2024年3月5日发(作者:)
烟粉虱MEAM1隐种主要内共生菌的定位和分布
作者:陈吉强 张毅波 张桂芬
来源:《植物保护》2020年第02期
摘要 烟粉虱MEAM 1隐种是一种重要的世界性入侵害虫,共生菌在其种群入侵和扩张中起着不可忽视的作用。本研究采用荧光原位杂交技术(FISH),明确其携带的初生共生菌(Candidatus Portiera aleyrodidarum)和次生共生菌(Candidatus Hamiltonella defensa和Rickettsia sp.)在不同发育阶段虫体中的定位和分布。结果显示,烟粉虱MEAM 1隐种卵、若虫和成虫3个阶段均携带3种共生菌,Portiera和Hamiltonella菌集中分布于含菌细胞中,其中Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边;Rickettsia既在菌胞中呈“集中”分布,也“随机”分布于
虫体其他部位或器官。上述结果明确了这3种共生菌在MEAM 1烟粉虱各个发育阶段的分布特征,同时证明3种共生菌均能通过烟粉虱雌虫垂直传播,为进一步揭示内共生菌在烟粉虱入侵过程中的作用打下基础。
关键词 烟粉虱; 共生菌; 荧光原位杂交; 垂直传播
中图分类号: S 433.3 文献标识码: A DOI: 10.16688/.2019072
Abstract Bemisia tabaci (Gennadius) MEAM 1 is one of the most devastating invasive pests
worldwide and its endosymbionts play an important role in the invasion and expansion of this pest
insect. In this study, the fluorescence in situ hybridization (FISH) was used to identify the
localization and distribution of the primary endosymbiont (Candidatus Portiera aleyrodidarum) and
the secondary endosymbionts (Candidatus Hamiltonella defensa and Rickettsia sp.) in different
developmental stages of MEAM 1. Three symbiotic bacteria were found in the eggs,nymphs,and adults of MEAM 1. Among them, Portiera and Hamiltonella were located
inside the bacteriocytes and Hamiltonella around the bacteriocyte. Rickettsia was located both inside
the bacteriocyte and randomly distributed in other parts or organs. These results revealed the
distribution characteristics of the three endosymbionts in different developmental stages of
MEAM 1, and provided evidence that all the three endosymbionts are vertically transmitted through
the female of , and thus lay a foundation for further understanding the roles of
endosymbionts in the invasion of .
Key words Bemisia tabaci; endosymbionts; fluorescence in situ hybridization; vertically
transmitted
煙粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)属半翅目Hemiptera,粉虱科Aleyrodidae,是一种典型高度多食性的取食植物韧皮部汁液的世界性入侵害虫。烟粉虱通过直接取食为害植物每年可导致数亿美元的经济损失,还可传播100多种植物病毒及分泌蜜露污染植物[1-4]。烟粉虱被认为是一个独特的,由超过35种形态上难以区分的隐种组成的复合种[5-9]。烟粉虱隐种以前被称为生物型,其中在我国分布最广泛的入侵种是B型和Q型,而B型也被称为“中东-小亚细亚1”隐种(MEAM 1)或者Bemisia argentifolii,Q型也被称为“地中海”隐种(MED)[10]。在过去的30年里,这两个隐种在世界范围造成了巨大的农业损失[11-12]。
