2024年3月5日发(作者：)

皮肤创伤修复中ＩＬ一１０、Ｉｋ－４时序性表达的实验性研究华中科技大学同济医学院法医学系研究生：张慧导师：秦启生教授吴焕明教授摘要ＴＥ确推断损伤时问在法医学检案中具有重要的司法鉴定意义。由于时间相关，因而可考虑作为推断损伤时间的参数。近来研究发现，抗炎时程发挥作用，保证创伤修复的顺利进行。为了解抗炎症细胞因子在创合过程中ＩＬ一１０和ＩＬ一４的表达变化进行了探讨。本课题选用成年清洁级昆明小鼠，建立小鼠臀背部皮肤切创动物模型，应用常规病理组织切片和免疫组织化学ＳＡＢＣ法，观察实验小鼠不同时程的生前伤（０．５—１６８小时）及死后伤（１～６小时）皮肤切创局部的ＩＬ－１０和１Ｌ４表达情况：并结合计算机图像分析技术对ＩＬ－１０和ＩＬ４表年中科技土学弼湃ｔ学盹挂区学蠢删－碛士舛宽ｔ牛＾格文摹，直杀嚣ｉ机体对损伤的反应受多种因素的影响，加之检测方法和“标志物”等原因限制，损伤时间推断至今仍为法医学界关注的热点及难题。目前资料表明，创伤局部的细胞因子在创伤修复过程中表达多有一定变化，不同细胞因子表达的时序和峰值也各不相同。由于这种动态变化规律与损伤症细胞因子ＩＬ—１０、ＩＬ一４、ＴＧＦ等具有抑制促炎症细胞因子的产生、影响单核细胞的功能和激活结缔组织细胞等生物活性，在创伤修复的不同伤修复过程中的表达变化与损伤时问的关系，本研究对小鼠皮肤切创愈

达变化的规律与皮肤损伤时间的关系进行定量分析。生前损伤组动物在臀背部的脊柱旁做一纵行的皮肤全层切口。分别于伤后不同存活时间点处死，取创缘及周围的皮肤组进行观察。死后伤组于动物处死后按照上述方法造创，在死后不同时间点取材。对照组不做任何手术处理直接处死动物，在与损伤组臀背部相同部位取材。标本经ＨＥ染色和免疫组化染色观察，对创伤局部皮肤整体表达ＩＬ一１０和ＩＬ一４免疫组化染色结果进行计算机图像分析；同时，皮肤切创组织中ＩＬ—ｌＯ不同部位（表皮细胞及表皮下组织的浸润细胞）的表达变化分别进行定量分析，实验所得数据经统计学分析处理。实验结果显示：正常皮肤组织ＩＬ－ＩＯ呈低水平表达。刨伤局部ＩＬ－ＩＯ在皮肤组织整体变化趋势为，伤后１小时表达开始增强，随存活时间的延长，阳性反应呈迅速上升趋势，３小时达峰值，转而下降，２４小时降至较低水平，４８小时后表达水平再次显著升高，并于７２小时产生第二个高峰；经统计分析，伤后３小时及７２小时组与其它各组均有显著性差异（Ｄ＜Ｏ．０１）；其阳性表达部位主要在表皮细胞及单核／巨噬细胞。ＩＬ一１０在皮肤不同部位的表达变化趋势为，伤后１—３小时表皮细胞阳性表达水平迅速升高，２４小时降至较低水平，伤后４８小时表达水平再次升高，９６小时后逐渐回复到正常水平；表皮以下阳性表达部位主要是浸润的单核／巨噬细胞，损伤６小时后阳性细胞在真皮、皮下组织及创口肉芽组织内逐渐增多，于伤后７２小时达最大值（５１．４１％±３．１２％），９６—１６８小时阳性细胞数逐渐减少（２９．３８％±２．６４％一５．５６％－ｔ－４．７４％）。正常皮肤组织仅部分毛囊及皮脂腺ＩＬ广４呈弱阳性表达，伤后阳性细胞主要为创缘肉芽组织及真皮内的成纤维细胞：切创后２４小时阳性细胞在创缘处逐渐增多，９６小时达峰值，４８～１６８小时一一直维持在较高水平；统计学分析平｜ｒ科避土学啊｛Ｉ卜区学院醯正学Ｉ劂ｔ璜士碍电ｔ牛宴静文摹Ｐ直喜五萝页

表明，生前伤２４小时后备组与正常对照组间均存在显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１）。死后伤，ＩＬ一１０仅于死后１－３小时呈弱阳性表达，ＩＬ一４未见阳性表达。实验结果表明：ＩＬ—１０和ＩＬ一４在创伤修复中具有重要的生物学作用，其在创伤局部表达水平及部位因修复的时程而异，具有时空特异性，二者均与损伤时间具有明显相关性。ＩＬ—ｌＯ和ＩＬ¨４在创伤愈合中主要作用及表达特点存在差异，创伤愈合早中期ＩＬ—ｌｏ主要在表皮细胞及巨噬细胞表达，而７２小时后儿４在成纤维细胞表达明显增强，两者在整体表达时空上有一定的序贯性，联合检测可扩大皮肤损伤时间的推断范围，进而提高其准确性。此外，分别对表皮细胞及表皮下细胞的ＩＬ１０免疫组化结果进行定量分析，发现ＩＬ１０在这两个不同部位中的表达变化均与损伤时间呈动态相关性，可以用于损伤时间推断。验证了分别检测损伤标志物在皮肤不同部位表达变化的可行性，为其他类似指标的定量检测奠定了基础。【关键词】法医病理学创伤修复损伤时间ＩＬ—１０ＩＬ一４牛寸科技土学恿湃正学托硅‘学蠢删板啧士畸览生年土格文摹，Ｉ善霹ｉ

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刖吾损伤时间推断是法医学检查中经常遇到的难题之一。正确判断损伤是否具有生活反应及生前伤所经历时间，既有利于划定嫌疑人的范围，也育助于判定死亡方式等，从而为案件的侦破和审判提供法医学证据。传统法医学推断皮肤损伤时问主要是根据创伤愈合过程中炎症反应、肉芽组织、上皮增生和瘢痕修复所产生的各种肉眼及组织形态学特征作为推断损伤时间的依据【ｌ＿２】。随着现代生物学技术的发展，酶组织化学法、免疫组化法和电镜等方法已被用于推断损伤时间，如检测出血及凝血时纤维蛋白网的变化、创缘组织中炎症介质及酶蛋白含量变化以及损伤组织中细胞外基质成分的变化【３—４１，使得损伤时间推断更加精确。但是，机体对损伤的反应受损伤类型、程度、部位以及年龄等多种因素的影响。故损伤时间推断至今仍为法医学领域尚未完全解决的问题之一，尤其是伤后存活时间短的生前损伤。损伤时问的推断历来是建立在损伤修复的病理生理学基础之上。现代创伤修复学认为，创伤愈合是一个复杂而有规律的过程，是炎症细胞和修复细胞的一系列活动，同时还有体液与基质的共同参与；其中细胞因子在损伤后机体防御反应、炎症反应、细胞增殖和组织填充以及组织改建和塑形中发挥着关键作用【５～。人们发现皮肤损伤后被激活的巨噬细胞以及血小板等可释放多种多功能细胞因子，它们既是创面炎症反应的产物，同时也是创面炎症反应的调节剂：一方面趋化各种炎症细胞进一步在创面聚集，另一方面也促使组织修复细胞在创伤局部增殖，为后期修复过程作储备。这些细胞因子作用广泛而复杂，通过相互拮抗控制炎症反应程度，发挥免疫调节作用维持体内平衡，保证创伤成功愈合。牛中科杖土学啊许匝学毙硅正学蠢删板唾士研兜ｔ年童静文摹，重善霹Ｉ

！皇竺竺堡竺墨！竺：竺：竺：！堕墨竺查篁竺茎垒壁堡壅！丝苎生理状态下，皮肤组织自身能表达多种细胞因子及其受体。损伤后，细胞因子及其受体（包括基因转录水平、ｍＲＮＡ和翻译水平、以及蛋白表达水平）在损伤局部的表达可发生一系列的变化，如表达增强或表达显现，不同细胞因子表达的时间顺序和峰值也不同【７－ｌ叭。法医学界自卜世纪九十年代起已开始探讨细胞因子在创伤修复过程中作用及表达变化与损伤时间的相关性。Ｋｏｎｄｏ和Ｓａｔｏ等多位法医学者先后利用动物实验、人体手术标本以及尸检标本，观察报道了一些炎症细胞因子如肿瘤坏死因子～ｑ（ＴｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉＳｆａｃｔｏｒ一Ⅱ，ＴＮＦ．Ⅱ）、白介素一１Ｂ（ＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｌＢ，１０１Ｂ）、白介素一６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一６，ＩＬ＿６）等在损伤局部不同损伤时间的表达情况ｔｌｌ－１４】。另外，王慧君等运用免疫组化、原位杂交及免疫印迹技术对生长因子如转化生长因子一Ｂ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｂ１，ＴＧＦ一１３１、碱性成纤维细胞生长因子（Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）、血小板源性生长因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ）在创伤后不同时间的表达做了一系列研究，发现生长因子表达变化规律具有一定时相性［１５－１６］，可作为精确推断损伤时间的分子生物学标志。以上研究结果均表明，细胞因子在损伤修复过程中发挥着重要作用，它们的动态变化与不同损伤修复阶段有明显相关性，这种不同时期细胞因子的涨落水平，是细胞因子在修复过程中的调节结果。尽管这些研究结果与法医学检案实际运用仍有～定差距，但创伤局部细胞因子的时序性表达为推断损伤时间提供了客观参数，可望用于推断早于一般形态学变化的早期损伤时间。随着对损伤修复认识的加深，一些抗炎症细胞因子如白介素一１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０，ＩＬ一１０）、白介素一４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一４，ＩＬ一４）、转化生长因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＴＧＦ）等在损伤修复中的作用越来越受到重视。现已证明，抗炎症细胞因子可抑制促炎症细胞因子毕卞斜杖土学日湃正蕾眈敞医学蠢蜊奠嘎士Ｊ叶竟ｔ丰＾格文摹，Ｉ共嚣直

的产生，还可以影响单核细胞的功能，降低其抗原递呈的能力；同时有些抗炎症细胞因子还可抑制Ｔ细胞增殖，促进Ｂ细胞的增殖分化。这些反应的结果产生广泛的免疫调节作用，对于创伤愈合具有不可忽视的意义。有些抗炎症细胞凼子还具有激活结缔组织细胞、促进细胞外基质沉积的作用，可促进创伤愈合。但关于皮肤损伤修复过程中ＩＬ－１０和ＩＬ４的研究在国内外却很少，尤其是它们时序性变化规律与损伤时间之间的关系仍不甚清楚。本研究采用小鼠臀背部皮肤切创模型，应用免疫组织化学链霉亲和素法（ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ—ＢｉｏｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘ，ＳＡＢＣ）及计算机图像分析技术，观察实验动物皮肤切创后不同存活时间点及死后伤的皮肤组织中ＩＬ－１０、ＩＬ．４的蛋白表达变化规律，分析了ＩＬ－１０和ＩＬ４在创伤修复中的生物学作用，探讨了创伤组织中相关抗炎症细胞因子的动态表达变化与损伤时间的动态关系，为损伤时问的推断提供了客观理论基础。迄今为止，损伤时间推断仍多采用常规形态学观察方法，免疫组织化学技术以其高度特异性、灵敏性和实用性，而被广泛用于动物实验和法医学检案的研究。近年来，为了更加客观和精确地评价损伤组织形态学的研究结果，免疫组化技术与形态计量法已被联合应用１１３’１５、１７。２０］。但是目前多数定量分析结果主要反映了指标的总体表达变化，尚无不同部位（如表皮细胞与表皮下组织中阳性细胞）表达规律分别进行定量分析的研究报道。鉴于以上原因，本研究还应用了不同的形态计量方法，对ＩＬ－１０在皮肤组织的不同部位免疫组化染色结果分别进行定量分析，分析皮肤切创愈合过程中不同部位ＩＬ－１０的表达变化规律与损伤时间的动态关系，为其他损伤指标的形态定量法检测提供了新的思路和方法。毕中科麓太学同湃正学院洼正学蠢删篮曩士碍竟ｔ牛主格文摹穸直鼻嚣Ｉ

