2024年4月11日发(作者：)

化 工 进 展

2017年第36卷第7期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS

·2601·

磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制动力学

邓杨敏，李冰麟，董文博，杨开利，张小里，赵彬侠

（西北大学化工学院，陕西 西安 710069）

摘要：对磷脂酶D（phospholipase D，PLD）在有机溶媒-水两相体系中催化磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，

PC）和乙醇胺（ethanolamine，EA）合成磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）的反应条件进行优化，

并对反应动力学机制进行了研究。确定最佳反应条件为：温度28℃，pH 5.5，底物摩尔比（EA/PC）20∶1，在

此条件下PE产率达87.2%。通过研究底物浓度对反应速率的影响，确定反应符合单底物抑制的Ping-Pang 机制。

分别以Matlab软件的Fminsearch函数与Lineweaver-Burk双倒数作图法求取动力学参数，结果基本一致，底物

乙醇胺EA的抑制常数为K

iB

=1.50mmol/L。抑制机理为两分子EA同时结合到一分子磷脂酰基-PLD中间体上，

生成磷脂酰基-PLD-(EA)

2

死端复合物，符合竞争性抑制反应动力学规律。该动力学模型预测与实验数据吻合良

好，对PLD催化合成PE反应过程的操作及反应器选型设计具有指导作用。

关键词：磷脂酰乙醇胺；磷脂酶D；磷脂酰基转移反应；动力学；底物抑制效应

中图分类号：TQ033 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2017）07–2601–06

DOI：1

0.16085/.1000-6613.

2016-2298

Synthesis of phosphatidylethanolamine by enzymatic catalysis and its

substrate inhibition kinetics

DENG Yangmin，LI Binglin，DONG Wenbo,YANG Kaili，ZHANG Xiaoli，ZHAO Binxia

（College of Chemical Engeering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China）

Abstract：Phosphatidylethanolamine（PE）was synthesized by phospholipase D（PLD）catalyzed

transphosphatidylation from phosphatidylcholine（PC）and ethanolamine（EA）in bi-phasic system. The

conditions of enzyme-catalyzed reaction were investigated，and the optimum conditions were as

follows：reaction temperature 28℃，pH 5.5，and the mole ratio of EA to PC 20∶1. The highest yield

of PE can reach 87.2%. In addition，the kinetic study indicated that phospholipids were catalyzed by

PLD in a Ping-Pang manner. The kinetic model of PLD-catalyzed reaction considering the substrate

inhibition was built，which based on the Ping-Pang Bi-Bi mechanism. The parameters of kinetic model

were determined by unconstrained nonlinear regression of the Fminsearch function in Matlab software.

It showed that the results from this method were identical with that from the double reciprocal

Lineweaver-Burk plot，the inhibition constant for substrate EA was K

iB

=1.50mmol/L. Inhibition

mechanism is a phosphatidyl-enzyme complex associating with two nucleophile molecules EA to form

phosphatidyl-PLD-(EA)

2

dead-end complex，and the inhibition mechanism complied with the

competitive inhibition of enzyme by EA during the transphosphatidylation reaction. The simulation

results were well fitted to the experimental data for different conditions. Therefore，it is speculated that

this model supports the hypothesis described above and can provide guidance for the phospholipid synthesis

收稿日期：2016-12-13；修改稿日期：2017-01-20。

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2014JM2057）。

第一作者：邓杨敏（1994—），女，硕士研究生，研究方向为催化反

应工程。联系人：张小里，教授，博士生导师，研究方向为生物催化

过程。E-mail：***************.cn。

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·2602·化 工 进 展 2017年第36卷

process and design of the devices.

Key words: phosphatidylethanolamine；phospholipase D；transphosphatidylation；kinetics；substrate

inhibition

磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）

实验结果与模型预测值进行对比，检验模型的准

又称脑磷脂，是神经细胞膜的重要组成部分，对提

确性。

高记忆力与增强大脑功能，减缓神经衰弱、动脉粥

1 实验部分

样硬化、肝硬化和脂肪性病变等具有显著功效，在

1.1 仪器与试剂

食品、药品等领域具有重要用途

[1-2]

。与传统萃取法

和化学合成法相比，酶催化转化法具有条件温和、恒温摇床（KYC100B），上海福玛实验设备有

反应速率快、选择性高、副产物少的特点，是合成限公司；分析天平（T-114），北京赛多利斯仪器系

高纯磷脂的理想途径

[3-5]