烟粉虱MEAM 1隐种在20世纪90年代中期传入我国,并且很快取代了中国本地种,而MED隐种于2003年第一次在我国云南昆明的观赏性植物一品红上被检测到[13]。之后,MED隐种在许多省市和区域逐渐取代了MEAM 1隐种。从2008年起,在我国大部分地区的烟粉虱种群变成了以MED隐种为主[14-15];而烟粉虱MEAM 1隐种主要分布于我国长江以南和西南沿海地区,包括广东、福建、浙江等省份,另外新疆、甘肃和辽宁等地区也零星分布[4]。MEAM 1隐种具有较高的入侵能力和竞争力,MED隐种的入侵性较差,但其具有较强的抗药性[16-18]。有研究表明双重感染Rickettsia-Arsenophonus菌或Wolbachia-Arsenophonus菌的
MED烟粉虱对啶虫脒、噻虫嗪、吡虫啉和螺甲螨酯的抗药性较高[19]。这可能是MED隐种取代MEAM 1隐种成为我国主要入侵烟粉虱的原因之一。近年来,也有研究者认为,共生菌在烟粉虱种群扩散和入侵方面发挥了重要作用,因此,可把内共生菌作为对象来研究其对烟粉虱不同隐种的生物学特性、入侵能力及隐种间取代的影响[20-21]。
烟粉虱体内的共生菌分为初生内共生菌和次生内共生菌。初生内共生菌为“Candidatus
Portiera aleyrodidarum”,能够为其提供维持生命所需的必需氨基酸和类胡萝卜素来弥补取食韧皮部汁液所缺乏的营养[22-24]。此外,不同烟粉虱隐种通常还含有不同的次生内共生菌,因此,烟粉虱复合种中可能含有一种或多种次生内共生菌,目前已在烟粉虱复合种中发现了7属/种次生内共生菌,分别命名为Candidatus Hamiltonella defensa、Candidatus Wolbachia spp.、Arsenophonus spp.、Candidatus Cardinium hertigii、Candidatus Fritschea bemisiae、Rickettsia sp.和Candidatus Hemipteriphilus asiaticus[25-29]。目前对烟粉虱次生内共生菌的研究主要集中在其传播方式、分布形式以及功能上[20,25,30-34]。烟粉虱次生内共生菌的功能主要表现在提高烟粉虱的适合度(包括产卵量、存活率和性比偏雌性)[32-33]、高温耐受性和提高番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的传播速率[34]以及增加烟粉虱的抗药性[35]等方面。烟粉虱次生内共生菌是一个复杂的群体,其可随物种、寄主植物和地理分布的不同而变化[32]。例如,以色列的MEAM 1隐种携带有Hamiltonella和Rickettsia菌,而MED隐种则携带Rickettsia、Wolbachia和Arsenophonus菌,但Cardinium和Fritschea菌在這两个隐种中均未检测到,并且鼠尾草上的MED隐种中Rickettsia和Arsenophonus菌的感染率显著高于其他寄主植物上的MED隐种[36]。在我国,除了Fritschea菌外,Wolbachia、Rickettsia、Hamiltonella、Cardinium和Arsenophonus菌在MEAM 1和MED隐种中均能检测到,其中Hamiltonella菌在两个种群中的感染率均最高,Arsenophonus却相反,并且Wolbachia、Rickettsia和Hamiltonella的感染率在MEAM 1中显著高于MED隐种,而在MEAM 1中,Cardinium的感染率却显著低于MED隐种[21]。
目前,针对我国烟粉虱MEAM1隐种体内主要共生菌的定位和分布还不是很清楚。本研究选取我国境内的烟粉虱MEAM 1隐种为对象,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ
hybridization,简称FISH技术),明确烟粉虱MEAM1隐种体内3种主要内共生菌Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的具体定位和分布,研究结果将为进一步揭示内共生菌对烟粉虱生活史和入侵能力的影响打下基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
试验使用的原始种群于2017年采自中国甘肃酒泉。参照罗晨等[37]的方法,采用分子方法对种群进行鉴定,确定为MEAM 1隐种,同时建立室内种群。
1.2 供试植物