材料与方法１．主要试剂及主要仪器１．１主要试剂一抗：兔抗小鼠ＩＬ一１０蛋白多克隆抗体，兔抗小鼠儿４蛋白多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司。试剂盒：即用型（ＳＡＢＣ）免疫组化试剂盒一内含复合消化液、抗原修复液、正常山羊血清、生物素化二．抗（羊抗兔１９６）、ＳＡＢＣ复合物（链霉亲和素．过氧化物酶复合物），购自武汉蹲｜Ｉ德生物工程有限公司。显色剂：３，３一二氨基联苯胺（３，３－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ—Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＤＡＢ），购自武汉博：｝德生物工程有限公司。临用前配制成ＤＡＢ显色液。粘片剂：ＡＰＥＳ（３Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ），购自武汉博士德生物工程有限公司。１．２主要仪器图像分析仪：ＨＰＩＡＳ—１０００高清晰度全自动医学病理图文分析系统一Ｅ４９，由华中科技大学同济医学院病理教研室多媒体工作室提供。光学显微镜：日本产ＡＦＸ．ＩＩ型Ｎｉｋｏｎ光学显微镜。石蜡切片机：美国产Ａ０切片机。冰箱：ｔｔ－２００海尔冰箱。烤箱：ＰＹＸ—ＤＨＳ一３５Ｘ４０隔水式电热恒温培养箱。２．主要试剂的配制华中斜矗太学间湃正学院仕正学蠢删蕾厦士Ｊｌｌ竟生丰丘论文摹船重兽五亨Ｉ

２．１０．１Ｍ磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ，ＰＢ）称取ＮａＨｚＰＯｔ．Ｈ。Ｏ２７．６９加双蒸水至ｌ０００ｍｌ溶解（Ａ液）；称取Ｎａ。ＨＰ吼．７Ｈ。Ｏ５３．６９加双蒸水至１０００ｍｌ（Ｂ液）；取Ａ液２３０ｍｌ、Ｂ液７７０ｍ］及双蒸水１０００ｍｌ，充分混和。２．２０．ＯＩＭ磷酸盐缓冲生理盐水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）称取ＮａＣＩ８．５克，量取Ａ液１６．５ｍｌ、Ｂ液３３．５ｍｌ加入１０００ｍｌ的容量瓶中，最后加双蒸水至１０００ｍ］，充分混和。２．３４％多聚甲醛一０．１Ｍ磷酸缓冲液（ｐＨ７．３）称取多聚甲醛４０９，置三角烧瓶中，加入８００ｍｌＰＢ液，加热至６０｜。Ｃ左右，持续搅拌使粉末充分溶解，再滴加ＮａＯＨ使溶液至清亮，最后补足ＰＢ液至１０００ｍｌ，充分混和。２．４１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００溶液将ＰＢＳ５０ｍｌ与０．５ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ１００放入４０。Ｃ水浴中温热，然后混匀，４℃冰箱保存。用时稀释５倍制成０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００使用。２．５０．０１Ｍ枸橼酸盐溶液甲醇ｌＯＯｍｌ，３０％双氧水（Ｈ。Ｏ。）Ｉｍｌ，混合备用。２．６粘片剂的配制用之前用丙酮１：５０稀释。经重铬酸钾溶液处理过的干净玻片浸泡３０分钟，取出后略干燥３分钟，纯丙酮涮洗２—３次，捞出后于空气中干燥或烘干，保存备用。２．７显色剂的配制ＤＡＢ４ｍｇ溶于２０ｍｌ０．０１ＭＰＢＳ中，显色之前加１０ｐ１３０％Ｈ２０ｚ。平中科技太学日费正学先肚区量蠢葺晴拜蕾曩士唧宽ｔ牛＾静文摹玎＂ｌｉ善嚣互

！皇兰竺竺竺墨！竺：竺：竺：！苎墨竺查篁竺室垒壁堡壅！丝苎３．动物模型的建立及组织取材３．１实验动物及动物分组清洁级成年昆明系小鼠６４只，雌雄不限，体重３５９±５９压±Ｓ），由同济医学院实验动物中心提供。实验动物单笼饲养，给予消毒饮食，实验前将实验小鼠置于实验室内适应性喂养ｌ周（要求安静、室温约１４℃一１８℃、避强光的清洁环境）。采用完全随机分组的方法，将６４只实验小鼠分成损伤组和对照组；其中损伤组又分生前伤组和死后伤组，前者按损伤后存活时间不同再分ｌｌ小组（各组存活时问分别为０．５、１、３、６、１２、２４、４８、７２、９６、ｔ２０、１６８小时），死后伤组则再分４小组（死后０．５、ｌ、３、６小时），每小组实验动物均为４只；对照组为正常对照，实验小鼠４只。３．２小鼠臀背部皮肤切创模型与组织取材实验前小鼠禁食１２小时，于术前一天将小鼠臀背部剃毛。生前损伤组小鼠称重后，用０．４％戊巴比妥钠（１ｍｌ／ｋｇ）腹腔注射麻醉，麻醉成功后常规手术消毒，在小鼠臀背部的脊柱旁开０．５ｃｍ处做一纵行长约ｌｃｍ的皮肤全层切口，深达筋膜，创面自然止血，不包扎，不施药，保持创口干燥。单笼饲养，给予消毒饮食，分别于伤后不同存活时间点（９／后０．５－１６８小时）行颈椎脱位处死，取创缘及周围约ｌｃｍＸｌｃｍ的皮肤组织。死后伤组于动物处死后按照上述方法造创，在死后不同时间点（死后０．５－６小时）取材。对照组不做任何手术处理直接颈椎脱位处死，在与损伤组小鼠臀背部相同部位取等量大小的皮肤组织。该臀背部皮肤切创动物模型经预实验观察，具有制作简单、存活率高、损伤程度差异小、呵重复性强的特点。年．ｒ科拽土学同沸正掌眈馥正学蠢删截＿唛士碍竟ｔ牛土论文摹稽ｌ善五，ｉ

３．３组织处理３．３．１组织固定各组检材分别置于４％多聚甲醛０．１Ｍ磷酸缓冲液（４。Ｃ）中固定１２ｈ备用。３．３．２石蜡切片制作冲水：将固定好的组织块室温下冲水２小时；脱水：于７０％、８０％、９０％、１００％ｌ、１００％一２梯度酒精溶液中脱水；透明：于二甲苯液中透明处理；浸蜡：将组织块浸入６０℃左右熔融的石蜡液；包埋：用熔点为５８～６０℃的石蜡低温包埋：切片：连续切片，每张约厚５ｕｍ；烤片：将切片置于６０。Ｃ烤箱，保存备用。４．实验方法４．１ＳＡＢＣ免疫组化染色（１）常规脱蜡至水；（２）滴加新鲜配制的３％Ｈ２０２溶液，室温孵育１０分钟，蒸馏水冲洗２分钟×３次；（３）滴加０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００溶液，消化１０分钟，０．０１ＭＰＢＳ溶液洗２分钟×３次：（４）热修复抗原：切片浸入Ｏ．０１Ｍ构橼酸盐缓冲液（ＰＨ６．０），微波炉加热至沸腾后断电，间隔１０分钟后反复２次，冷却后０．０１ＭＰＢＳ溶液振洗３分钟×２次；（５）滴加抗原修复液Ｉ，室温孵育５分钟，０．０１ＭＰＢＳ溶液振洗３分钟×２次；（６）滴加１０％正常山羊血清，室温孵育３０分钟，倾去血清，勿冲洗；（７）滴加兔抗鼠多克隆～抗，置于湿盒内４＂Ｃ过夜，０．０１ＭＰＢＳ溶液振年中科技太学日湃匝学院馥区学ｌ量＿弹蕾曛士唧竟ｔ丰鼻静文摹学Ｉ善嚣页

洗２分钟×３次；（８）滴加生物素化羊抗兔二抗，置于湿盒内室温下孵育ｌ小时，０．０ＩＭＰＢＳ溶液洗２分钟×３次；（９）滴加ＳＡＢＣ复合物，于湿盒内室温下孵育３０分钟，０．０１Ｍ溶液充分漂洗５分钟×４次；ＰＢＳ（１０）ＤＡＢ显色：室温，滴加ＤＡＢ显色液，显微镜Ｆ控制反应时间，自来水冲洗，蒸馏水漂洗：（１】）苏木素轻度复染，常规脱水、透明、树脂封片。每种免疫组化染色均设对照。阴性对照，采用０．０１ＭＰＢＳ代替一抗４。Ｃ过夜；阳性对照，取博十德生物工程公司所提供的ＩＬ．１０与ＩＬ一４染色阳性片。不着色为阴性，胞浆或胞膜着黄色或棕黄色为阳性。４．２ＨＥ染色常规脱蜡至水，苏木素染色１５分钟，水洗１５分钟，伊红复染５分钟，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。４．３图像分析和数据处理随机从每组中选３张ＩＩ．一ｌＯ、ＩＬ一４免疫组化染色切片，在高倍镜下（１０×４０）对每张切片随机观察５个视野，用ＨＰＩＡＳ一１０００高清晰度全自动医学病理图文分析系统一Ｅ４９，测量每个视野中阳性反应的平均光密度，求其每组测量的数据的总均值；同时，从ＩＬ－１０每组切片的表皮层随机选１０个视野，测量每个视野中表皮细胞阳性表达的积分光密度值；同样倍数下，在每组切片的真皮、皮下组织及创口肉芽组织内随机选１０个视野进行阳性细胞计数分析，计算每个视野中ＩＬ－１０阳性细胞数与浸润细胞总数的比值；将实验所得数据（ｉ＿＋ｓ）输入ＳＰＳＳ１０．０．７统计分析软件，采用单因素方差分析，按ＳＮＫ检验法对各组均数间进行多重比较分析。毕中科藏土学同许正学宽敞医学蠢蹦蕾嘎士Ｊ开毫生牛业静文事撑１共嚣百

实验结果１．基本病理形态学改变１．１对照组为正常小鼠臀背部皮肤组织结构，表皮层由２０层上皮细胞组成，下组织较薄。２．１损伤组２．１．１生前伤组２．１．１．１肉眼观察：实验小鼠行臀背部皮肤切创术后，即见创口哆开，伴明显出血及渗液，伤后１５分钟创缘轻度红肿并有Ｉ虹凝块形成，１小时血凝块收缩，２４小时创口皮肤干燥已被血痂覆盖，４８小时皮肤收缩、创缘平整、红肿消退，７２小时血痂与创缘皮肤分离，９６～１２０小时血痂开始脱落、创口表面被增生的上皮覆盖并可见皮下红色肉芽组织，１６８小时创口已愈合，愈合处皮肤苍白、质地较坚实。２．１．１．２光镜表现伤后０．５小时创缘有出血及渗液；伤后ｌ～３小时真皮内毛细血管扩张、充血，毛囊周围开始出现少量的粒细胞（附照１）。伤后６小时可见创缘边缘部分上皮细胞胞浆均质化，细胞核消失，真皮内中性粒细胞浸润增多。１２小时皮下组织内有大量渗出的中性粒细胞，开始出现少数巨噬细胞浸润（附照２）。２４小时见以渗出的中性粒细胞为主要成分的肉芽组织开始形成，并向创口长入，近创缘表皮及毛囊上皮开始增生（附毕●科杖土学日井ｉｌｌ学托挂医学蠢叠自玎苴嘎士甘竟ｔ丰鼻静文摹苗ｉ杀ｊ亭直表面有角化，基底细胞层清晰可分；真皮层有较多的毛囊及皮脂腺，皮

