2024年3月15日发(作者：)

·1164·

中国免疫学杂志2022年第38卷

doi：10.3969/.1000-484X.2022.10.003

基于WGCNA分析狼疮肾炎的关键基因

①

周豪坤丁兴红陈俊利

②

黄惠莲钱俊华（浙江中医药大学，杭州310053）

A文章编号1000-484X（2022）10-1164-07中图分类号

［摘

R593.24+2文献标志码

要］目的：筛选狼疮肾炎（LN）潜在的高风险致病基因及生物学过程和通路，为LN的发病机制提供理论依据。

方法：从高通量基因表达（GEO）数据库中下载GSE86425数据集，使用R语言“WGCNA”包分析正常肾脏组织和LN肾脏组织中

共表达基因的变化。使用“clusterProfiler”包对与LN高度相关的模块进行功能富集分析。利用“LIMMA”包筛选出差异表达基

因（DEGs），筛选出二者的共同致病基因并导入STRING数据库中进行蛋白-蛋白网络互作（PPI）分析，最后导入Cytoscape软件

中筛选出关键基因（Hub）。采用RT-PCR进一步验证SNF1裸鼠对照组和LN组肾脏组织中Hub基因的表达水平。结果：获得

1个与LN高度相关的模块（brown模块，Cor=0.86，P<1e-200），其主要参与T细胞活化、细胞因子产生的正向调节、细胞外基质结

构成分等。共筛选出294个DEGs，主要与白细胞迁移、中性粒细胞趋化作用、细胞因子介导的信号传导途径、对防御反应的正

向调节等生物过程等有关。并筛选出Trim30a、Cxcl10、Irf7和Stat14个Hub基因。RT-PCR证实这些基因在LN肾脏组织中显

著高于对照组肾脏组织。结论：通过多种生物信息学方法及基础实验验证获得与LN高度相关的模块和4个关键基因，为更深

入地探索LN的发生发展机制提供理论依据。

［关键词］狼疮肾炎；生物信息学；关键基因

WGCNA-basedanalysisofkeygenesinlupusnephritis

ZHOUHaokun，DINGXinghong，CHENJunli，HUANGHuilian，ngChineseMedical

University，Hangzhou310053，China

［Abstract］Objective：Toscreenpotentialhigh-riskpathogenicgenesandbiologicalprocessesandpathwaysinlupusnephritis

（LN）s：GSE86425datasetwasdownloadedfromhigh-throughputGene

ExpressionOmnibus（GEO）databaseandanalyzedforchangesinco-expressedgenesinnormalandLNkidneytissuesusingRlanguage

"WGCNA"package."clusterProfiler"packagewasthenusedtoperformfunctionalenrichmentanalysisofmodulesthatwerehighly

entiallyexpressedgenes（DEGs）werescreenedby"LIMMA"package，commonpathogenicgeneswere

screenedandimportedintoSTRINGdatabaseforprotein-proteinnetworkinteraction（PPI）analysis，andfinallykeygenes（Hub）

-PCRwasusedtofurtherverifyexpressionlevelsofHubgenesinkidneytissueofSNF1nude

P<1e-200），mainlyinvolvedinTcellactivation，positiveregulationofcytokineproductionandstructuralcomponentsofextracellular

s：OnemodulewasobtainedthatwashighlyassociatedwithLN（brownmodule，Cor=0.86，

of294DEGswerescreened，mainlyrelatedtobiologicalprocessessuchasleukocytemigration，neutrophilchemotaxis，

cytokine-mbgenesTrim30a，Cxcl10，Irf7andStat1

Conclusion：ModulesandfourHubgeneshighlyassociatedwithLNwereobtainedthroughmultiplebioinformaticsmethodsandbasic

experimentalvalidation，providingatheoreticalbasisforamorein-depthexplorationofmechanismsofLNdevelopment.

［Keywords］Lupusnephritis；Bioinformatics；Keygenes

-PCRconfirmedthatthesegenesweresignificantlyhigherinLNkidneytissuesthaninnormalkidneytissues.