寄主植物为棉花Gossypium spp.,品种为‘创优棉168’。将种子播种至塑料花盆中,每盆3粒,并置于大型养虫笼中,保证寄主植物的清洁。培养条件:28℃±2℃,相对湿度:70%~80%。待棉花长出4~6片叶时供试。
1.3 试验方法
1.3.1 探针的制备
本试验所使用的不同共生菌的探针序列如下:初生内共生菌Portiera:5′-Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3′,次生内共生菌Rickettsia:5′-Cy5-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3′,Hamiltonella:5′- Cy5-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3′[38],探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 各阶段虫态的收集
在显微镜下用解剖针分别挑取卵、不同龄期若虫100头,用吸虫管取成虫若干头,置于1.5 mL的离心管中,3个重复。卵从卵柄部位进行挑取,其他龄期若虫从虫体一侧进行挑取。
1.3.3 原位杂交
首先将收集的样本分别置于适量Carnoy固定液中过夜处理,然后弃掉固定液;用50%乙醇漂洗3次;加入200 μL Triton X-100(细胞渗透液),金属浴35℃,30 min,然后弃掉细胞渗透液;加入400 μL蛋白酶K,金属浴56℃,30 min,然后弃掉蛋白酶K;加入适量的Carnoy固定液固定过夜,弃掉后加入200 μL含有6% H2O2的乙醇溶液4℃过夜处理;用杂交缓冲液洗涤3次,加入100 μL杂交缓冲液和50 μL 10 pmol/mL荧光探针,金属浴60℃,避光处理24 h;杂交缓冲液洗涤2次。
采用LSM T-PMT Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微880观察拍照,Carl Zeiss蔡司照片处理软件ZEN 2012对照片进行处理。
2 结果与分析
2.1 烟粉虱MEAM 1隐种中Portiera和Hamiltonella的定位 经FISH检测Portiera和Hamiltonella在烟粉虱MEAM 1隐种卵(图1)、若虫(图2)和成虫(图3)3个阶段均有分布,且两种共生菌均“集中”分布于含菌细胞内,其中Portiera聚集分布于含菌细胞的中心部位,Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边。
2.2 烟粉虱MEAM1隐种携带Portiera和Rickettsia的定位 经FISH检测发现Portiera和Rickettsia在烟粉虱MEAM 1隐种各虫态均有分布,初生内共生菌Portiera“集中”分布于含菌细胞内,次生内共生菌Rickettsia分布在含菌细胞内,也“随机”分布于虫体其他部位或器官的两种分布类型(图4~6)。
烟粉虱体内的共生菌分为初生内共生菌和次生内共生菌。初生内共生菌为“Candidatus
Portiera aleyrodidarum”,能够为其提供维持生命所需的必需氨基酸和类胡萝卜素来弥补取食韧皮部汁液所缺乏的营养[22-24]。此外,不同烟粉虱隐种通常还含有不同的次生内共生菌,因此,烟粉虱复合种中可能含有一种或多种次生内共生菌,目前已在烟粉虱复合种中发现了7属/种次生内共生菌,分别命名为Candidatus Hamiltonella defensa、Candidatus Wolbachia spp.、Arsenophonus spp.、Candidatus Cardinium hertigii、Candidatus Fritschea bemisiae、Rickettsia sp.和Candidatus Hemipteriphilus asiaticus[25-29]。目前对烟粉虱次生内共生菌的研究主要集中在其传播方式、分布形式以及功能上[20,25,30-34]。烟粉虱次生内共生菌的功能主要表现在提高烟粉虱的适合度(包括产卵量、存活率和性比偏雌性)[32-33]、高温耐受性和提高番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的传播速率[34]以及增加烟粉虱的抗药性[35]等方面。烟粉虱次生内共生菌是一个复杂的群体,其可随物种、寄主植物和地理分布的不同而变化[32]。例如,以色列的MEAM 1隐种携带有Hamiltonella和Rickettsia菌,而MED隐种则携带Rickettsia、Wolbachia和Arsenophonus菌,但Cardinium和Fritschea菌在这两个隐种中均未检测到,并且鼠尾草上的MED隐种中Rickettsia和Arsenophonus菌的感染率显著高于其他寄主植物上的MED隐种[36]。在我国,除了Fritschea菌外,Wolbachia、Rickettsia、Hamiltonella、Cardinium和Arsenophonus菌在MEAM 1和MED隐种中均能检测到,其中Hamiltonella菌在两个种群中的感染率均最高,Arsenophonus却相反,并且Wolbachia、Rickettsia和Hamiltonella的感染率在MEAM 1中显著高于MED隐种,而在MEAM 1中,Cardinium的感染率却显著低于MED隐种[21]。