《皮陇创俦修复中能一船，＂一亭时序性末迭皓实齄性唧究》张慧照３）。伤后４８小时表皮增生明显，创口局部肉芽组织增多。７２小时组肉芽组织内的中性粒细胞减少，巨噬细胞、成纤维细胞和新生毛细血管显著增多（附照４、５），皮下组织内可见大量巨噬细胞浸润。伤后９６～１２０小时创口已被肉芽组织填平，肉芽组织内炎症细胞明显减少，主要由大量成纤维细胞及纤维细胞构成（附照６、７）。伤后１６８小时炎症细胞极少乃至消失，成纤维转变成纤维细胞，胶原纤维增粗并发生透明变性，多数新生毛细血管闭塞消失。２．１．２死后伤组死后伤３０分钟、ｌ小时、３小时、６小时的皮肤组织，肉眼及显微镜卜未见生前伤所见的改变；各组皮肤组织除变薄外，较正常对照组也无明显变化。２．免疫组织化学结果２．１损伤局部ＩＬ一１０免疫组化染色观察２．１．１对照组表皮细胞部分胞浆呈浅黄色着色，核阴性；毛囊皮脂腺、部分毛囊上皮也可见１Ｉ，－ｌｏ免疫反应呈弱阳性（附照８）。２．１．２损伤组：２．１．２．１生前伤组：伤后０．５～１小时组：见创口处渗液、创缘处表皮及真皮浅层呈阳性反应，近创缘处表皮细胞阳性反应稍增强，整个胞浆呈黄色着色（附照９），远离创缘处的免疫染色未见增强；伤后１小时组较０－５小时组阳性反应增强，可见细胞免疫染色程度逐渐加深，免疫染色细胞的数量增加（附照１０）。伤后３小时组：近创缘处表皮细胞阳性反应明显增强，其胞浆内布华中科毡土学日湃‘学眈硅重量蠢蹦量蕞士ｊ叶竟ｔ牛蠢静文摹阿直善劈页

《皮陇创俦修复中能一ｔｏ，＂一亭时序性末迭皓实齄性唧究》张慧满棕黄色颗粒（附照１１）；远离创Ｅｌ的部位，表皮细胞阳性反应也有所增强；同时部分毛囊周围可见少量胞浆棕黄色染色的炎性细胞。伤后６～２４小时组：伤后６小时组表皮细胞阳性表达程度减弱，至２４小时已接近正常水平：伴随炎症细胞浸润的增加，创伤局部出现少量单个核细胞（以单核／巨噬细胞为主）呈阳性染色，伤后２４小时阳性细胞在真皮、皮下组织及创口肉芽组织内逐渐增多；同时，伤后２４小时组已可见表皮细胞的轻度增生，部分毛囊上皮阳性反应增强（附照１２）。伤后４８～９６小时组：因单核／巨噬细胞浸润增加，创口处肉芽组织内可见巨噬细胞、部分成纤维细胞及淋巴细胞等单个核细胞的胞浆呈深棕色（附照１４、１５），尤其在伤后７２小时组的真皮及皮下组织有大量的阳性反应的单核．巨噬细胞；此期间创缘处新生的表皮层较厚，部分新生细胞呈阳性反应，胞浆免疫着色呈黄色（附照１３）。伤后１２０～１６８小时组：随着炎症细胞逐渐减少、成纤维细胞转化为纤维细胞以及再生上皮化的完成，刨伤局部的阳性反应细胞明显减少。２．１．２．２死后伤组：死后０．５～３小时各组的皮肤表皮层细胞仍有弱阳性表达，且死后０．５小时及１小时皮肤组织的阳性程度较正常稍增强。死后６小时表皮及真皮层均未见阳性着色（附照１６）。２．２损伤局部ＩＬ－４免疫组化染色观察２．２．１对照组：正常小鼠皮肤，ＩＬ广４只在部分皮脂腺呈浅黄色着色，其余部位未见表达（附照１７）。２．２．２损伤组：２．２．２．１生前伤组：伤后０．５。１２小时组：创缘处均未见明显的阳性反应，部分真皮层毛牛中科技土学啊湃正学院豫匝量蠢删簋嘎士畸竟ｔ牛主静文摹，，ｌ共．器｛

《皮陇创俦修复中口＜一ｔＯ，ｚｚ一亭时序性末迭皓实齄性唧究》张慧细血管周围有少量胞浆呈棕黄色着色的阳性细胞。伤后２４～４８小时组：创伤局部肉芽组织的部分成纤维细胞胞浆呈阳性着色，真皮层阳性细胞也增多（附照１８、１９）。伤后７２～９６小时组：损伤局部阳性反应明显增强，这些阳性细胞主要以成纤维细胞为主，也可见部分肥大细胞和淋巴细胞胞浆呈阳性着色，它们多位于肉芽组织周边及真皮层的毛细血管周围（附照２０、２１）。伤后１２０～１６８小时组：伤后１２０小时组随着肉芽组织的纤维化，ＩＬ－４阳性表达逐渐降低（附照２２），伤后１５８小时组创缘组织内仍有一定的阳性反应。２．２．２．２死后伤组：死后各组创伤局部皮肤组织均为阴性反应。２．３图像分析处理结果２．３．１ＩＬ一１０与ＩＬ一４免疫组化染色结果分析２．３．１．１ＩＬ一１０与ＩＬ一４免疫组化染色及图像分析结果采用计算机图像分析系统对ＩＬ一１０、ＩＬ一４免疫组化染色结果进行定量检测，测量每组免疫组化阳性染色细胞的平均光度值，然后将所得数据进行进行单因素方差分析，最后应用ｑ检验判断各组间的差异性及其表达与损伤时间的关系。统计结果示：与对照组比较，ＩＬ一１０生前伤０．５小时、２４小时组及死后３小时组与对照组之间无显著性差异（ｐ＞Ｏ．０５），其余各组与对照组间均有显著性差异（ｐ＜０．０１）；ＩＬ一４损伤后０．５－１２小时组与对照组问无显著性差异（ｐ＞Ｏ．０５），其余各组与对照组间均有显著性差异（ｐ（０．０１），相邻组问存在显著性差异。损伤组各组之间比较，ＩＬ一１０染色在伤后３小时组及伤后７２小时组与其余各组间比较均有显著性差异（Ｄ＜Ｏ．０１），且生前伤相邻组间存在显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１）；ＩＬ一４生前伤华中斜蓝土学喝湃正学克法正学蠢蜊蕾礓士Ｊ叶竟ｔ平童话文摹玎重兽霉Ｉ

后２４～１６８小时相邻组问有显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１）。（见表１）表１．各组ＩＬ一１０、ＩＬ一４的免疫反应阳性信号平均光度值（１±ｓ）实验分组平均光度值ＩＬ－１０ＩＬ－４对照组０．０２７０７－＋０００２９ｏＪ）０９１７±Ｏ．Ｄ（０６Ｉ伤后０．５ｈｏ０４３７５±ｏ０２３０４＃ｏ０１１３６±００１４４２＃伤后１ｈ００６８０９士ｏ０２６ｔ２ｏ０１０８７±００２８２ｌ＃伤后３ｈ０１５２９±００４２７Ｉ＋００１１６９±Ｏ０１５６３＃庄伤后６ｈ００９１７７±ｎ０１０４２ｎ０１５７３±ｎ０１６２５＃００７２７３±０．０２７０８ｎ０１８４４±００１０７６＃前伤后１２ｈ伤后２４ｈ００５９９１±００１７７＃００５６５７±００１３７９伤伤后４８ｈ０１０８８±０．０２３Ｂ１３１０９７±０．（Ｍ４２６组伤后７２ｈ０２１８４±００２７０１·０１６５ｌ±ｎ０１４０４伤后９６ｈ０１１７８±００５９２０１９６８±ｎ０１８６７伤后１２０ｈ０．０８８９５±０．０１２０７０１４９９±ｕ０５１８６伤后１６８ｈ０．０５２８１±０．０１２１５００９８８５±ｕ【Ｊ２３）６死后０５ｈ死死后１ｈ后伤死后３ｈ死后６ｈ＃与对照组比较ｐ）０．０５，其余与对照组比较ｐ＜０．０１，＋与其它ＩＬ一１０各组比较Ｐ＜０．０１；一为阴性染色。２．３．１．２小鼠皮肤切创愈合过程中ＩＬ－ＩＯ与Ｉｋ４表达的时序性小鼠皮肤切创愈合过程中ＩＬ一１０与ＩＬ一４表达的时相分布图（见图１）：ｌＦ常皮肤组织ＩＬ—ｌＯ与ＩＬ一４均呈低水平表达；ＩＬ一１０于伤后１小时表达开始增强，随存活时间的延长，阳性反应呈迅速上升趋势，３小时达峰值，转而下降，２４小时降至较低水平，４８小时后表达水平再次显著升高，并于７２小时产生第二个高峰；而ＩＬ一４损伤早期表达水平仍较低，切创后２４小时反应增高，９６小时达峰值，４８—１６８小时一直维持在较高水平。牛中科技土学目湃匝学眈法正学蠢ａａ宵量碛士唧竟生牛童论文苇挣ｉ共ｊ旨Ｉ

稚鬟露＊图１．小鼠皮肤切创愈合过程中ＩＬ－ｌＯ与ＩＬ·４表达时相分布图２．３．２小鼠皮肤切创局部ＩＬ一１０不同部位表达的免疫组化染色结果分析利用图像分析系统，测定小鼠切创后不同时程的表皮细胞ＩＬ．１０阳性反应积分光密度；并采用阳性细胞计数法对真皮、皮下组织及创口肉芽组织内的阳性细胞成分进行分析，计算出其阳性细胞比值，分析小鼠皮肤创伤愈合过程中ＩＬ－ＩＯ在皮肤组织不同部位的表达规律及其与损伤时间的关系（见表２）。统计分析结果表明：损伤后０．５小时、２４小时、１２０小时及１６８小时的表皮细胞阳性反应程度与『Ｆ常对照组无显著性差异（ｐ＞０．０５），其余各组均与正常对照组存在显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１）；伤后３小时与其余各组比较有显著性差异（ｐ＜０．０１）。损伤３小时后的各组的真皮、皮下组织及创口肉芽组织内阳性反应与正常对照存在显著性差异（ｐ＜０．０１），其中伤后７２小时组与其余各组问有显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１）。壅！：尘基廛丛塑型！！二！！至堕圭垄塑笪煎叁壅塑垡墼鱼鬯堡垒堑箜墨喜薯嘉：ｏｓｎｍ抽ｎｍ：ｎｍｍｍｍｎｍｎｌ盟“宇８０挈２。≯“８＋２４５ｏ．６＋５ｓ。ｎ≯０１，３”ｎ４＋９３ｅ０．４＋１５。ｎ２＋３２３“１ｔ４５。“１ｔ３“謇岔。甲“甲。丢ｓｓ”，。蒜。赢“Ｏ＋１“ｏ函ｍ蒜瘟，“甲。字袁皮下黜…一接！要：端娑篓器篇器器组表皮细胞阳性反应程度比较ｐ＜Ｏ．０１；一为阴性染色华中科ｔ太学同｛Ｉ卜正学院挂‘学蠢蹦蕾硬士Ｊ叶竞生丰业静文摹印直夹劈页