SLE）是一种因免疫系统对自身抗原免疫耐受减弱

①本文受国家自然科学基金项目（81774179，81973778）资助。

②天津中医药大学，天津301617。

系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus，或消失而导致的自身免疫性疾病

［1］

。狼疮肾炎

（lupusnephritis，LN）是SLE的一种严重并发症，多

以免疫细胞和细胞因子浸润、肾小球和肾小管间质

损失为特征

［2］

。10%的患者在发病后5年内会发展

为终末期肾病（endstagerenaldisease，ESRD），需要

通过透析或肾脏移植来维持生命

［3］

。LN具有复杂

的病理过程和较长的病程。目前诊断和治疗LN的

标准并不令人满意，而且不可能准确地预测患者对

治疗的反应或个别患者的长期结果

［4］

。近年来，也

作者简介：周豪坤，男，硕士，主要从事中医药与风湿免疫方面的

研究，E-mail：com。

通信作者及指导教师：钱俊华，男，博士，教授，博士生导师，主要从

事中医药与风湿免疫方面的研究，E-mail：

qianjunhua@。

周豪坤等基于WGCNA分析狼疮肾炎的关键基因第10期

·1165·

许是因为更全面细致的狼疮管理方法，欧洲LN患

1.2加权共表达网络构建利用R语言WGCNA

者的严重程度有所下降，但在北美及我国由LN导包

［10］

构建加权共表达网络。使用pickSoftThreshold

致的ESRD发生率一直居高不下

［5］

。函数获得相邻函数加权参数的最优值，将其作为软

免疫介导的炎症反应是LN的主要启动因素

［3］

，阈值，用于后续网络构建

［11］

。然后构建加权邻接矩

但其导致ESRD的具体机制却不甚明确，目前还没阵，并基于拓扑重叠矩阵（TOM）的相异度度量

有针对LN的生物疗法。现有的有关LN临床试验的

（1-TOM）的分层聚类来构建相关基因模块

［12］

。

设计中亦存在许多未解决的问题，从而影响了对试

1.3重要模块的识别和功能分析为确定各模块

验结果的解释。因此迫切需要更有效的诊断方法，

的生物学意义，以模块特征基因（MEs）为主成分筛

识别新的生物标志物和分子机制，以便早期发现和

选基因与临床性状的潜在相关性，总结各模块基因

处理LN。

的表达模式。然后计算模块显著性（MS）与模块内

由于有效的诊断实验数量有限，一些研究通过

的平均基因显著性（GS），衡量与样本性状（包括造

高通量测序和生物信息学来研究与LN相关的基因

模时长和疾病有无）相关的模块表达模式间的相关

和/或分子特征，为识别LN相关的关键基因、网络和

性

［13］

。一般来说，模块的MS值越高则越重要

［14］

。

通路提供了策略

［6-7］

。基因表达谱作为同时检测数

使用R软件的“clusterProfiler”包

［15］

对核心模块中的

千个基因的高通量数据可对其进行分析，以筛选出

基因进行基因本体论（GO）和京都基因和基因组百

与疾病分子机制相关的显著差异表达基因（differen⁃

科全书（KEGG）途径富集分析，以确定LN的潜在发

tiallyexpressedgene，DEG）。既往的高通量测序及

病机制和生物学途径。

基因芯片研究表明DEG可通过不同信号通路、生物

1.4DEGs的鉴定与功能富集利用R语言的

过程或分子机制参与LN的发生发展

［8-9］

。然而，其

“LIMMA”软件包

［16］

设定|Log

2

FC|>1且P<0.05筛选

下游分析鲜有涉及基因间的相关性以及基因与临

LN和正常肾脏组织样本间的DEGs。使用“cluster⁃

床特征间的关系。加权基因共表达网络分析

Profiler”和“pathview”包

［17］

对差异基因进行GO功能

（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNA）

富集分析和KEGG信号通路分析。

广泛应用于描述微阵列或RNA-seq中基因表达和临

1.5LN高风险关键基因的筛选高风险差异表达

床特征之间复杂的相关性，并为疾病的诊断和治疗

基因为WGCNA筛选出的模块中的基因与DEGs中