目前,针对我国烟粉虱MEAM1隐种体内主要共生菌的定位和分布还不是很清楚。本研究选取我国境内的烟粉虱MEAM 1隐种为对象,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ
hybridization,简称FISH技术),明确烟粉虱MEAM1隐种体内3种主要内共生菌Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的具体定位和分布,研究结果将为进一步揭示内共生菌对烟粉虱生活史和入侵能力的影响打下基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
试验使用的原始种群于2017年采自中国甘肃酒泉。参照罗晨等[37]的方法,采用分子方法对种群进行鉴定,确定为MEAM 1隐种,同时建立室内种群。
1.2 供试植物
寄主植物为棉花Gossypium spp.,品种为‘创优棉168’。将种子播种至塑料花盆中,每盆3粒,并置于大型养虫笼中,保证寄主植物的清潔。培养条件:28℃±2℃,相对湿度:70%~80%。待棉花长出4~6片叶时供试。
1.3 试验方法
1.3.1 探针的制备
本试验所使用的不同共生菌的探针序列如下:初生内共生菌Portiera:5′-Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3′,次生内共生菌Rickettsia:5′-Cy5-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3′,Hamiltonella:5′- Cy5-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3′[38],探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 各阶段虫态的收集
在显微镜下用解剖针分别挑取卵、不同龄期若虫100头,用吸虫管取成虫若干头,置于1.5 mL的离心管中,3个重复。卵从卵柄部位进行挑取,其他龄期若虫从虫体一侧进行挑取。
1.3.3 原位杂交
首先将收集的样本分别置于适量Carnoy固定液中过夜处理,然后弃掉固定液;用50%乙醇漂洗3次;加入200 μL Triton X-100(细胞渗透液),金属浴35℃,30 min,然后弃掉细胞渗透液;加入400 μL蛋白酶K,金属浴56℃,30 min,然后弃掉蛋白酶K;加入适量的Carnoy固定液固定过夜,弃掉后加入200 μL含有6% H2O2的乙醇溶液4℃过夜处理;用杂交缓冲液洗涤3次,加入100 μL杂交缓冲液和50 μL 10 pmol/mL荧光探针,金属浴60℃,避光处理24 h;杂交缓冲液洗涤2次。
采用LSM T-PMT Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微880观察拍照,Carl Zeiss蔡司照片处理软件ZEN 2012对照片进行处理。
2 结果与分析
2.1 烟粉虱MEAM 1隐种中Portiera和Hamiltonella的定位 经FISH检测Portiera和Hamiltonella在烟粉虱MEAM 1隐种卵(图1)、若虫(图2)和成虫(图3)3个阶段均有分布,且两种共生菌均“集中”分布于含菌细胞内,其中Portiera聚集分布于含菌细胞的中心部位,Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边。
2.2 烟粉虱MEAM1隐种携带Portiera和Rickettsia的定位 经FISH检测发现Portiera和Rickettsia在烟粉虱MEAM 1隐种各虫态均有分布,初生内共生菌Portiera“集中”分布于含菌细胞内,次生内共生菌Rickettsia分布在含菌细胞内,也“随机”分布于虫体其他部位或器官的两种分布类型(图4~6)。
烟粉虱体内的共生菌分为初生内共生菌和次生内共生菌。初生内共生菌为“Candidatus