。

统有限公司；智能扫描仪（Pro 800），佳能电器有

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是具有催

限公司；薄层展开缸（PQ），上海信仪仪器有限公

化甘油磷脂分子磷酸二酯键水解活性的酶类，而一

司。磷脂酶D，由本实验室保存的链霉菌发酵制备

[9]

；乙醇胺，天津市富宇精细化工有限公司；大豆

些特殊来源的PLD具有能催化含羟基化合物受体

卵磷脂（PC含量90%），北京美亚斯磷脂技术有限

与磷脂酰基结合形成新磷脂的能力，可用于催化自

公司；PC、PE标品，美国Sigma公司；其他试剂

然界中广泛存在的磷脂酰胆碱

均为市购分析纯。

（phosphatidylcholine，PC）极性端基交换合成稀有

1.2 实验方法

磷脂

[6-7]

。国内外学者广泛关注PLD催化的磷脂酰

基转移反应。BRUZIK等

[8]

提出磷脂酰基转移反应

1.2.1 磷脂酰乙醇胺合成

的两步S

N

-2机理，形成共价键相连的磷脂酰基-酶

76mg卵磷脂溶于20mL有机溶媒乙醚（PC浓

中间体，符合乒乓动力学机制；为了增加磷脂酰基

度5mmol/L），EA溶于9mL水相（0.2mol/L乙酸缓

转移反应相对于水解反应的竞争，通常合成新磷脂

冲溶液）。二者混合后加入1mL PLD（比活力

在高羟基底物浓度下进行。PLD催化合成PE的反

8.88U/mg-蛋白质），置于200r/min恒温摇床反应，

应原理如图1所示，研究表明，PE合成中增大底物

一定时间间隔取样进行薄层色谱法分析。温度分别

乙醇胺（ethanolamine，EA）浓度，PE产率先增大

设定为20～36℃；反应初始pH分别取4.5～7.5；

后减小，呈底物抑制特征

[5]

。研究该抑制反应动力

EA浓度分别取25～250mmol/L，对应底物摩尔比

学规律，确定反应动力学模型及动力学常数，对反

为 （EA/PC）在(5～50)∶1。

应条件优化、反应器设计和放大都具有重要的参考

1.2.2 酶促反应动力学

价值。

以1.2.1节所确定的最佳反应温度、pH条件进

本文采用溶媒-水两相体系制备PE、PC溶于有

行磷脂酰基转移反应，分别在2～10mmol/L和20～

机相，PLD和EA溶于水相。在探讨温度、pH和底

150mmol/L范围内改变底物PC和EA的浓度，测

确定

物组成等反应条件影响基础上，针对底物EA抑制

定底物PC

及产物PE浓度随时间的变化关系，

一定底物浓度下的初始反应速率。

效应，建立单底物抑制乒乓动力学模型，分别以

1.2.3 酶促反应动力学模型验证

Matlab软件的非线性回归功能与Lineweaver-Burk

以1.2.1节所确定的最佳反应温度、pH条件进

双倒数作图法估算动力学参数，对比发现软件求解

行磷脂酰基转移反应，取EA浓度为25mmol/L和

方法简便快速且结果可靠。最后进行验证实验，将

图1 磷脂酶D催化合成磷脂酰乙醇胺反应原理

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第7期 邓杨敏等：磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制动力学 ·2603·

125 mmol/L，在5～25mmol/L范围内改变底物PC

浓度，分别测定对应底物浓度下的初始反应速率，

与模型数据进行比较。

1.3 酶促反应动力学参数估计

将1.2.2节所取得的反应速率与底物PC、EA

浓度实验数据，用单底物抑制乒乓机制动力学模型

进行模拟，分别以Lineweaver-Burk双倒数法和

其中双倒数

Matlab软件优化法

[10]

求取动力学参数。

法是求取酶促反应动力学参数的常用方法，成熟、

直观；Matlab法采用优化算法函数Fminsearch进行

无约束非线性回归，简便、快捷；两组结果进行对

照，确定模型参数。

1.4 磷脂分析方法

磷脂样品以薄层色谱法进行检测分析，GF

254

硅胶制成薄层板，0.5mm×100mm毛细管点样，采

用氯仿∶甲醇∶水∶浓氨水=13∶5∶0.5∶0.25

（体积比）的展开剂展开，完成后取出晾干，碘蒸

气染色。染色后用扫描仪扫描，用Photoshop和

Gel-Pro软件处理分析，获得斑点灰度值，计算出各

种磷脂浓度。

磷脂酰甘油产率定义为：（生成磷脂酰甘油的

摩尔量/初始磷脂酰胆碱的摩尔量）×100%。

以上发生较为显著的构型改变，导致酶活性降低。

28℃为磷脂酰基转移反应的最佳温度，PE最大产率

达78.7%。

2.2 pH对PE生成的影响

pH影响PLD活性中心组氨酸残基中咪唑基团

的解离程度，同时也影响底物的解离程度，从而影

响酶分子对底物分子的结合和催化

[8]