寻找潜在的生物标志物。其通过构建基因与表型

的共同致病基因。

间的基因共表达网络，发现与临床性状高度相关的

1.6LN关键基因的筛选将筛选出的高风险

重要模块，并筛选出枢纽基因，从而对探索疾病的

DEGs导入STRING数据库构建PPI网络，使用Cyto⁃

分子机制提供思路

［10］

。与基因芯片和高通量测序

scape3.7.2

［18］

将LN高风险基因可视化，并分别使用

［19］［20］

分析相比，WGCNA适合进行多种统计学检验，通过

插件“Cytohubba”和“CytoNCA”获取关键基因。

分析基因之间的相关性，避免根据某固定阈值筛选

1.7模型制备雌性狼疮易感（SNF1）裸鼠20只，

而丢失基因的变化趋势信息。

体质量（18.0±0.7）g，购自北京维通利华实验动物

本研利用WGCNA筛选与LN高度相关的基因

有限公司并饲养于天津中医药大学实验动物中心

模块。根据关键模块和DEGs的网络拓扑综合分

［动物合格证号：SYXK（京）2016-0001］。选择体质

析，对候选基因进行筛选，以发现新的候选生物标

量相近的裸鼠用随机数字表编号后，随机均分为对

志物和治疗靶点。

照组和模型组（n=10），适应性喂养1周后开始实验。

采用单次腹腔注射0.5ml降植烷的方法构建SLE模

1材料与方法

型

［21］

。对照组以0.5ml/只单次腹腔注射PBS溶液。

每周定期观察裸鼠皮肤改变，3个月后以裸鼠皮肤

1.1数据的采集与预处理本研究通过下载GEO

出现红斑样皮损、关节肿大及类风湿关节炎症状，

数据库数据集GSE86425（包含54例LN小鼠肾脏组

血清抗dsDNA抗体、抗C1q抗体显著上升及补体

织样本和41例正常小鼠组织样本）。数据集基于

C3、C4水平下降为造模成功

［22］

。

GPL11180AffymetrixHTMG-430PMArrayPlate微

1.8LN肾脏组织总RNA提取及RT-PCR检测采

阵平台测序。应用R语言对原始数据进行消除背

用RT-PCR验证上述小鼠肾脏组织的4个Hub基因

景、标准化数据、基因注释、构建表达矩阵等预处

理。去除缺失、重复及低表达的基因探针。的表达变化。按照说明书用TRIzol试剂从肾脏组织

·1166·

中国免疫学杂志2022年第38卷

中提取总RNA，采用PrimerScriptⅡFirstStrand

cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。采取反应体系

10μl进行PCR扩增，95℃5min预变性，95℃10s，

60℃30s，45个循环。熔解曲线65~95℃。利用美

国国家生物信息中心（NCBI）Primer-BLAST设计引

物（序列见表1），由生工生物工程（上海）股份有限

公司合成，以2

−ΔΔCt

法计算相对mRNA表达量，并与

对照组（β-actinmRNA表达量）进行比较。

1.9统计学分析使用GraphPadPrism8.0进行统

计分析。对符合正态分布的两组数据进行t检验，

P<0.05表示差异有统计学意义。

LN的发生发展中起重要作用。图3显示了棕色模

块基因显著性（genesignificance，GS）和模块成员

（modulemembership，MM）相关系数为0.86（P<

1e-200），因此，brown模块被认为是与LN疾病状态

相关的重要模块。

2.3重要模块中基因的富集分析

Profiler包对brown模块中的基因进行GO和KEGG

富集分析，根据显著性程度，GO功能富集分析与

意义。GO富集分析共获得767条GO条目，结果显

示，brown模块中的蛋白主要通过T细胞活化、细胞

黏附的正向调节及细胞因子产生的正向调节等生

物过程发挥作用。在细胞构成方面主要与细胞外

KEGG通路分析均以P≤0.05表示差异具有统计学

使用cluster⁃

2

2.1

结果

共表达网络的构建从GEO数据库中下载

GSE86425的原始数据集，使用R语言对原始数据进

行背景校正及归一化等预处理，删除重复和未识别

的基因后，共得到43481个基因（图1A）。根据无尺

度拟合指数R

2

首次为0.9时确定了最佳软阈值为

β=16（图1B），此时，网络的平均连接程度相对较高，