Portiera aleyrodidarum”,能够为其提供维持生命所需的必需氨基酸和类胡萝卜素来弥补取食韧皮部汁液所缺乏的营养[22-24]。此外,不同烟粉虱隐种通常还含有不同的次生内共生菌,因此,烟粉虱复合种中可能含有一种或多种次生内共生菌,目前已在烟粉虱复合种中发现了7属/种次生内共生菌,分别命名为Candidatus Hamiltonella defensa、Candidatus Wolbachia spp.、Arsenophonus spp.、Candidatus Cardinium hertigii、Candidatus Fritschea bemisiae、Rickettsia sp.和Candidatus Hemipteriphilus asiaticus[25-29]。目前对烟粉虱次生内共生菌的研究主要集中在其传播方式、分布形式以及功能上[20,25,30-34]。烟粉虱次生内共生菌的功能主要表现在提高烟粉虱的适合度(包括产卵量、存活率和性比偏雌性)[32-33]、高温耐受性和提高番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的传播速率[34]以及增加烟粉虱的抗药性[35]等方面。烟粉虱次生内共生菌是一个复杂的群体,其可随物种、寄主植物和地理分布的不同而变化[32]。例如,以色列的MEAM 1隐种携带有Hamiltonella和Rickettsia菌,而MED隐种则携带Rickettsia、Wolbachia和Arsenophonus菌,但Cardinium和Fritschea菌在这两个隐种中均未检测到,并且鼠尾草上的MED隐种中Rickettsia和Arsenophonus菌的感染率显著高于其他寄主植物上的MED隐种[36]。在我国,除了Fritschea菌外,Wolbachia、Rickettsia、Hamiltonella、Cardinium和Arsenophonus菌在MEAM 1和MED隱种中均能检测到,其中Hamiltonella菌在两个种群中的感染率均最高,Arsenophonus却相反,并且Wolbachia、Rickettsia和Hamiltonella的感染率在MEAM 1中显著高于MED隐种,而在MEAM 1中,Cardinium的感染率却显著低于MED隐种[21]。
目前,针对我国烟粉虱MEAM1隐种体内主要共生菌的定位和分布还不是很清楚。本研究选取我国境内的烟粉虱MEAM 1隐种为对象,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ
hybridization,简称FISH技术),明确烟粉虱MEAM1隐种体内3种主要内共生菌Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的具体定位和分布,研究结果将为进一步揭示内共生菌对烟粉虱生活史和入侵能力的影响打下基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
试验使用的原始种群于2017年采自中国甘肃酒泉。参照罗晨等[37]的方法,采用分子方法对种群进行鉴定,确定为MEAM 1隐种,同时建立室内种群。
1.2 供试植物
寄主植物为棉花Gossypium spp.,品种为‘创优棉168’。将种子播种至塑料花盆中,每盆3粒,并置于大型养虫笼中,保证寄主植物的清洁。培养条件:28℃±2℃,相对湿度:70%~80%。待棉花长出4~6片叶时供试。
1.3 试验方法
1.3.1 探针的制备
本试验所使用的不同共生菌的探针序列如下:初生内共生菌Portiera:5′-Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3′,次生内共生菌Rickettsia:5′-Cy5-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3′,Hamiltonella:5′- Cy5-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3′[38],探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 各阶段虫态的收集
在显微镜下用解剖针分别挑取卵、不同龄期若虫100头,用吸虫管取成虫若干头,置于1.5 mL的离心管中,3个重复。卵从卵柄部位进行挑取,其他龄期若虫从虫体一侧进行挑取。
1.3.3 原位杂交
首先将收集的样本分别置于适量Carnoy固定液中过夜处理,然后弃掉固定液;用50%乙醇漂洗3次;加入200 μL Triton X-100(细胞渗透液),金属浴35℃,30 min,然后弃掉细胞渗透液;加入400 μL蛋白酶K,金属浴56℃,30 min,然后弃掉蛋白酶K;加入适量的Carnoy固定液固定过夜,弃掉后加入200 μL含有6% H2O2的乙醇溶液4℃过夜处理;用杂交缓冲液洗涤3次,加入100 μL杂交缓冲液和50 μL 10 pmol/mL荧光探针,金属浴60℃,避光处理24 h;杂交缓冲液洗涤2次。