《皮陇创俦修复中口＜一船，ｚｚ一亭时序性末迭皓实齄性唧究》张慧以上分析结果提示，小鼠皮肤创伤愈合过程中ＩＩ．一１０在表皮细胞与表皮下（真皮、皮下组织及创［＿１）浸润细胞中的表达变化与损伤时间呈明显的动态相关性；损伤后ＩＬ¨１０在表皮细胞内分别在３小时、４８小时表达水平达峰值，而真皮、皮下等处的阳性细胞比值则于７２小时达最大值（见图２）。６０１Ｅ：量ｊ真皮、皮Ｆ及创口ＩＬＬＯ＾５００８阳性细胞比登４０削值蛩３００．６骺—●一表皮ＩＬ—ｌＯ阳采性反应积分嚣２００．４￥《ｊ光密度值Ｌ萎１００２—００ｏｏ·５１３袅伤｛；州２｛ｈ？８７２９６１２０１６８图２．小鼠皮肤切创愈合过程中儿一１０小同表达部位的表达变化与损伤时间的动态关系华●科技土学同湃暖学先硅正学蠢蹦苴嘎士呵竟生平盘静文摹玎ｉ嘉霹ｉ

讨论１．创伤修复过程中细胞因子的表达变化规律现代创伤修复学认为，创伤修复不仅依赖巨噬细胞、成纤维细胞和究报道【２ｌ】，在创口修复中能发挥作用的细胞因子有多种，它们在损伤修复的不同环节中起作用，激发愈合过程的某～方面，如血管生成或基质蛋白沉积等。许多体内外实验结果显示，每一种细胞因子的作用其有多样性，丽这科，多样性依细胞因子所处的具体微环境和创伤愈合过程中不同时期而表现各异。如Ｍｕｓｔｏｅ等研究发现【”倒，在人正常愈合的创口中，成纤维细胞和内皮细胞主要含有ＰＤＧＦ—ＡＡ；相反，慢性不愈合创口仅含少量ＰＤＧＦ。Ｋｏｎｄｏ等实验表呀“。１…，ＴＮＦ、１１＿，－６的ｍＲＮＡ在损伤后１小时内即可发现其表达，以后随着细胞对损伤的反应增强，细胞因子表达逐渐升高，如ＴＮＦ－ｏ、ＩＬｌｌ３在伤后３小时达峰值，而ＩＬ－１ａ则为６小时，ＩＬ－６为１２小时达峰值，然后表达水平出现下降，随着损伤创口内肉芽组织的出现使细胞因子的水平再次升高，如７２小时后上述各细胞因子的水平均出现明显的“反弹一眭升高。结果印证了不同修复时程各种细胞因子的表达变化规律亦不同。本研究采用小鼠臀背部皮肤切创模型，应用免疫组织化学ＳＡＢＣ法及计算机图像分析技术，定位定量分析了小鼠皮肤切创后不同存活时间点及死后伤的皮肤组织中ＩＬ一１０和ＩＬ＿４的蛋白表达变化规律。研究结果华＿ｒ斜技土学恿许区学眈性匝学蠢蹦ｔ曩士Ｊ叶竟ｔ丰鼻静文摹罂ｌ甚．ｃａ页血管内皮细胞等炎性细胞和修复细胞单独而又相互协调的效应，而且还依赖于它们所分泌的活性介质和细胞因子直接或间接的作用。Ｓｔａｖｉｎ研

！皇竺竺堡竺墨！竺：竺：竺：！堕墨竺查篁竺茎垒壁堡壅！丝苎显示，在创伤后１～３小时ＩＬ－ＩＯ在表皮细胞的表达明显增强，随肉芽组织形成修复进入细胞增殖和组织填充阶段时，阳性染色的单个核细胞开始增多，于７２小时达峰值，并随创伤修复顺利完成其阳性反应也相对减弱；ＩＬ４在创伤局部的表达增高明显晚于前者，伤后７２小时后ＩＬ－＿４在成纤维细胞表达明显增强，而且创伤后１６８小时ＩＬ一４仍有较高水平表达。可以看出不同时程修复的ＩＬ－ＩＯ、ＩＬ一４表达部位及水平各异，显示了其在损伤修复中的功能多样性。２．创伤修复中相关抗炎症细胞因子的作用细胞因子的作用具有多样性的同时，还可通过相互诱导和交互调节，，”乍协同、相加或拮抗作用，影响细胞功能活动形成一个网络系统。｝｛前，根据其在宿主防御反应中功能的不同，分为两类：促炎症细胞因ｆ和抗炎症细胞因子。前者主要包括ＴＮＦ—ｏ、ＩＬ一１和ＩＬ一６等，后者丰要有ＩＬ１０、ＩＬ一４和ＴＧＦ—Ｂ，等。随着对创伤修复认识的深入，抗炎症细胞因子在创伤愈合中的调节作用倍受关注。ＩＬ—ｌＯ又名细胞因子合成抑制因子，是体内重要的抗炎性细胞因子和免疫抑制因子［２４ｌ。Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ等报导【２５】，ＩＬ一１０能下调单核／巨噬细胞上ＭＨＣＩＩ类分子的表达和促炎细胞因子产生，抑制抗原呈递细胞依赖的ＴＨ。细胞功能，还可促进Ｂ细胞增生和分泌免疫球蛋白，从而发挥强大的抗炎和免疫抑制作用。Ｓａｔｏ等［２６１通过皮肤创伤动物模型研究发现，在皮肤创伤局部ＩＩ。一１０能抑制中性粒细胞的浸润，控制一些单核趋化因子及前炎症细胞因子的过量表达。本实验观察结果表明，除了表皮细胞外，单核巨噬细胞是ＩＬ一１０主要阳性表达细胞，其在创伤修复中的作用明显和调控单核巨噬细胞的功能相关。生理状态下机体能分泌ＩＬ－ＩＯ的细胞有单核／巨噬细胞、ＴＨ２细胞、年中科技土学日许‘考托硅医学蠢删苴曩士舛竞生牛主论文摹嚣ｉ鼻五拿ｌ

！皇竺竺堡竺墨！竺：竺：竺：！苎墨竺查篁竺茎垒壁堡壅！丝苎肥大细胞、Ｂ细胞、角质细胞、小胶质细胞等【即ｌ。当机体受到某些外界因素作用或患有某些疾病时，上述细胞分泌【Ｌ．一１０的能力明显增强。Ｓａｔｏ等【２６１应用原位杂交和免疫组化技术观察了创伤修复过程中ＩＬ一１０的表达部位，结果证实创伤后表皮细胞及浸润的单个核细胞是其主要来源。本实验观察结果与Ｓａｔｏ的研究基本一致，伤后早期阳性反应高峰与表皮阳性表达增强及创口渗出物中含有血源性ＩＬ—１０有关，４８小时后由于单核／巨噬细胞浸润增加及新生上皮形成，使得阳性反应再次反弹，尤其第二个峰值的形成与创伤局部单核巨噬细胞的浸润时程有明显的相关性，伤后１６８小时创缘组织内ＩＬ—ｌＯ表达水平仍高于正常对照（ｐ＜０．０１），这可能与创伤局部巨噬细胞尚未完全消退以及新生上皮阳性表达相关。Ｉ卜４是｝｝｛Ｔ细胞、肥大细胞、活化的成纤维细胞和嗜碱性粒细胞等产生的一种多功能抗炎症细胞因子。有文献报道【２８】，ＩＬ一４除了抑制单核细胞促炎反应外，还可促进成纤维细胞产生胶原等细胞外基质成分，诱导肉芽组织中肌纤维母细胞的分化，降低巨噬细胞内金属基质蛋白酶的合成等。Ｓａｌｍｏｎｌ２９】研究发现，小鼠皮肤损伤中晚期ＩＬ４在活化增生的成纤维细胞中表达，提示了ＩＬ４能激活结缔组织细胞增生，刺激细胞外基质的沉积，保证创伤修复的顺利完成。本研究通过ＩＬ一４免疫组化染色显示，正常小鼠臀背部皮肤组织仅部分毛囊及皮脂腺ＩＬ一４呈弱阳性表达；伤后１２小时之前的创缘均未见明显阳性反应，部分真皮层毛细血管周围有少量阳性细胞，伤后阳性反应细胞主要为成纤维细胞；伤后２４小时损伤局部阳性反应开始增多，至伤后４８～９６小时反应咀显增强，这些阳性细胞主要以成纤维细胞为主，它们多位于肉芽组织周边及真皮层的毛细血管周围。此结果也间接证实了ＩＬ４在创伤修复晚期具有重要作用。同时，本实验还可见部分肥大细胞和淋巴细胞呈阳性染色。这一结果支持Ｔｒａｕｔｍａｎｎ等１３０ｌ对人体皮肤创伤愈合中肥大细胞的观察结年中斜哉太学闾湃匝学光法正掌蠢蹦篮碛士舛竟生丰＾静文摹羽重夹嚣Ｉ

！皇兰竺堡竺墨！竺：竺：竺：！苎查竺查篁竺室垒壁堡壅！丝苎果，他们证实６０％．７０％的肥大细胞ＩＬ－４呈阳性。３．皮肤创伤局部ＩＬ—１０的时相性表达与损伤时间关系ＩＬ—ｌｏ作为一种作用较肯定的抗炎性细胞因子，在调控创伤性炎症反应中发挥了重要作用，理论上ＩＬ一１０在创伤局部的表达变化应与创伤修复时程密切相关。Ｓａｔｏ［２６１等采用ＥＬＩＳＡ技术定量检测小鼠皮肤创伤愈合中ＩＬ１０的表达变化，结果显示创伤后创伤局部组织ＩＬ一１０蛋白水甲明显升高，３小时达峰值，２４小时恢复至正常水平，７２小时再次达新高峰。此外，Ｏｈｓｈｉｍａ［３１】用ＲＴＰＣＲ技术研究了损伤早期ＩＬ—ＩＯｍＲＮＡ的变化规律，发现ＩＩ．一１０ｍＲＮＡ于伤后０．５－３小时显著增加，伤后１５分钟即迅速ｊ二升，ｌ小时达最大值。本研究对儿一１０在皮肤组织的整体表达趋势进行观察分析，结果证实诈常皮肤组织ＩＬ１０呈低水平表达，伤后ｌ小时表达开始增强，随存活时间的延长，阳性反应呈迅速上升趋势，３小时达峰值，２４小时降至较低水平，４８小时后表达水平再次碌著升高，并于７２小时产，ｋ第二个高峰（图１）。经统计分析，伤后３小时及７２小时组与其它各组均有显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１）。此免疫组化定量分析结果与Ｓａｔｏ的研究结果相符合。以上研究从蛋白水平证实了ＩＬ—１０在皮肤创伤组织的总体表达变化具有明显的时序性。另外，本研究还分别定量分析了ＩＬ一１０在表皮细胞及表皮卜－细胞的免疫组化结果，进一步探讨了皮肤创伤修复过程中ＩＬ１０的表达变化规律。研究结果显示，小鼠切创后的表皮细胞在１小时后ＩＬ一１０表达水平开始增强，伤后３小时达峰值，２４小时降至较低水平，伤后４８小时表达水平再次升高，９６小时后逐渐回复到正常；而表皮下阳性细胞于损伤６小时后在真皮、皮下组织及创口肉芽组织内逐渐增多，于伤后７２小时达最大值（５１．４１％±３．１２％），９６－１６８小时阳性细胞数逐渐减少（２９．３８％±２．６４％～５．５６％＋４．７４％），阳性细胞主要是浸年中科技土学日许正学光硅匝掌蠢捌藏＿曛士研竞生牛土论文弟嚣｛共嚣重