。一般酶适用

的pH范围在4～8，不宜过高也不宜过低。pH影响

PLD催化合成PE实验结果示于图3，由图可见，

当pH为4.5～5.5时，PE产率随酸度减小而增大；

但酸度进一步减小，PE产率则持续下降，尤其当介

质呈弱碱性时，产率最低，这是由于碱性条件下，

咪唑基几乎不解离，酶活性显著降低。因此最佳pH

为5.5，此时PE产率达83.86%。

2 结果与讨论

2.1 温度对PE生成的影响

一般地，在酶稳定温度范围内，升高温度可加

快反应速率，缩短反应时间；但当温度超过酶耐受

范围时，升温亦加快酶的失活速率，催化反应速率

甚至减慢。温度对PLD催化合成PE的影响如图2

所示，当温度低于28℃时，随着温度的升高，反应

速率即PE产率随之增大；而温度超过28℃时，表

示反应速率的PE产率反而降低。说明PLD在28℃

图3 pH对PE生成的影响

（5mmol/L PC，75mmol/L EA，0.2mol/L乙酸缓冲溶液，28℃）

2.3 底物摩尔比对PE生成的影响

底物摩尔比（EA/PC）对磷脂酰基转移反应的

影响如图4所示。为避免水解反应，本研究体系均

保持EA过量。由图4可知，在一定范围内PE产

率随EA比例的增加而增大，但当EA比例增大到

一定程度时，产率反而随EA比例的增加而降低。

图2 温度对PE生成的影响

[5mmol/L PC，75mmol/L EA，0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.0）]

图4 底物摩尔比对PE生成的影响

[5mmol/L PC，0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.5），28℃]

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·2604·化 工 进 展 2017年第36卷

当EA与PE产率达最大值

PC的摩尔比为20:1时，

87.2%，之后随底物摩尔比增大，PE产率则显著下

降。推测可能是由于过量EA存在时，导致两分子

亲核底物同时结合到一分子磷脂酰基-PLD中间体

上，形成磷脂酰基-PLD-(EA)

2

死端复合物，从而表

现出对反应的抑制效应。因此，EA和PC最优摩尔

比为20∶1。

3 动力学方程

3.1 酶催化动力学实验

预实验表明，摇床转速在180r/min以上时，搅

拌充分，可忽略扩散作用，本实验以转速200r/min

进行反应，因此表观速率可用来描述本征动力学规

律。固定EA的浓度，测定不同PC浓度下的初始

磷脂酰基转移反应速率，反应速率和底物浓度的双

倒数图如图5所示：随着EA浓度的增加，直线的

斜率逐渐增加，在1/v轴上的截距减小，说明此时

动力学行为符合单底物抑制的乒乓机制，这个抑制

即为乙醇胺抑制。

图5 底物浓度与反应速率关系

[0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.5），28℃]

图6 酶催化磷脂酰基转移反应机制（DAG表示甘油二酯）

3.2 酶催化动力学模型

序列研究表明，链霉菌来源PLD具有高度相似

的一级结构，酶分子含有的两个HxKxxxxD模体参

与活性中心构成，其中，H表示组氨酸，K表示赖

氨酸，D表示天冬氨酸

[11]

。酶催化反应过程如图6

所示。

过程简要描述为：①酶N端结构域中组氨酸残

基的咪唑基亲核进攻磷原子，与磷脂底物形成一个

负电荷五价磷的过渡状态，C端结构域组氨酸残基

质子化，给离去基团提供一个氢原子，释放出胆碱；

②C端结构域组氨酸与底物醇作用去质子化，活化

醇作为第二亲核体亲核进攻磷脂酰基-PLD中间体

上的磷原子；③生成产物，同时PLD恢复到最初状

符合乒乓机制。态，并继续参与到下一轮反应中

[12]