采用LSM T-PMT Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微880观察拍照,Carl Zeiss蔡司照片处理软件ZEN 2012对照片进行处理。
2 结果与分析
2.1 烟粉虱MEAM 1隐种中Portiera和Hamiltonella的定位 经FISH检测Portiera和Hamiltonella在烟粉虱MEAM 1隐种卵(图1)、若虫(图2)和成虫(图3)3个阶段均有分布,且两种共生菌均“集中”分布于含菌细胞内,其中Portiera聚集分布于含菌细胞的中心部位,Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边。
2.2 烟粉虱MEAM1隐种携带Portiera和Rickettsia的定位 经FISH检测发现Portiera和Rickettsia在烟粉虱MEAM 1隐种各虫态均有分布,初生内共生菌Portiera“集中”分布于含菌细胞内,次生内共生菌Rickettsia分布在含菌细胞内,也“随机”分布于虫体其他部位或器官的两种分布类型(图4~6)。
烟粉虱体内的共生菌分为初生内共生菌和次生内共生菌。初生内共生菌为“Candidatus
Portiera aleyrodidarum”,能够为其提供维持生命所需的必需氨基酸和类胡萝卜素来弥补取食韧皮部汁液所缺乏的营养[22-24]。此外,不同烟粉虱隐种通常还含有不同的次生内共生菌,因此,烟粉虱复合种中可能含有一种或多种次生内共生菌,目前已在烟粉虱复合种中发现了7属/种次生内共生菌,分别命名为Candidatus Hamiltonella defensa、Candidatus Wolbachia spp.、Arsenophonus spp.、Candidatus Cardinium hertigii、Candidatus Fritschea bemisiae、Rickettsia sp.和Candidatus Hemipteriphilus asiaticus[25-29]。目前对烟粉虱次生内共生菌的研究主要集中在其传播方式、分布形式以及功能上[20,25,30-34]。烟粉虱次生内共生菌的功能主要表现在提高烟粉虱的适合度(包括产卵量、存活率和性比偏雌性)[32-33]、高温耐受性和提高番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的传播速率[34]以及增加烟粉虱的抗药性[35]等方面。烟粉虱次生内共生菌是一个复杂的群体,其可随物种、寄主植物和地理分布的不同而变化[32]。例如,以色列的MEAM 1隐种携带有Hamiltonella和Rickettsia菌,而MED隐种则携带Rickettsia、Wolbachia和Arsenophonus菌,但Cardinium和Fritschea菌在这两个隐种中均未检测到,并且鼠尾草上的MED隐种中Rickettsia和Arsenophonus菌的感染率显著高于其他寄主植物上的MED隐种[36]。在我国,除了Fritschea菌外,Wolbachia、Rickettsia、Hamiltonella、Cardinium和Arsenophonus菌在MEAM 1和MED隐种中均能检测到,其中Hamiltonella菌在两个种群中的感染率均最高,Arsenophonus却相反,并且Wolbachia、Rickettsia和Hamiltonella的感染率在MEAM 1中显著高于MED隐种,而在MEAM 1中,Cardinium的感染率却显著低于MED隐种[21]。
目前,针对我国烟粉虱MEAM1隐种体内主要共生菌的定位和分布还不是很清楚。本研究选取我国境内的烟粉虱MEAM 1隐种为对象,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ
hybridization,简称FISH技术),明确烟粉虱MEAM1隐种体内3种主要内共生菌Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的具体定位和分布,研究结果将为进一步揭示内共生菌对烟粉虱生活史和入侵能力的影响打下基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
试验使用的原始种群于2017年采自中国甘肃酒泉。参照罗晨等[37]的方法,采用分子方法对种群进行鉴定,确定为MEAM 1隐种,同时建立室内种群。