能够包含足够的信息。将MEDissThres设置为0.5

以合并距离相近且相似的模块，设置最小模块的基

因数目为30个，剪切高度为0.25，生成86个模块

（图2）。其中red模块中有3902个基因，darkred模

块有3055个基因，blue模块有3082个基因，brown

模块有2884个基因，灰色代表未被纳入任何模块

的基因，故该模块被排除在进一步分析之外。

2.2模块间的相关性与重要模块的识别为了寻

找所有模块的共表达相似性，根据模块间的相关性

计算特征基因，与其他模块相比，brown模块与LN

的有无呈正相关［0.44（P=0.00001）］（附图1，

），提示此模块中的基因可能在

表1PCR引物序列

PCRprimersequences

F：GAAGTGTGACGTTGACATCCG

R：GCCTAGAAGCATTTGCGGTG

R：TGCTCCTCCTCTGGAATGGA

F：GGAGCTCCTGAAGGAACCTG

F：GATGACGGGCCAGTGAGAAT

R：CTCAACACGTGGGCAGGATA

F：TCCCCAGGATCATTTCTGGC

R：ACACCTTGCACTTGCCCATA

Sequences（5´-3´）Length/bp

282

216

78

439

894

Note：clusteringofGSE86425；aluescreeningin

LNco-expressionmodule.

图1样本聚类树及共表达网络的构建

Constructionofsampleclusteringtreesandco-expres⁃

sionnetworks

Fig.1

Tab.1

β-actin

Trim30a

Cxcl10

Irf7

Stat1

Primer

F：TTTGTTCCCTTTCAGACCACCT

R：AAATTCGGGGCCCACTATCC

图2

Fig.2

筛选LN的共同表达模块

Screeningco-expressionmoduleofLN

周豪坤等基于WGCNA分析狼疮肾炎的关键基因第10期

·1167·

基质和含胶原蛋白的细胞外基质有关；在分子功能

方面主要涉及肌动蛋白结合、细胞黏附分子结合及

细胞外基质结构成分等。分别从生物过程（biologi⁃

calprocesses，BP）、细胞成分（cellularcomponent，

CC）、分子功能（molecularfunction，MF）3个层面选

取P值排名前10的功能信息，结果见图4A。KEGG

通路注释分析结果显示，潜在靶点涉及319条相关

信息通路，经调研发现其中与LN密切相关的信号

通路有5条，包括细胞因子-细胞因子受体相互作

用、TNF信号通路、Th17细胞分化、Toll样受体信号

通路、NF-κB信号通路、Th1和Th2细胞分化、NOD-

类受体信号通路、T细胞受体信号通路、ECM受体相

互作用、IL-17信号通路等。图4B为P值较小的前

20条相关通路信息。

2.4LNDEGs的筛选功能富集数据集GSE78851

包括54例LN肾脏标本和41例正常小鼠肾脏标本，

用LIMMA软件包以P-value<0.05和|logFC|≥1为条

件，共筛选出294个DEGs，其中上调基因271个，下

调基因23个（图5）。对294个DEGs进行GO分析，

主要涉及白细胞迁移、中性粒细胞趋化作用、细胞

因子介导的信号传导途径、对防御反应的正向调节

等生物过程（图6）。

2.5重要模块与DEGs间关键基因的筛选如

图7A所示，将DEGs和brown模块中的基因进行映

射，获得了252个LN的相关基因，随后，将225个交

集基因导入STRING数据库构建PPI网络（图7B）。

利用Cytoscape软件的CytoHubba插件MCC算法筛选

出排名前20位的节点（图7C）。此外，采用CytoNCA

插件中的Degree算法得到排名前20位的节点

（图7D）。最终将两种算法获得的基因相互映射取

交集，确定了4个关键基因，即Hub基因：Trim30a、

Cxcl10、Irf7和Stat1（图7E）。

Note：chmentanalysisofgenesinthebrownmodule；B.