《皮陇创俦修复中能一船，＂一亭时序性末迭皓实齄性唧究》张慧润的单核／巨噬细胞，还町见部分成纤维细胞、淋巴细胞等单个核细胞呈阳性着色。以上结果提示，小鼠皮肤创伤愈合过程中ＩＬ１０在表皮细胞与表皮Ｆ浸润细胞中的表达变化均与损伤时间呈动态相关性，可以用于损伤时间推断。同时，从新的分析角度验证了Ｓａｔｏ研究结果，表明早期高峰与表皮阳性反应增强有关，４８小时后浸润的单核／巨噬细胞及新生上皮呈阳性表达，使得阳性反应再次反弹，伤后７２小时第一＋个峰值的形成与创伤局部大量的巨噬细胞浸润明显相关。４．皮肤创伤局部ＩＬ一４的时相性表达与损伤时间关系皮肤损伤修复过程ＩＬ，一４通过激活结缔组织细胞增生，刺激细胞外基质的沉积，参与创伤修复。Ｓａｌｍｏｎ［２９】报导，正常小鼠皮肤ＩＬ一４表达水平微弱，损伤早期亦无明显表达，直至损伤中晚期ＩＬ一４在活化增生的成纤维细胞中表达，至伤后２１天仍有一定水平的表达。本研究对小鼠臀背部皮肤切刨后０．５－１６８小时ＩＬ一４的表达水平进行观察及定量分析，结果显示，切创后０．５－１２小时ＩＬ－４呈低水平表达，伤后２４小时阳性细胞在创缘处逐渐增多，随着肉芽组织中活化成纤维细胞的增多ＩＬ一４表达于９６小时达峰值，且伤后４８～１６８小时期间ＩＬ一４表达一直维持在较高水平。统计学分析表明，生前伤２４小时后各组与正常对照组问均存在显著性差异（ｐ＜Ｏ．０１），提示ＩＬ一４于创伤愈合中晚期表达水平显著升高，这与此时期主要表现刨口成纤维细胞增殖及组织填充等修复进程一致，其时序性表达可作为损伤时间推断的参考。以上研究结果表明，ＩＬ一１０和ＩＬ一４在创伤修复中具有重要的生物学作用，其在创伤局部表达水平及部位因修复的时程而异，具有时空特异性，二者均与损伤时间具有明显相关性（图１）。此外，ＩＬ一１０和ＩＬ一４年中斜杖土学同湃正学院吐匝学蠢叠ａ甜ｔ碛士冉｝竟ｔ丰鼻论文摹并重转嚣页

《皮陇创俦修复中能一船，＂一亭时序性末迭皓实齄性唧究》张慧在创伤愈合中主要作用及表达特点存在差异，创伤愈合早中期ＩＬ—ｌＯ主要在表皮细胞及巨噬细胞表达，而７２小时后ＩＬ一４在成纤维细胞表达明显增强，两者在整体表达时空上有一定的序贯性，联合检测可扩大皮肤损伤时间的推断范围，进而提高其准确性。值得注意的是，ＩＬ一１０在死后伤Ｏ．５～１小时组表达水平高于正常对照组（ｐ＜Ｏ．０１），这是损伤时间推断中常遇到的问题，即死后早期有些损伤标志物会出现阳性表达。分析其原因认为：首先，死后早期尚有活力的细胞对损伤刺激具有超生反应能力；其次，死后早期创口仍有出血，因而含有血液来源的细胞因子成分：再次，死后早期的组织仍不完全同于活体组织，或多或少出现组织进行性溶解可引起不同程度的假阳性吲。上述反应的叠加易造成死后早期阳性反应强于同时期生前伤的假象，但在性质上与生前伤有本质的区别。死后皮肤因血供停止和皮肤脱水有不同程度的变干、变薄；基因水平的表达己不存在；无炎性细胞浸润及细胞增生；皮下组织对各细胞因子的表达均为阴性，这些特点可以用作鉴别。此外，ＩＬ．１０、ＩＬ－４是细胞因子家族成员，这类因子的表达可受创伤面积、性质等多种内外因素的影响，但本实验是在严格控制实验条件下进行的，相对于人体检案的实用性还有一定的差距，有待于进一步完善。另外，皮肤表皮层与表皮下组织分界较清晰，此特点是采用皮肤不同部位分别定量检测的结构基础。损伤后标志物在皮肤表皮细胞及表皮下浸润细胞均有表达，是此研究的组化基础。本实验证实了分别检测损伤标志物在皮肤不同部位表达变化的可行性，为其他类似指标的定量检测提供了新的基础。因仅局限于ＩＬ－ＩＯ一种指标的观测，以后工作需增加检测指标或对人体检案材料进行研究，以保证此方法的客观性、可信性和实用性。华｜ｒ科截土学一崎区学睨眭匝学量蹦蕾嘎士甘宽生牛业论文摹打直．Ｉ｝嚣页

结论１．正常皮肤组织ＩＬ１０呈低水平表达，伤后ｌ小时表达开始增强，随存活时间延长阳性反应呈迅速Ｌ升趋势，３小时达峰值，２４小时降至较低水平，４８小时后表达水平再次显著升高，并于７２小时产生第二个高峰。【Ｌ—ＬＯ在创伤局部表达水平及部位因修复的时程而异，具有时空特异性，可以作为早期损伤时间推断的参考指标。２．正常皮肤组织及切创后０．５－１２小时ＩＬ＿４呈低水平表达，伤后２４小时阳性细胞在创缘处逐渐增多，随着肉芽组织中活化成纤维细胞的增多儿一４表达于９６小时达峰值，且伤后４８～１６８小时期间ＩＬ．一４表达一直维持在较高水平。提示ＩＩ。一４于创伤愈合中晚期表达水平显著升高，这与此时期主要表现创口成纤维细胞增殖及组织填充等修复进程一致，其时序性表达可作为中晚期损伤时间推断的参考。３．由于皮肤的组织学特点和ＩＬ１０在皮肤表达的特点，分别对表皮细胞及表皮下细胞的ＩＬ—ｌＯ免疫组化结果进行定量分析，发现ＩＬ一１０在这两个不同部位的表达变化与损伤时间均呈不同动态相关性，可以用于损伤时问推断。验证了分别检测损伤标志物在皮肤不同部位表达变化规律的可行性，为其他类似指标的定量检测提供了新的理论基础。牛｜ｒ科技土学日许医学眈硅医学蠢删挂啧士冉ｆ耄ｔ牛业论文摹盯Ｉ其五了ｉ

！皇竺竺竺竺墨！竺：竺：竺：！苎墨竺查篁竺室垒壁堡壅！丝苎参考文献１．ＫｎｉｇｈｔＢ．ＦｏｒｅｎｓｉｃＰｏｔｈｏｌｏｇｙ，２ｅｄ．Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ．ＳｙｄｎｅｙＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，ＮｅｗＹｏｒｋ．１９９７：１３３．１６９２ＯｅｈｍｉｃｈｅｎＭ．Ｄ据Ｗｏｕｎｄｈｅａｎｎｇ．ＳｐｒｉｎｇｅｅＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ１９９０：５．５７３．祝家镇．我国损伤时间推断研究＿卜年回顾及展望－中国法医学杂志，１９９５，１０（增刊）；１８—１９４．０ｈｓｈｉｍａＴＦｏｒｅｎｓｉｃｗｏｕｎｄｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉ．Ｉｎｔ．２０００；１１３：１５３．１６４５付小兵，王德文主编．创伤修复基础．北京：人民军医出版社，１９９７，１２１—１６３６．黎鳌主编现代刨伤学．一Ｅ京：人民出版社，１９９６：１４２．１６７７．王慧君，黄光照，武忠弼．细胞网子在皮肤创伤修复中的表达及其与损伤时间的关系中国法医学杂志，１９９９，１４（２）：１１９—１２３８．ＭｃＫａｙＡ，ＬｅｉｇｈＭＥｐｉｄｅｒｍａｌｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎｃｕｔａｎｅｏｕｓｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９９１；１２４（６）：５１３—８９．ＳａｔｏｒＯｈｓｈｉｍａＦＫｕｎｄｏＦＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０ｉｎｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｒｏｕｔｉｎｅｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．ＢｉｏｃｈｅａｎｄＢｉｏｐｈｙＣｏｍｍｕｎ，１９９９；２６５：１９４—１９９１０ＳｃｈｗａｃｈａＭ，ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＣ，ＣｈａｕｄｒｙＨ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｉｓｓｕｅｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅｒｍａｌｉｎｊｕｒｙ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２００２；１７（５）：２６６—７４１１．ＫｎｎｄｏＴＩＯｈｓｈｉｍａ工Ｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｃｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｈｅａｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｏｕｓｅｓｋｉｎｗｏｕｎｄ：ａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｆｏｒｐｏｓｓｉｂｌｅｗｏｕｎｄａｇｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．ＬｅｇａｌＭｅｄ．１９９６；１０８：２３１－２３６１２．贺立文，祝家镇．细胞因子（ＩＬ－６、ＴＮＦ－ｄ）在损伤时间中原位杂交法研究．中国法医学杂志．１９９７；１２（３）：１３３—１３６１３．ＫｏｎｄｏｆＯｈｓｈｉｍａ耳ＥｉｓｅｎｍｅｎｇｅｒｗＩｍｍｕｎｈｉｓｍｃｈｅｍｉｃａｔａｎｄｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｌ平中抖藏上学母竹匝学竞技匝謦ｌ曩９并氰叠士研竟ｔ丰＾论文弟辨页善点，Ｉ