，

结合3.1节中的结果，猜测过量EA存在时可能导

致两分子亲核底物同时结合到一分子磷脂酰

基-PLD中间体上，形成磷脂酰基-PLD-(EA)

2

死端

复合物， 故在乒乓机制的基础上引入单底物EA抑

制常数k

iB

进行处理，动力学方程如式(1)所示。

v



v

max

C

A

C

B

C

C

A

C

B



K

A

C

B

(1



B

)



K

B

C

A

k

iB

(1)

式中，v为反应速率；v

max

为最大反应速率；

mA

和

K

mB

分K

C

A

和C

B

分别表示PC和EA的浓度；

别为PC和EA的结合常数；k

iB

为EA的抑制常数。

待求动力学参数包括v

max

、

K

mA

、

K

mB

和k

iB

。

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第7期 邓杨敏等：磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制动力学 ·2605·

3.3 动力学模型求解

求解动力学模型参数的传统方法为双倒数法，

本文利用Lineweaver-Burk双倒数法，将式(1)两边

取倒数，整理为式(2)。

KK

A

K

111



[1



A

]



C

B



B

vv

max

C

A

v

max

K

iB

C

A

v

max

C

B

(2)

令

y



，

x



K

A

C



v

max

K

iB

C

A

1

v

KK

11

，

A



[1



A

]

，

B



B

，

C

B

v

max

C

A

v

max

式(2)整理为式(3)。

y



A



Bx



C

x

(3)

利用Origin软件对式(3)进行非线性拟合，得到

图7所示两个拟合方程，系数A、B和C均已知，

由此建立方程组求解动力学参数v

max

、

K

mA

、

K

mB

和k

iB

，如表1所示。

这种方法成熟、直观，但推导过程繁琐，尤其

在体系较为复杂的情况下，运算量大且易出错。因

此，本文尝试用Matlab软件直接求解动力学参数，

动力学方程特点为无约束条件、非线性，可选用

Fminsearch函数进行参数求解。对于双底物酶催化

反应，方程中有两个自变量C

A

和C

B

，以

C

B

=50mmol/L时的动力学数据进行拟合，也可求得

一组参数，如表1所示。

由表1对比可见，两种方法所求参数别无二致，

使用Matlab软件求解结果准确、方便快捷，可用来

模拟PLD催化合成PE底物抑制动力学，也为其他

复杂动力学模型求解提供参考。

将所求参数代入式(1)，得酶催化反应的动力学

方程，如式(4)。

v



59.35

C

A

C

B

(4)

C

B

C

A

C

B



0.38C

B

(1



)



1.01C

A

1.50

4 动力学模型验证

改变底物PC和EA浓度进行动力学实验，验

证上述磷脂酰基转移反应底物抑制动力学模型。结

果如图8所示，实线表示模型数据，散点表示实验

数据。由图8可见，在较低PC浓度下，增加EA

浓度反应速率反而降低；而随着PC浓度增高，EA

的抑制作用减缓。证明了EA和PC分别通过增加

或减少“死端复合物”浓度而影响反应速率的机制。

模型预测与实验数据基本吻合，符合竞争性抑制反

应动力学规律。依据所得动力学模型不仅可预测

PLD催化PC制备PE反应的进程，而且可指导反

应操作方式优选及反应器设计。

5 结论

双相反应体系中，PLD催化PC磷脂酰基转移

图

7

固定磷脂酰胆碱浓度时乙醇胺浓度对速率的

Lineweaver-Burk

图

表1 动力学模型参数

参数

双倒数法

v

max

/μmol·mL·min

–1

K

mA

/mmol·L

–1

K

mB

/mmol·L

–1

k

iB

/mmol·L

–1

58.52 0.41 0.94 1.52

图

8

磷脂酰基转移反应底物抑制动力学模型的验证

[0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.5），28℃]

Matlab 59.35 0.38 1.01 1.50

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·

2606

·化

工

进

展

2017

年第

36

卷

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反应制备温度28℃、pH 5.5、

PE的最佳工艺条件为：

底物摩尔比20∶1。高底物（EA）浓度下磷脂酰基

转移反应速率出现降低趋势，其原因是EA产生底

物抑制，通过研究反应机理，建立了符合单底物抑

制乒乓机制的动力学模型；运用Matlab强大的数据

分析与处理功能求解该复杂动力学模型，求出动力

学参数，模型预测与实验数据吻合。该动力学模型

对PLD催化合成PE反应过程的操作及反应器选型

设计具有指导作用。

参考文献

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