图4

KEGGenrichmentanalysisofgenesinbrownmodule.

重要模块中基因的富集分析

Fig.4Enrichmentanalysisofgenesinimportantmodules

Note：CorindicatesabsolutecorrelationcoefficientbetweenGSandMM.

图3模块成员和基因重要性之间的相关性

importance

Fig.3Correlationbetweenmodulemembershipandgene

Note：pressionvolcanomap；poftop50DEGs.

图5DEGs的筛选

Fig.5ScreeningofDEGs

·1168·

中国免疫学杂志2022年第38卷

Note：**.P<0.01vsnormalgroup.

图6

Fig.6

DEGs的GO富集分析

GOenrichmentanalysisofDEGs

图8Hub基因mRNA表达水平

mRNAexpressionlevelsofHubgenesFig.8

图7

Fig.7

Hub基因的筛选

ScreeningofHubgenes

2.6

SNF1裸鼠对照组和LN组肾脏组织中的Hub基因。

结果表明，LN小鼠肾脏Hub基因的mRNA表达水平

均显著高于正常对照组（P<0.01，图8）。

RT-PCR验证Hub基因RT-PCR分别验证

联，其筛选出的生物标志物具有高可靠性和准确

性

［24］

。对brown模块进行GO功能注释分析发现，模

块中蛋白主要富集于T细胞活化、细胞因子产生的

正向调节、细胞外基质结构成分等生物过程；关键

模块蛋白的KEGG通路分析也富集到了细胞因子-

细胞因子受体相互作用、Th17细胞分化、NF-κB信

号通路、Th1和Th2细胞分化及IL-17信号通路，揭

示机体内T细胞状态及炎症因子等免疫相关过程的

改变，可能是LN发生的重要环节。有研究表明，

CD4

+

T辅助性细胞（Th）在LN等自身免疫性疾病的

发生发展中发挥重要作用。Th1、Th17等Th细胞亚

群和Treg可通过诱导抑制其他免疫细胞增殖、分化

和活化调节相关免疫反应

［25］

。LN患者中Th1/Th2

增高，高于健康对照组和无蛋白尿的SLE患者组，在

有弥漫增殖性LN的患者中这一倾向尤为明显

［26］

。

KOMIYAMA等

［27］

认为IL-17表达量与LN的严重程

度密切相关，在LN患者肾小球和肾间质浸润T细胞

3讨论

LN是SLE最常见的表现之一，直接影响SLE的

预后，约40%的SLE患者伴有LN

［2］

。LN的病情活动

及治疗效果可能会影响其预后

［23］

，因此早期对LN

患者病情进行准确地诊断及评估，有助于指导其临

床治疗，提高治疗效果。本研究采用生物信息学方

法，从LN和正常肾脏组织中获取LN的生物标志物

及其病理过程。利用WGCNA分析GSE86425数据

集，以探索与LN临床特征相关的重要模块，结果获

得86个模块，其中LN与brown模块的相关性最为显

著。与其他生物信息学分析相比，WGCNA可全面

系统地计算出共表达模块与疾病临床特征间的关

周豪坤等基于WGCNA分析狼疮肾炎的关键基因第10期

·1169·

中可检测出大量IL-17

［28］

。IL-17可通过刺激上皮细

胞和成纤维细胞分泌趋化因子或炎症介质，导致炎

症细胞浸润，从而参与LN的发生发展

［29］

。基于此，

T细胞水平及炎症因子可能为LN的治疗提供潜在

靶点。

抗体、LN的活动性评分呈现明显的正相关，而与血

清C3、Ccr呈负相关。以上均提示Irf7分子可能是

LN发病的关键。Stat1是信号转导子和转录激活因

质，活化后的Stat1参与调控细胞的分化和凋亡

等

［42-43］