！皇兰型竺竺墨！竺：竺：竺：！苎墨竺查篁竺室垒壁堡壅！丝苎ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｔｅｍｐｏｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ—ｌａｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｗｏｕｎｄｓｆｏｒｆｏｒｅｎｓｉｃｗｏｕｎｄａｇｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．ＬｅｇａｌＭｅｄ．１９９９；１１２：２４９—２５２１４．ＳａｔｏＹ．Ｏｈｓｈｍａ—ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡｂｙｐｒｏｉｎｆｌａｍｍｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｄｕｒｉｎｇｓｋｉｎｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎｍｉｃｅ：ａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｆｏｒｆｏｒｅｎｓｉｃｗｏｕｎｄａｇｅｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ（Ⅱ）．Ｉｎｔ．ＪＬｅｇａｌＭｅｄ．２０００；１１３：１４０—１４５１５．｝慧君，阮海根，黄光照．ＰＤＧＦ－Ｂ，ＰＤＧＦＲ。Ｂ，ＴＧＦ－Ｂｌ，ｂＦＧＦ在创伤愈合过程中的表达变化与损伤时间关系的研究．法医学杂忐．２００１；１７（钔：１９８—２０４１６．＿ｊＦ慧君，李东，杨木兰等．在大鼠皮肤切创愈合过程中ＴＧＦ．Ｂ，基因及蛋白表达变化与损伤时间关系的实验性研究．中国法医学杂志，２０毗，１６。（４）：１９３．１９７１７．ＥｎｇｅｌｈａｒｄｔＥ，ＴｏｋｓｏｙＡ，ＧｏｅｂｅｌｅｒＭ，ｅｔａ１．ＣｈｅｍｏｋｉｎｅｓＩＬ一８，ＧＲＯａｌｐｈａ，ＭＣＰ一１，ＩＰ一１０．ａｎｄＭｉｇａｒｅｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｄｕｒｉｎｇｐｈａｓｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎｈｕｍａｎｗｏｕｎｄｈｅａｔｉｎｇ．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ１９９８；１５３（６）：１８４９—６０ｌ８ＢｅｔｚＰ－ＥｉｓｅｎｍｅｎｇｅｒＷＭｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅｍｏｓｉｄｅｒｉｎｄｅｐｏｓｉｔｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｗｏｕｎｄａｇｅ．ＩｎｔＪＬｅｇａｌＭｅｄ１９９６；１０８：２６２－２６４．１９．ＢｅｔｚＰ＇ＮｅｒｌｉｃｈＡ，ＷｉｌｓｋｅＪ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｗｏｕｎｄｓｏｆｖａｒｉｏｕｓａｇｅｓｂｙａｎｉｎｓｉｔｕｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇｏｆｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＩｎｔＪＬｅｇａｌＭｅｄ１９９７；１１０：２４０－２４３２０．ＨａｕｓｍａｎｎＲ，ＮｅｒｌｉｃｈＡ，ＢｅｔｚＥＴｈｅｔｉｍｅ—ｒｅｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ５３ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｗｏｕｎｄｓａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｅｈｅｍｉｅａｌａｎａｌｙｓｉｓ．ＩｎｔＪＬｅｇａｌＭｅｄ１９９８；１１１：１６９—１７２２１．ＳｔａｖｉｎＪ．ＪＰａｔｈ０１．１９９６；１７８：５－１０２２ＭｕｓｔｏｅＴＡ．ＷｏｕｎｄＲｅｐＲｅｇｅｎ，１９９４；２：２７７—２８３２３．ＰｉｅｒｃｅＧＥＡｍＪＰａｔｈｏｌ，１９９２；１４０：１３７５－１３８８２４．ＭｏｏｒｅＫＷ：ＧａｒｒａＡ，ＭａｌｅｆｙｔＲＷ，ｅｔａ１．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１９９３，１１：１６５—１９０２５．ＦｉｏｒｅｎｔｉｎｏＤＲＺｌｏｔｎｉｋＡ，ＭｏｓｍａｎｎＴＲ，ｅｔａ１．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９１；１４７：３８１５—３８２２２６．ＳａｔｏｒＯｈｓｈｉｍａ￡ＫｏｎｄｏＺＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ｉｎｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｍｕｒｌｎｅｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．ＢｉｏｃｈｅｍａｎｄＢｉｏｐｈｙｓＣｏｍｍｕｎ，１９９９；２６５：１９４—１９９２７．ＶａｒｉｅｓＪＥ．１ｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅａｎｄａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ１Ｌ－１０．Ｔｒｅｎｄｓｉｎ牛中科杖土学国湃正学眈磕正季泰日盘钟■硬士Ｊ叶竟生平主静文摹卯重共留ｉ

《皮联创怫修复干口』＋ｔｏ、口ｚ一卓时耳性童迷曲实簟啦研究》张蔗ｍｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５；２７：５３７２８．ＫｕｃｕｋｃｅｌｅｂｉＡ，ＨａｒｒｉｅｓＲＨＣ，ＨｅｎｎｅｓｓｅｙＰＪ，ｅｔａ１．Ｉｎｖｉｖｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｆｌｅｕｋｉｎ一４ａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｇｅｎｔ．ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒＲｅｇｅｎ，１９９５，３：４９—５８２９Ｓａｌｍｏｎ－Ｈｅｒｖ＇ＲａｍｏｎｔＬＧｏｄｅａｕＧｅｔａ１．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ｉｎｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，２０００，８０（８）：１３３７—４３３０．ＴｒａｕｔｍａｎｎＡ，ＴｏｋｓｏｙＡ，ＥｎｇｅｔｈａｒｄｔＥ，ｅｔａｌＪＰａｔｈ０１．２０００；１９０（１）：１００－６３０．ＯｈｓｈｉｍａＴＳａｔｏＹＴｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０ｍＲＮＡｄｕｒｉｎｇ【ｈｅｅａｒｌｙｐｈａｓｅｏｆｓｋｉｎｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｓａｐｏｓｓｉｂｌｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｗｏｕｎｄｖｉｔａｌｉｔｙ．ＩｎｔＪＬｅｇａｌＭｅｄｌ１１（１９９８）２５１－２５５华卞科技支学甩婿正学电挂ｄｔ，ｔ量脚蕾曩士一览生牛土论文弟舅直共嚣直

附照及说明照片１：小鼠皮肤毛囊周围开始ｍ现少量的粒细胞。牛前伤３小时组，１｛Ｆ×４００。照片２：刘伤局部皮下组织内有大量渗出的中性粒细胞，开始出现少数巨噬细胞浸润。生前伤１２小时组，ｔｔＥ×４００照片３：以渗出中性粒细胞为主要成分的肉芽组织开始向创口长入，近创缘表皮及毛囊ｌ：皮开始增生。生前伤２４小时组，ＨＥ×２００。照片４：创口局部肉芽组织增多，其内的中性粒细胞减少，巨噬细胞及成纤维细胞显著增多。生前伤７２小时组，ＨＥ×２００。弟３２ｌ共鲐直．ｑ－干科技土学同济医学院醢区季盎删氲硕士研览生牛生论文

照片５：４圈局部放大，示肉芽组织主要成分为炎性细胞、成纤维细胞及新牛毛细血管。生前伤７２小时组，ＨＥ×４００。照片６：创Ｌｌ已被肉芽组织填平，肉芽组织内炎症细胞明显减少，幸要由大量成纤维细胞及纤维细胞构成，新生毛细血管壁增厚甚至闭合。生前伤１２０小时组，¨Ｅ×２００。照片７：６图局部放大。生前伤１２０小时组，ＨＥＸ４０（）。照片８：表皮细胞胞浆呈弱刚性着色；毛囊皮脂腺、部分毛囊｝：皮也可见１Ｌ．１０免疫反应警弱阳性。正常对照组，ＩＬ一１０×４００。牛卞科技土学同许医学院娃正学泰删饭嚏士舛竟生牛土论文弟嚣直善嚣ｌ

照片９：创口处渗出物呈阳性反应，近创缘处表皮细胞阳性反应稍增强。生前伤０５小时组，ＩＬ－ＩＯ×２００。照片ｌｏ：近创缘处表皮细胞胞浆免疫染色程度加深。生前伤１小时组，ＩＬ—ｌＯ×４００。照片ｌｌ：近创缘处表皮细胞阳性反应明显增强，其胞浆内布满棕黄色颗粒。生前伤３小时组，ＩＬ一１０×４００。照片１２：部分毛囊上皮阳性反应增强。生前伤２４小时组，ＩＬ一１０Ｘ４００。华中竹杖太学同济匹学院ｉｉ正学豪删板礓士矸览生毕生倍文摹尉重共留ｉ

照片１３：创缘处新生的表皮层较厚．部分新牛细胞基阳性反应。生前伤４８小时组，』Ｌ一１０×４００。照片１４：创口肉芽组织、真皮及皮下组织内有大量的阳性细胞。生前伤７２小时组，ＩＬ１０×２００。照片１５：１１图局部放大，示刨口皮Ｆ组织内巨噬细胞、部分成纤维细胞及淋巴细胞晕阳性染色。生前伤７２小时组，１１．一１０×４００。照片１６：创伤局部表皮层及真皮层兀阳性表达，表皮层表面有假阳性反应。死后伤６小时组，ＩＬ一１０×４００。华中科技土学阍沸医学院社正学蠢删氟＿璜士ｊ叶妻ｔ年主语文弟３５ｉ善嚣１

照片１７：正常小鼠皮肤，ＩＬ。４只在部分皮脂腺呈弱阳性，其余部位阴性表达。正常对照组．Ｉｌ，＿４ｘ照片１８：创口局部肉芽组织内阳性反应增强。生前伤４８小时组，ＩＬ－４×２００。４００照片１９：肉芽组织内邦分成纤维细胞晕阳性着色。生前伤４８小时组，ＩＬ一４ｘ４００。照片２０：创伤局部肉芽组织周边阳性反应明显增强，阳性细胞主要以成纤维细胞为主，也可见部分淋巴细胞阳性着色。生前伤９６小时组，ＩＬ４×２００。华中科杖土摩同许正学院法区学蠹肋，板珏士Ｊ叶览生毕生论文苇３６ｌ甚留１

照片２ｌ：成纤维细胞阳性反应增强，电可见部分淋巴细胞阳性着色。牛前伤９６小时组，ＩＬ一４×４００。照片２２：创缘肉芽组织的纤维化，ＩＬ＿４阳性表达水平降低。生前伤１２０小时。ＩＬ，４×２００。华中科技太学同许正学院法正学蠢删饭埙士研览ｔ年业语文弟昴ｉ＊嚣直

损伤修复中的细胞因子与损伤时间推断张慧综述秦启生昊焕明审校损伤时间的推断是指根据损伤形态或其他检测方法推测损伤形成的时间。生活反应不仅是区分生前伤和死后伤的依据，同时各种生活反应的出现均有一定的时间规律可循，藉此可以推断损伤时间。机械性损伤后的创伤愈合是一种肯定的生活反应，从损伤修复进程可推断伤后经过时间。资料表明，组织修复是从血小板脱颗粒开始的，以自限性的炎症浸润为特征，包括炎症介质和细胞因子等多肽物质促进的一系列细胞连锁反应，其中细胞因子在损伤修复过程起着举足轻重的作用，而且不同修复时程各细胞因子的表达变化规律也不同。这为损伤时间推断提供了理论依据。本文现将细胞因子在损伤修复中的一般作用、时序性表达与损伤时间的关系以及损伤时间研究前景等进行综述如下：１．细胞因子在损伤修复中的一般作用及其作用机制法医学界研究较多的是脑损伤及皮肤软组织损伤的损伤时间推断。创伤性脑损伤及皮肤损伤可触发各种核转录基因的激活，然后调控相关基因（如即刻早期基因、热休克蛋白基因、多种细胞因子基因）的表达升高，引起一系列病理生理变化【”。不同类型的损伤引起机体的修复活动大致相似，主要经历三个阶段：损伤后应激和局部炎症、细胞增殖和组织填充以及组织改建和塑形。创伤性炎症是创伤愈合过程的首要环节，其基本要素包括血液凝固和纤维蛋白溶解、免疫应答及复杂的血管和细胞反应；参与这一病理生理过程的细胞和介质成分既对清除损伤组牛＇ｒ斜姣土学帕｛Ｉ卜正学托磕区学Ｉ＿蹦截嘎士碍竟生牛土格文摹，矿直杀五亨直