1.2 供试植物
寄主植物为棉花Gossypium spp.,品种为‘创优棉168’。将种子播种至塑料花盆中,每盆3粒,并置于大型养虫笼中,保证寄主植物的清洁。培养条件:28℃±2℃,相对湿度:70%~80%。待棉花长出4~6片叶时供试。
1.3 试验方法
1.3.1 探针的制备
本试验所使用的不同共生菌的探针序列如下:初生内共生菌Portiera:5′-Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3′,次生内共生菌Rickettsia:5′-Cy5-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3′,Hamiltonella:5′- Cy5-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3′[38],探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 各阶段虫态的收集
在显微镜下用解剖针分别挑取卵、不同龄期若虫100头,用吸虫管取成虫若干头,置于1.5 mL的离心管中,3个重复。卵从卵柄部位进行挑取,其他龄期若虫从虫体一侧进行挑取。
1.3.3 原位杂交
首先将收集的样本分别置于适量Carnoy固定液中过夜处理,然后弃掉固定液;用50%乙醇漂洗3次;加入200 μL Triton X-100(细胞渗透液),金属浴35℃,30 min,然后弃掉细胞渗透液;加入400 μL蛋白酶K,金属浴56℃,30 min,然后弃掉蛋白酶K;加入适量的Carnoy固定液固定过夜,弃掉后加入200 μL含有6% H2O2的乙醇溶液4℃过夜处理;用杂交缓冲液洗涤3次,加入100 μL杂交缓冲液和50 μL 10 pmol/mL荧光探针,金属浴60℃,避光处理24 h;杂交缓冲液洗涤2次。
采用LSM T-PMT Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微880观察拍照,Carl Zeiss蔡司照片处理软件ZEN 2012对照片进行处理。
2 结果与分析
2.1 烟粉虱MEAM 1隐种中Portiera和Hamiltonella的定位 经FISH检测Portiera和Hamiltonella在烟粉虱MEAM 1隐种卵(图1)、若蟲(图2)和成虫(图3)3个阶段均有分布,且两种共生菌均“集中”分布于含菌细胞内,其中Portiera聚集分布于含菌细胞的中心部位,Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边。
2.2 烟粉虱MEAM1隐种携带Portiera和Rickettsia的定位 经FISH检测发现Portiera和Rickettsia在烟粉虱MEAM 1隐种各虫态均有分布,初生内共生菌Portiera“集中”分布于含菌细胞内,次生内共生菌Rickettsia分布在含菌细胞内,也“随机”分布于虫体其他部位或器官的两种分布类型(图4~6)。
烟粉虱体内的共生菌分为初生内共生菌和次生内共生菌。初生内共生菌为“Candidatus
Portiera aleyrodidarum”,能够为其提供维持生命所需的必需氨基酸和类胡萝卜素来弥补取食韧皮部汁液所缺乏的营养[22-24]。此外,不同烟粉虱隐种通常还含有不同的次生内共生菌,因此,烟粉虱复合种中可能含有一种或多种次生内共生菌,目前已在烟粉虱复合种中发现了7属/种次生内共生菌,分别命名为Candidatus Hamiltonella defensa、Candidatus Wolbachia spp.、Arsenophonus spp.、Candidatus Cardinium hertigii、Candidatus Fritschea bemisiae、Rickettsia sp.和Candidatus Hemipteriphilus asiaticus[25-29]。目前对烟粉虱次生内共生菌的研究主要集中在其传播方式、分布形式以及功能上[20,25,30-34]。烟粉虱次生内共生菌的功能主要表现在提高烟粉虱的适合度(包括产卵量、存活率和性比偏雌性)[32-33]、高温耐受性和提高番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的传播速率[34]以及增加烟粉虱的抗药性[35]等方面。烟粉虱次生内共生菌是一个复杂的群体,其可随物种、寄主植物和地理分布的不同而变化[32]。例如,以色列的MEAM 1隐种携带有Hamiltonella和Rickettsia菌,而MED隐种则携带Rickettsia、Wolbachia和Arsenophonus菌,但Cardinium和Fritschea菌在这两个隐种中均未检测到,并且鼠尾草上的MED隐种中Rickettsia和Arsenophonus菌的感染率显著高于其他寄主植物上的MED隐种[36]。在我国,除了Fritschea菌外,Wolbachia、Rickettsia、Hamiltonella、Cardinium和Arsenophonus菌在MEAM 1和MED隐种中均能检测到,其中Hamiltonella菌在两个种群中的感染率均最高,Arsenophonus却相反,并且Wolbachia、Rickettsia和Hamiltonella的感染率在MEAM 1中显著高于MED隐种,而在MEAM 1中,Cardinium的感染率却显著低于MED隐种[21]。