。研究人员用LN患者的血清分别刺激人肾

小球系膜细胞和人肾小球内皮细胞，模拟LN体内

环境，发现IL-10及TNF-α等炎症因子表达增高，表

明Stat1与LN肾脏细胞释放促炎症因子的相关过程

有关

［44-45］

。此外，临床研究也提示，LN患者体内T细

胞中Stat1表达水平为单纯SLE患者的2.04倍，患者

肾小管上皮细胞及肾小球中Stat1表达水平越高，预

后则越差

［46-47］

。

综上所述，本文利用WGCNA、差异分析等多种

生物信息学方法探讨了LN可能的发病机制，富集

到多个有意义的生物学过程和通路。其中，T细胞

活化、细胞因子产生的正向调节及白细胞迁移等过

程的改变可能是LN发生的重要环节。筛选出的

4个Hub基因虽经过基础实验验证，但样本量较小，

后续仍需大样本进行进一步研究，以筛选出灵敏性

和特异性高的诊断标志物，为LN的早期诊断和靶

向药物研究提供重要参考。

子（Stat）家族成员，常以非活性的形式存在于细胞

此外，对LN和正常肾脏组织进行基因差异表

达分析，筛选出294个DEGs。基于GO富集分析，发

现DEGs参与白细胞迁移、中性粒细胞趋化作用、细

胞因子介导的信号传导途径等。值得注意的是，白

细胞表面标志物整合素Mac-1和CD16b被认为与

（CD11b）与一个共同的β2亚单位复合，在包括LN

在内的炎症条件下与CD16b一起从特定的白细胞

亚群中释放出来

［31］

。KITAGAWA等

［32］

发现体液中

的CD11b可能通过调节肾小球白细胞的积聚而参

与LN的病理进展。

DEGs的综合分析，确定了Trim30a、Cxcl10、Irf7和

通过对WGCNA重要模块的网络拓扑分析和

LN的发病有关

［30］

。Mac-1包括一个独特的α亚单位

Stat14个Hub基因，并通过RT-PCR验证。Trim30a

隶属于TRIM蛋白家族，是一种来自辅助性和诱导

性T细胞的胞内蛋白，在免疫应答、代谢调控等方面

均发挥重要作用，能够调节特殊细胞因子的核酸表

达

［33-34］

。LN患者体内免疫信号过度激活引发持续

性炎症反应，损害宿主细胞。而Trim30等天然免疫

应答分子可通过相应的负反馈调节因子严格控制

相关免疫通路的激活，进而保护机体不受损伤

［35］

。

有研究人员发现Trim30a可通过减少体内ROS的产

生控制NLRP3受体的激活，使Caspase-1和IL-1β减

少，避免LN等疾病导致的过度的炎症反应给机体

带来伤害

［36］

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+

的T细胞、巨噬细胞及自

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相关炎症反应

［37］

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中CXCL10表达升高，促进病变进展。干扰素调

控基因7（Irf7）是通路的转录调节因子，是Ⅰ-IFN通

路的主要调控者。研究表明干扰素刺激基因及趋

化因子的表达水平在LN患者机体内显著升高，并

且与肾炎活动性呈正相关

［39］

。肾脏的表达谱芯片

亦提示LN的肾脏组织中免疫细胞的活化等多条通

路上调，包括Irf7的表达水平较正常肾脏及单纯

SLE肾脏组织显著增高

［40］

。陈洁

［41］

发现Irf7在LN

的肾小球表达积分与SLE疾病的活动度、抗ds-DNA

患者肾中的蛋白水平和mRNA水平均有高表达，Irf7

·1170·

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（编辑陈阳）

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