张墓织和外来物，防止感染起重要作用，同时又激发与控制组织修复和再生。然而炎症反应过激却可导致局部组织的过度损害，反而影响创伤愈合。因此机体对损伤修复过程具有严密的调控机制，以保障损伤组织ｉｌｉＯＮ愈合。目前大量研究表明，损伤修复中机体全身及损伤局部可以产生多种细胞因子，这些细胞因子对炎细胞和修复细胞的生长、分化及功能活动有明显作用，在损伤后调控机体防御反应、炎症反应，以及愈合过程中发挥着关键作用【”。细胞因子是机体受内外环境变化刺激后产生的一大类具有广泛生物学功能的细胞调节蛋白。细胞因子的作用具有多样性的同时，还可通过相互诱导和交互调节，产生协同、相加或拮抗作用，影响细胞功能活动形成一个网络系统。根据细胞因子在宿主防御反应中的功能不同，可将其分为两类：促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子。前肯主要有，ｒＮＦ＿ａ、ＩＬｌ、ＩＬ一６和ＩＬ一８等，后者主要有ＩＬ一４、ＩＬ－１０、ＩＬ一１３、ＴＧＦ一１３、ＩＬ—ｉｒａ和ｓＴＮＦＲ等。促／抗炎症细胞因子通过各自不同的生物学活性和作用机制，参与损伤修复过程。促炎症细胞因子可以促进ＮＯ、花生四烯酸代谢产物、缓激肽和组织胺等血管活性物质的产生，激活补体、中性粒细胞和内皮细胞，同时它们还可以相互作用形成许多正反馈环，导致所谓的“炎症级联反应”发生【３１：并对组织修复细胞有趋化、激活、增生等作用。在正常的创伤修复中这些反应的结果是：通过炎症反应溶解和清除坏死组织和渗出物，加速修复细胞进入损伤局部并发挥其活性进行创伤修复。炎症细胞因子的体内平衡是通过天然的细胞因子抑制剂和抑制性细胞因子的作用而维持的，这两类促炎症细胞因子的抑制剂均属于抗炎症细胞因子的范畴。抗炎症细胞因子可抑制促炎症细胞因子的产生【４、５】，年中科拽太学舟坼匝季光法‘学Ｉ删藏覆士研竟生丰业论文摹钾ｉ善嚣Ｉ

咪缱张墓还可以影响单核细胞的功能，降低其抗原递呈的能力：同时有些抗炎症细胞因子还可抑制Ｔ细胞增殖【６”，促进Ｂ细胞的增殖分化。这些反应的结果是广泛的免疫调节作用，对于创伤愈合具有不可忽视的意义。另外有研究己证明，有些抗炎症细胞因子如ＩＬ一４还具有激活结缔组织细胞、促进细胞外基质沉积的作用，可促进创伤愈合【８】。２．创伤修复过程细胞因子时序性表达与损伤时间的关系在伤口修复中能发挥作用的细胞因子有多种，它们在损伤修复的不同环节中起作用，每一种细胞因子的作用依细胞因子所处的具体微环境和创伤愈合时期不同而表现各异，因此不同修复时程各细胞因子的表达变化规律也不同。大量研究证实，创伤局部的细胞因子在创伤修复过程中表达多有定变化，不同细胞因子表达的时序和峰值也各不相同。由于这种动态变化规律与损伤时间相关，因而可考虑作为推断损伤时间的参数。目前认为在损伤修复中发挥重要作用的细胞因子主要有以下几种。２．１肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）ＴＮＦ是种单核细胞因子，主要来源于巨噬细胞、Ｂ细胞等。在创伤修复中它对早期炎症渗出、炎细胞的迁移、趋化及活化起重要作用。ＴＮＦ还可诱导内皮细胞及纤维母细胞产生粘附分子，刺激成纤维细胞及表皮细胞增殖分化，调节胶原和胶原酶的合成。在活体实验中发现，ＴＮＦ还能促进新生血管形成１９１，在创伤修复阶段发挥较大作用。ＴＮＦ是一种与组织损伤相关的病理性介质，在各种损伤局部其表达均有一定的改变。通过检测大鼠切断坐骨神经造成的神经损伤时ＩＩＡ、ＩＬ厂６及ＴＮＦ的表达变化，发现正常大鼠背部神经未见这些细胞因牛卞科技上学日婿‘学兜敞正学蠢槲ｔ硬士Ｊ开竟生丰囊论文摹街ｉ鼻嚣重

子的表达，而损伤后１天可见明显的表达【１０】。Ｆａｎ等应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ斑点杂交检测大鼠液压脑损伤模型发现伤后ｌｈ，在伤侧皮层及同侧海马有非常显著的ＴＮＦ．ａｍＲＮＡ表达，持续到伤后６ｈ；在对侧相应部位也可检测到其表达，至伤２４ｈ后下降…。另外，Ｔ．Ｋｏｎｄｏ等研究结果表明ＴＮＦ—ａ及ＩＬｌ等在大鼠皮肤损伤后极短时间内即可发现其表达增加，ＴＮＦ—ａ、ＩＬ厂１Ｂ在伤后３ｈ达峰值，而ＩＬ＿１Ⅱ、ＩＬ６分别在６ｈ及１２ｈ达峰值，随着创口内肉芽组织的出现使这些细胞因子的水平于伤后７２ｈ再次升高【１２】。作为参与创伤修复的前炎症细胞因子，ＴＮＦ．ａ已被用于法医损伤时间推断的研究【１２．１６】。Ｇｒｅｌｌｎｅｒ等利用ＥＬＩＳＡ等方法对人创伤手术标本及尸检材料中的等前炎症细胞因子进行定量研究，探讨了其表达规律与损伤时间的关系，指出ＴＮＦ—ａ在ＩＥ常人类皮肤组织表达较低，在手术标本中ＴＮＦ．ａ含量明显高于Ｊ＿Ｆ常水平，但不随损伤时间的延长而增高，然在存活时间较短的尸检标本中ＴＮＦ—ａ表达可在伤后最初几小时内持续升高【”１。提示ＴＮＦ．ａ可作为一个早期“标志物”用于损伤时间推断。２．２白细胞介素一ｌ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉＩＩ－１，ＩＬ一１）ＩＬ一１是一组由ｎ、Ｂ两条链组成激素样肽类物质，主要来源于单核巨噬细胞。机体遭受损伤后，巨噬细胞通过合成和分泌体液递质来完成它对特异性免疫的影响，这主要靠ＩＬ一１介导。损伤对增加的ＩＬ一１还可加强ＮＫ细胞的细胞毒活性，在创伤的炎症反应中发挥有利作用。另外，ＩＬ一１还能刺激成纤维细胞增殖、胶原酶及透明质酸酶的合成，从而促进创伤修复。ＩＬ一１可以介导脑创伤后的许多病理生理反应，如白细胞聚集、血管内皮渗透性增加等，从而与脑水肿的形成及颅内压的增高密切相关。在牛Ｉｒ科杖大学同湃正量先法正学ｔａ蝌－嚏士竹竞ｔ牛土静文摹硝直善嚣ｉ

靠逑张墓人体及动物实验中都发现创伤后其脑组织、脑脊液中ＩＬｌＢ水平的增高【１７１。另外，目前认为脑刨伤后的神经细胞损害多由于伤后继发性炎性反应所致。Ｆａｎ等【１８１９嗵过研究不同脑创伤模型伤后ＩＬ－１的表达变化规律，揭示了ＩＬ－１在不同病理损伤机制中具有不同表达过程。有研究表明【１４“】，在人体手术创口组织中ＩＬ一１Ｂ含量与创口年龄呈线性相关，损伤时间小ｙ－０．５ｈ时其含量明显下降，但损伤时间２ｈ后则成上升趋势；在刺或切创伤尸检材料中，存活时间少于５ｍｉｎ时ＩＬ１Ｂ等前炎症细胞因子含量是著增高，通过计量分析得出当ＩＬ－１ｎ阳性率大于３０％时可以断定损伤时间为２４ｈ或少于２４ｈ。２．３白细胞介素一６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ－６）Ｉｈ－６是诱导急性期蛋白的主要细胞因子，主要由淋巴类细胞，如Ｔ细胞、单核巨噬细胞及小胶质细胞等，以及非淋巴细胞，如成纤维细胞和内皮细胞等产生。在创伤机体防御反应中，ＩＬ一６主要能使中性粒细胞致敏并释放一些毒性物质等；同时通过延迟中性粒细胞凋亡，以及上调ＩＣＡＭ—ｌ的表达，促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，利于其介导组织损伤。ＩＬ一６还可诱导Ｂ淋巴细胞增殖分化等，增加机体免疫力，有助于创伤修复顺利完成。脑创伤后中枢神经系统及外周血中均发现有ＩＬ一６水平的增高，Ｔａｕｐｉｎ等【捌发现，在液压脑损伤模型中，伤后ＩＬ６水平在伤侧大脑皮层反应性地快速增加，并于伤后８ｈ达到高峰，１８ｈ后开始下降。Ｋｏｎｄｏ在对大鼠皮肤创伤的研究也报道过创伤后ＩＬ－６的表达变化１１２】。近年来，法医界已尝试着将ＩＬ－６应用于损伤时间推断，在尸检材料中ＩＬ－６伤后短时间内即明显升高，并持续至伤后２４ｈ，较ＴＮＦ－ａ及ＩＬ一１Ｂ表达时间长【…。牛＿ｒ科姣土学帕湃匹学眈娃正学ｌ删蕾曩士舛竟生牛生论文摹裙直善嚣重

２．４相关趋化因子单核细胞趋化因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＣＰ～１）、巨噬细胞炎症因子ｌａ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｌａ，ＭＩＰｌａ）、ｌＬ８是由ＴＮＦａ和ＩＬ１刺激后产生的另一类参与炎症反应的细胞因子。ＩＬ一８是４种强力中性粒细胞趋化和活化介质，ＭＣＰ一１、ＭＩＰ—ｌａ则主要是单核细胞的趋化因子。在创伤炎症过程中，它们可诱生血小板激活因子，引起中性粒细胞产生Ｈ２０。，增强中性粒细胞的粘附作用，从而促进内皮细胞单层的破坏，吸引炎细胞进入创伤局部。此外，还能刺激巨噬细胞和肥大细胞释放有关的酶和组胺，引起局部组织损伤。Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等研究发现，人皮肤创伤２４ｈ后，ＩＬ广８在创底浅表部位表达量达最高，其表达的时序性和空间分布与中性粒细胞浸润有关，且ＩＬ＿８的表达又与角质细胞的迁移、分化相关；巨噬细胞浸润在创伤厉４８ｈ达高峰，这与创口边缘增生表皮的基底层细胞和创伤局部单个核细胞表达ＭＣＰ—ｌｍＲＮＡ的水平相一致【２ｌ】。根据趋化因子在创伤修复过程中的表达时序性，Ｋｏｎｄｏ．Ｔ等法医工作者应用免疫组化方法检测人皮肤创伤后ＩＬ－８、ＭＣＰ．１及Ｍ球一１ａ的表达，他们观察到刨伤年龄为４－１２ｈ时，主要是中性粒细胞呈现阳性着色，随着创口年龄的增加巨噬细胞及成纤维细胞出现阳性表达，定量分析结果表明ＩＬ－８阳性率大于５０％、ＭＣＰ．１大于３０％及ＭＩＰ—ｌａ大于４０％时可提示创口年龄至少为２４ｈ［２２１。２．５转化生长因子Ｂ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＴＧＦ一６）ＴＧＦ—Ｄ是一类多功能聚合肽家族，人类ＴＧＦ－Ｂ分为三类：ＴＧＦ—Ｂ１、ＴＧＦ一６２、ＴＧＦ一０３。在机体内ＴＧＦ—Ｂ能刺激或抑制多种细胞的繁殖，是影响组织创伤后细胞外基质积聚过程中的主导介质，还能抑制急性期炎症反应。ＴＧＦ—Ｂ诱导ＩＬ—ｌＤ和ｔＬ一１ＲａｍＲＮＡ的表达呈动态变化，在华●科技土学同湃区学竞肚正昔蠢期ｒ蕾曩士舛竟ｔ牛主格文摹移直鼻嚣重