目前,针对我国烟粉虱MEAM1隐种体内主要共生菌的定位和分布还不是很清楚。本研究选取我国境内的烟粉虱MEAM 1隐种为对象,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ
hybridization,简称FISH技术),明确烟粉虱MEAM1隐种体内3种主要内共生菌Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的具体定位和分布,研究结果将为进一步揭示内共生菌对烟粉虱生活史和入侵能力的影响打下基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
试验使用的原始种群于2017年采自中国甘肃酒泉。参照罗晨等[37]的方法,采用分子方法对种群进行鉴定,确定为MEAM 1隐种,同时建立室内种群。
1.2 供试植物
寄主植物为棉花Gossypium spp.,品种为‘创优棉168’。将种子播种至塑料花盆中,每盆3粒,并置于大型养虫笼中,保证寄主植物的清洁。培养条件:28℃±2℃,相对湿度:70%~80%。待棉花长出4~6片叶时供试。
1.3 试验方法
1.3.1 探针的制备
本试验所使用的不同共生菌的探针序列如下:初生内共生菌Portiera:5′-Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3′,次生内共生菌Rickettsia:5′-Cy5-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3′,Hamiltonella:5′- Cy5-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3′[38],探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.2 各阶段虫态的收集
在显微镜下用解剖针分别挑取卵、不同龄期若虫100头,用吸虫管取成虫若干头,置于1.5 mL的离心管中,3个重复。卵从卵柄部位进行挑取,其他龄期若虫从虫体一侧进行挑取。
1.3.3 原位杂交
首先将收集的样本分别置于适量Carnoy固定液中过夜处理,然后弃掉固定液;用50%乙醇漂洗3次;加入200 μL Triton X-100(细胞渗透液),金属浴35℃,30 min,然后弃掉细胞渗透液;加入400 μL蛋白酶K,金属浴56℃,30 min,然后弃掉蛋白酶K;加入适量的Carnoy固定液固定过夜,弃掉后加入200 μL含有6% H2O2的乙醇溶液4℃过夜处理;用杂交缓冲液洗涤3次,加入100 μL杂交缓冲液和50 μL 10 pmol/mL荧光探针,金属浴60℃,避光处理24 h;杂交缓冲液洗涤2次。
采用LSM T-PMT Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微880观察拍照,Carl Zeiss蔡司照片处理软件ZEN 2012对照片进行处理。
2 结果与分析
2.1 烟粉虱MEAM 1隐种中Portiera和Hamiltonella的定位 经FISH检测Portiera和Hamiltonella在烟粉虱MEAM 1隐种卵(图1)、若虫(图2)和成虫(图3)3个阶段均有分布,且两种共生菌均“集中”分布于含菌细胞内,其中Portiera聚集分布于含菌细胞的中心部位,Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边。
2.2 烟粉虱MEAM1隐种携带Portiera和Rickettsia的定位 经FISH检测发现Portiera和Rickettsia在烟粉虱MEAM 1隐种各虫态均有分布,初生内共生菌Portiera“集中”分布于含菌细胞内,次生内共生菌Rickettsia分布在含菌细胞内,也“随机”分布于虫体其他部位或器官的两种分布类型(圖4~6)。
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