickGelExtractionKit、质粒小提试剂盒

QIAprepSpinMiniprepKit购自德国凯杰

国际生物制品学杂志２０１６年２月第３９卷第１期　IntJBiologicals，February２０１６，Vol．３９，No．１

・１３・

（QIAGEN）公司；扩增引物购自武汉擎科创新生物

科技有限公司。

１．２　菌株的形态观察和仪器鉴定

挑取wh０１单个菌落，进行革兰染色镜检，并用

细菌鉴定仪（美国BD公司Phoenix）进行鉴定。

１．３　菌株的分子生物学鉴定

１．３．１　引物　使用扩增细菌１６SrDNA的通用引

物，序列如下：２７F：５′‐AGAGTTTGATCCTGG

CTCAG‐３′；１４９２R：TACGGYTACCTTGTTACG

ACTT。扩增甲基杆菌甲醇脱氢酶大亚基mxaF基

因的引物序列如下：F：５′‐GCGGCACCAACT

GGGGCTGGT‐３′；G：５′‐GGGCAGCATGAAGGG

CTCCC‐３′。

１．３．２　基因组DNA的提取　将上述菌落富集培

养，使用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA，保存

于２０℃冰箱备用。

１．３．３　１６SrDNA和mxaF基因的扩增　以基因

组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：

GoTaqGreenMix２５

μ

l，ddH

２

O２１

μ

l，DNA模板

２

μ

l，相应引物各１

μ

l（１０

p

mol／μl）。PCR产物经

１％凝胶电泳鉴定后，用凝胶回收试剂盒回收。回收

产物连接于

p

MD１８‐T载体，再将连接产物转化至

DH５α感受态细胞中涂板培养。挑选阳性克隆菌

落，经质粒小提试剂盒提取质粒，送武汉擎科创新生

物科技有限公司进行序列测定。

１．３．４　DNA序列的测定与分析　使用ATGC

Ver４软件包进行序列文件的剪切、拼接；使用

ClustalX１．８３进行序列比对，参数设置取默认值；

用MEGA３．１软件以邻位相连法构建基因与蛋白

的系统发育树。用于比较的其他基因序列来源于

GenBank。

2　结果

２．１　wh０１菌株的形态和仪器鉴定

wh０１菌株在营养琼脂培养基中呈粉红色，不

透明，单个菌落呈圆形，革兰染色镜检为阴性杆菌。

用细菌鉴定仪检定的结果为沙门菌属。

２．２　wh０１菌株的分子生物学分析鉴定

２．２．１　１６SrDNA比对结果　wh０１菌株经１６S

rDNA测序和BLAST比对，其１６SrDNA序列与

甲基杆菌（Meth

y

lobacterium

f

u

j

isawaense）序列的

相似性为９９％。wh０１菌株与甲基杆菌属部分菌株

的１６SrDNA系统发育树见图１。

２．２．２　mxaF基因序列比对结果　PCR扩增的

mxaF基因连接载体后测序得到５５２bp片段。在

美国国立生物技术信息中心中进行BLAST比对，

mxaF基因序列与Meth

y

lobacteriumradiotolerans

strainNBAIM‐M２有９９％的相似性。wh０１与其

他甲基杆菌株mxaF基因序列的同源性见表１。

图1　根据１６SrDNA序列构建的甲基杆菌属进化树

・１４・

国际生物制品学杂志２０１６年２月第３９卷第１期　IntJBiologicals，February２０１６，Vol．３９，No．１

表1　wh０１菌株与其他甲基杆菌株甲醇脱氢酶

大亚基mxaF基因序列的同源性比较

参考序列（序列接受号）

wh０１

相似度／％

—

９９．０

９７．１

８７．３

９５．１

Meth

y

lobacteriumradiotoleransstrain

Meth

y

lobacteriumradiotolerans（KJ４３８９３４）

Meth

y

lobacterium

p

odarium（AY４６８３６６）

Meth

y

lobacteriumor

y

zae（EF５６２４７８）

NBAIM‐M２（KJ４３８９３４．１）

的人员应增强无菌生产和风险管理的意识，从生产

车间人员、设备、物料、工艺、厂房与设施等各个方面

控制微生物负载。例如：定期对生产人员进行培训

考核，严格按规范进行更衣、清洁和消毒；加强环境

灭菌消毒的管理和监控，增加消毒频次和避免消毒

剂效力问题导致的残留污染；严格按时限要求更换

净化空调系统的高效过滤膜以及保证制药用水系统

的安全等。本次发现的甲基杆菌由于生长非常缓

慢，所以在微生物监测中不易被及时发现。针对这

Meth

y

lobacterium

f

u

j

isawaense（EF５６２４６７）９６．７

3　讨论

微生物的分类和鉴定方法较多，主要从细菌形

态与生理生物化学、蛋白质、细胞组分和核酸４个方

面来进行分类鉴定。随着仪器分析技术的进步和计

算机的广泛应用，菌种的鉴定已由传统的形态学观

察和生理生物化学实验鉴定发展到仪器自动化分析

的鉴定阶段

［３］

。武汉生物制品研究所有限责任公司

在生物制品生产C级环境中发现甲基杆菌的情况

以前未见文献报道，这可能与传统生物化学和表型

鉴定技术的局限有关。

在本次鉴定中，虽然wh０１菌株经仪器自动化

鉴定的初步结果显示为沙门菌属，但由于沙门菌属

在营养琼脂培养基中应呈无色半透明、中等大小、两

端钝圆形状，因此，wh０１菌落的颜色和形态与沙门

菌有很大差别，不过与晁红军等

［４］

和王洵

［５］

报道的

甲基杆菌却很相似。分析菌株１６SrDNA序列和

maxF基因在进化树中的位置，表明wh０１属于甲

基杆菌属。本次细菌鉴定表明，细菌自动化鉴定虽

具有快速、便捷的特点，但对于不同种类细菌鉴定准

确率有较大差异，特别是对于生长较为缓慢及生物

化学反应模式相近的细菌种类，有一定的误鉴定概

率。而１６SrDNA基因序列分析较为精准，是鉴定

革兰阴性杆菌的最有效手段

［６］

，以后可作为环境污

染菌鉴定必要的方法补充。由此建立的环境微生物

数据库能为生物制品及其他制药企业环境监测提供

全面准确的参考。

由于可以产生红色非水溶性色素，所以分泌粉

红色物质的甲基杆菌可以作为环境污染的指标

［７‐９］

。

生物制品生产的各个环节都存在微生物污染的风

险。有研究显示，细菌性微生物污染仍以人源性葡

萄球菌属细菌为主

［１０］

。为避免人源性微生物带入

药品生产车间，质量管理人员和直接从事生产操作

种情况，建议生产车间适当增加关键或核心操作区

域的动态环境监测，以降低该类型微生物的污染风

险。

参考文献

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HK

DOI

５

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ol

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mor

platforms

phaandPichia

based

p

astoris

onmethylotrophic

andondimorphic

Hansenula

Arxula

adeninivoransandYarrowiali

p

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（收稿日期：２０１５‐１１‐１１）