侏建张墓炎症开始４ｈ内，ＴＧＦ一１３快速诱导Ｔ【｜一１０是启动炎症反应，而后来ＩＬ一１Ｒａ的合成和分泌又起到了抗炎症作用。创伤后ＴＧＦ一１３水平显著改变，王慧君等通过免疫组化、原位杂交及免疫印迹技术对生长因子在创伤后时序性表达做了一系列研究表明，在生前伤中ＴＧＦ．Ｂ１、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ等生长因子蛋白的表达于损伤后０．５ｈ即丌始增强，其中以２４～９６ｈ反应最明显，而死后损伤组上述因ｆ仅在０．５～３ｈ以内微弱表达【２３】，而ｍＲＮＡ的表达时序与蛋白的表达有一定的差异，并指出ＴＧＦ—Ｂｌ／Ｂ２／Ｂ３在修复过程中的不同变化规律反映了与损伤时间的关系，可作为精确推断损伤时间的分子生物学标志【２４］。２．６白细胞介素～１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０，ＩＬ一１０）【Ｌ—ｌＯ又称细胞因子合成抑制因子，主要由单核／巨噬细胞、Ｔｈ２细胞、肥大细胞、角质形成细胞及小胶质细胞等产生。ＩＬ—ｌＯ对致炎性因子的抑制作用主要是：下调ＩＬ一１、Ｉｔ．一６、ＩＬ一８、ＴＮＦ一Ⅱ等细胞因子及单核／巨噬细胞上ＮＩＣＩＩ类分子的表达；还可加强脂多糖对单核细胞产生Ｉ【，一ｉＲａ的刺激作用，抑制了脂多糖刺激的人类巨噬细胞的金属蛋白酶的产生，同时又刺激组织中金属蛋白酶一１抑制剂的产生【矧。因此，ＩＩ，一１０通过抑制致炎性细胞因子的产生以及刺激特异性抑制剂的产生而发挥抑制作用。同时，ＩＬ一１０能促进Ｂ细胞增生和分泌免疫球蛋白使体液免疫功能增强，起到免疫刺激作用。ＩＬ—ｌＯ这种双向作用在机体创伤修复中起着重要的调节作用。有研究表明，在小鼠皮肤创口修复过程中，创口局部ＩＬ一１０ｍＲＮＡ伤后１５ｍｉｎ迅速升高，１ｈ达高峰，这种时间依赖性表达在死后５ｄ内的创伤组织中仍可被检测到‘捌。ＳａｔｏＹ等采用ＥＬＩＳＡ技术定量检测小鼠皮华中科鞋支学同许医学虎敞正学ｌ葺呀氯嘎士竹竟生牛业静文ｊＩ榉重喜．ｑ８直

缘建张墓肤创伤愈合中ＩＬ一１０的表达变化，结果碌示创伤局部组织ＩＬｌＯ蛋白水平与损伤修复进程相关联，并通过原位杂交及免疫组化证明了，创伤后上皮细胞及渗出的单个核细胞是ＩＬ－１０的主要来源【２７】。ＩＬ－ＩＯ作为＋种重要的抗炎症细胞因子，主要抑制单核巨噬细胞的功能，而巨噬细胞作为创伤修复的“指导者”在创伤修复过程中处于中心环节，有必要进～步深入研究ＩＬ一１０与巨噬细胞在创伤中的相关表达。２．７自细胞介素一４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一４，ＩＬ４）ＩＬ一４主要由Ｔｈ２细胞、肥大细胞及嗜碱粒细胞等产生。它是一种多功能炎性介质，叮以影响多种细胞的增生、分化及激活，抑制单核细胞致炎性反应，并且下调单核细胞ｌＬ—ｌ、ＴＮＦａ、ＩＬ一８、ＩＬ一１２的产生，已证明ＩＬ一４抑制巨噬细胞内金属基质蛋白酶的合成【２５】，因此ＩＬ一４的功能主要表现在对单核／巨噬细胞的抑制。除以上免疫调节作用外，儿一４还能够激活结缔组织细胞、刺激细胞外基质的沉积，在创伤愈合中发挥重要作用。在Ｓａｌｍｏｎ—Ｈｅｒ对小鼠皮肤创伤研究中报道，创伤局部ＩＬ－４最早在伤后１ｄ出现，２，－－４ｄ达最高水平，然后逐渐下降，至２１ｄ创口愈合时才完全消失［８】，提示ＩＬ４参与了创伤修复的全过程。其表达的时序性可作为损伤时间推断的一个参考。目前有关ＩＬ＿４在创伤修复的研究不多，许多机理尚不清楚有待进一步研究。２．８其他参与创伤修复的细胞因子研究发现ＩＬ一２、ＩＬ—ｌＲａ、ＧＭ—ＣＳＦ及ｓＴＮＦａＲ等在创伤后急性炎症期表达量有所增加，也参与了创伤性炎症反应。它们在创伤局部的表达变化可以通过多种方法检测到，在一定程度上能反映创口年龄。如王慧华中科技土学同许重学克敞正学Ｉ蜊权嘎士研览生牛＾格文摹带重善ｊ葶Ｉ

竺兰熊皇一君等［２８１利用Ｅ１．ｒｓＡ对皮肤创伤后创伤局部组织ＩＬ一２进行定量研究发现，ＩＬ一２的表达不仅在伤后立即上调，而且持续出现在修复的整个过程，在总体趋势上ＩＬ一２与ＴＧＦ等研究结果一致，但ＩＬ一２除在损伤初期因出血而致的一过性升高外，其反弹性升高在２４ｈ才出现，４８ｈ后表达再次回落，直至７２ｈ后持续升高并维持在较高水平，为损伤时间推断提供新的依据。３．损伤时间研究进展及细胞因子推断损伤时间的展望传统法医学推断损伤时问主要是根据伤后不同时间所表现的生活反应及修复过程的肉眼及组织形态变化【２９＿３０ｌ。随着医学及生物科学技术的发展，继Ｒａｅｋａｌｌｉｏ应用酶组织化学技术检测创伤部位酶的活性之后，许多新的“标志物”和检测技术被应用于损伤时间推断的研究。如应用免疫组化法、荧光分光光度计法、高压液相色谱法、透视电镜和ＲＴ—ＰＣＲ等多种方法观察出血及凝血时纤维蛋白网的变化、创缘组织中炎症介质及酶蛋白或ｍＲＮＡ等含量变化以及损伤组织中细胞外基质成分的变化等ｍ”１，使得损伤时间推断更加精确。此外，细胞凋亡逐渐成为创伤愈合过程中的研究焦点，原位ＴＵＮＥＬ技术和Ｐ５３产物检测亦被应用于创伤时间推断【３３３４１。随着细胞因子在损伤修复中的作用成为人们关注的热点，许多国内外法医人对皮肤创伤愈合过程细胞因子动力学进行研究。目前，一些细胞因子己经被应用于法医病理学检案的人体组织中进行研究［１５２１’２２，３５１，证实了动物实验相关指标的可行性。Ｏｈｓｉｍａ研究证明Ｈ。一１０ｍＲＮＡ的表达在死后５天内仍可以应用ＲＴ—ＰＣＲ检测到【硐，利用这一特性已有Ｚ．ｘ４仓，Ｊ伤动物模型进行ＲＴ—ＰＣＲ的定量研究【１６１，以期为推断法医检案人体材料的损伤时间打下基础。另外，细胞因子经典的定量华ｌｒ科杖土学同济正学院法区学蠢删颤真士一竟生牛赢论文摹存重鼻船重

傣逑张暮检测技术一一酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）目前也被应用于测定损伤后细胞因子变化的时量关系【”～７１，以寻找更客观精确的推断损伤时间的“标志物”。目前针对促炎症细胞因子的研究较多，而抗炎症细胞因子的研究尚有待于进一步深入。还需指出，细胞因子在创伤局部的表达受很多因素的影响，如创伤的性质、创伤的程度及个体差异等，兄其法医病理学检案的人体材料受到外界的影响更多，这些因素均会影响到细胞因子用于损伤时间推断的精确性。因此，在以后的研究中要继续寻找更稳定可行的指标及检测方法，以便用于实际检案工作。年中科技太学同湃医学眈挂瞳学毫部喇簟嚷士研竟ｔ牛＿Ｉ静文摹疗ｉ共ｊ亨直

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缘逑张墓ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ，１９９５；１５（７）：５１３０１１·ＦａｎｋＹｏｕｎｇＰＲ，ＢａｒｏｎｅＦＣ，ｅｔａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－ａｍＲＮＡｉｎｔｈｅＣＮＳ［Ｊ］ＭｏｌＢｒａｉｎＲｅｓ１９９６；３６（２）：２８７１２．Ｋｏｎｄｏ工ＯｈｓｈｉｍａＴＴｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｃｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｈｅａｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｏｕｓｅｓｋｉｎｗｏｕｎｄ：ａｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｆｏｒｐｏｓｓｉｂｌｅｗｏｕｎｄａｇｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｉｎｔ．Ｊ．ＬｅｇａｌＭｅｄ，１９９６；１０８：２３１．２３６１３．贺立文，祝家镇．细胞冈子（ＩＬ．６、ＴＮＦ．Ⅱ）在损伤时间中原位杂交法研究［Ｊ］．中国法医学杂志１９９７；１２（３）：１３３．１３６１４ＧｒｅｌｌｎｅｒＷ：ＧｅｏｒｇＴ，ＷｉｌｓｋｅＪ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓ（ＩＬ．１ｂｅｔａ，ＩＬ－６，’ＦＮＦ－ａｌｐｈａ）ｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｗｏｕｎｄｓ［Ｊ］．ＦｏｒｅｎＳｃｉＩｎｔ，２０００；１１３（１－３）：２５１—６４１５．ＫｏｎｄｏｆＯｈｓｈｉｍａｆＥｉｓｅｎｍｅｎｇｅｒｗＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｔｅｍｐｏｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ａｌｐｈａ（ＩＬ－ｌａｌｐｈａ、ｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎｗｏｕｎｄｓｆｏｒｆｏｒｅｎｓｉｃｗｏｕｎｄａｇｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＩｎｔＪＬｅｇａｌＭｅｄ，１９９９；１１２（４）：２４９－５２１６．ＳａｔｏＹ－ＯｈｓｈｍａＴ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡｂｙｐｒｏｉｎｆｌａｍｍｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｄｕｒｉｎｇｓｋｉｎｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎｍｉｃｅ：ａｐｆｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｆｏｒｆｏｒｅｎｓｉｃｗｏｕｎｄａｇｅｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ（１１）［』］山ｔ．ＪＬｅｇａｌＭｅｄ，２０００；１１３：１４０—１４５１７．Ｔｒａｕｐｉｎｖ’ＴｏｕｌｍｏｎｄＳ，ＳｅｒｆａｎｏＡ，ｅｔａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎ１Ｌ－６，ＩＬ－１ａｎｄＴＮＦｌｅｖｅｌｓｉｎｒａｔｂｒａｉｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｕｍａｔｉｃｌｅｓｉｏｎ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｐｒｅ－ａｎｄｐｏｓｔ·ｔｒａｕｍａｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＲ０５４８６４．ａｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ－ｔｙｐｅ（ｐｓｉｔｅ）ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，４２（１）：１７７１８．ＦａｎｋＹｏｕｎｇＰＲ，ＢａｒｏｎｅＦＣ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｄｅｕｋｉｎ－１ＢＭｍａｉｎｔｈｅｒａｔｂａｉｎ［Ｊ］．ＭｏｌＢｒａｉｎＲｅｓ，１９９５；３０：１２５牛ｌｒ斜杖太．孽日崎区．簟托Ｉｔ正学蠢目Ａ帮截爰士舛竟ｔ丰＾静文摹钾Ｉ喜嚣直